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.2017年5月；39(5):1242-1254.
doi:10.3892/ijmm.2017.2938。 Epub 2017年3月28日。

晚期糖基化终产物通过上调BAG3促进原代大鼠血管平滑肌细胞的增殖和迁移

李存书 1, 叶昌 1, 袁丽（音） 1, 陈爽（音译） 1, 陈银涛 1, 宁烨 1, 冬雪代 1, 孙应贤 1
附属公司

晚期糖基化终产物通过上调BAG3促进原代大鼠血管平滑肌细胞的增殖和迁移

李存书等人。 国际分子医学杂志. 2017年5月.

摘要

本研究旨在研究活性氧物种（ROS）在晚期糖基化终产物（AGE）诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和迁移中的作用，以及Bcl-2‑相关athanogene 3（BAG3）是否参与该过程。提取原代大鼠VSMC并进行体外培养。MTT法检测细胞活力，EdU掺入法检测细胞增殖。通过伤口愈合和Transwell分析检测细胞迁移。用qPCR和western blot分析检测BAG3。采用转录和翻译抑制剂（分别为放线菌素D和环己酰亚胺）研究AGEs对VSMC中BAG3表达的影响。将含有针对大鼠BAG3或对照shRNA的短发夹RNA（shRNA）的慢病毒质粒转导至VSMC。2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色检测细胞ROS。四甲基罗丹明甲酯（TMRE）染色检测线粒体膜电位。AGEs以剂量和时间依赖性的方式显著增加BAG3的表达。此外，AGEs主要通过增加RNA合成而不是抑制RNA翻译来增加BAG3 mRNA的表达。BAG3敲除降低AGEs诱导的VSMC增殖和迁移。BAG3基因敲除降低了ROS的生成，并维持了VSMC的线粒体膜电位。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种有效的抗氧化剂，可减少ROS的生成，也可减少VSMC的增殖和迁移。总的来说，本研究首次证明AGEs可以通过上调BAG3的表达来增加ROS的生成并促进VSMC的增殖和迁移。本研究表明，BAG3应被视为预防和/或治疗糖尿病血管并发症的潜在靶点。

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图1
图1
晚期糖基化终产物（AGEs）增加培养的原代大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）中Bcl-2-相关athanogene 3（BAG3）的表达。用不同浓度的AGEs（25、50、100和200）处理细胞µg/ml）和BSA（2.5、5、10和20µg/ml）。分别用（A）RT-PCR和（B）western blotting检测BAG3的mRNA和蛋白表达水平。（C） 放线菌素D（10µg/ml），转录抑制剂和环己酰亚胺（CHX）（20µ采用翻译抑制剂g/ml）研究AGEs对BAG3 mRNA表达的影响。（D） 使用Click-iT新生RNA捕获试剂盒标记和分离新合成的RNA。（E）细胞与10µg/ml放线菌素D和100µg/ml AGEs或10µ分别在0、1、2、4、8和24 h内以g/ml牛血清白蛋白（BSA）处理，然后用RT-PCR检测BAG3的mRNA表达。实验重复三次，结果可重复。*与对照组相比p<0.05。
图2
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Bcl-2相关athanogene 3（BAG3）对原代大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的影响。（A） 我们生成了含有针对BAG3（shBAG3）的shRNAs的慢病毒载体，以敲低VSMC中BAG3的表达。分别用（B）RT-PCR和（C）western blotting检测BAG3的mRNA和蛋白表达水平。*与对照组相比p<0.05。（D） 通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）测定细胞活力。通过（E）EdU染色测定细胞增殖，（F）EdU掺入量计算为EdU+细胞/总细胞，通过ImageJ量化。实验重复三次，结果可重复。*与对照组相比p<0.05。
图2
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Bcl-2相关athanogene 3（BAG3）对原代大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的影响。（A） 我们生成了含有针对BAG3（shBAG3）的shRNAs的慢病毒载体，以敲低VSMC中BAG3的表达。分别用（B）RT-PCR和（C）western blotting检测BAG3的mRNA和蛋白表达水平。*与对照组相比p<0.05。（D） 通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）测定细胞活力。通过（E）EdU染色测定细胞增殖，（F）EdU掺入量计算为EdU+细胞/总细胞，通过ImageJ量化。实验重复三次，结果可重复。*与对照组相比p<0.05。
图3
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晚期糖基化终产物（AGEs）通过Bcl-2-相关的athanogene 3（BAG3）促进原代大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖。转染shRNAs抗BAG3（shBAG3）的VSMC用100µg/ml AGEs或10µ（A）通过MTT法测定细胞活力。（B） 通过EdU染色测定细胞增殖，EdU掺入量计算为EdU+细胞/总细胞，通过ImageJ量化。实验重复三次，结果可重复。*与对照组比较p<0.05；#与craft+AGEs组相比，p<0.05。
图4
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高级糖基化终产物（AGEs）通过Bcl-2-相关无核基因3（BAG3）促进大鼠原代血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移。用100µg/ml AGEs或10µ（A）通过伤口愈合试验和（B）Transwell试验检测细胞迁移。（C） 迁移细胞通过ImageJ进行定量。然后通过（D）伤口愈合试验和（E）Transwell试验检测转染shRNAs抗BAG3（shBAG3）的VSMC的迁移。实验重复三次，结果可重复。*与对照组相比p<0.05。
图4
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高级糖基化终产物（AGEs）通过Bcl-2-相关无核基因3（BAG3）促进大鼠原代血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移。用100µg/ml AGEs或10µ（A）通过伤口愈合试验和（B）Transwell试验检测细胞迁移。（C） 迁移细胞通过ImageJ进行定量。然后通过（D）伤口愈合试验和（E）Transwell试验检测转染shRNAs抗BAG3（shBAG3）的VSMC的迁移。实验重复三次，结果可重复。*与对照组相比p<0.05。
图5
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Bcl-2-相关athanogene 3（BAG3）对血管平滑肌细胞（VSMC）氧化应激和线粒体膜电位的影响。（A） 用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）（Ex/Em，485/530 nm）标记细胞，检测活性氧（ROS），并用荧光显微镜（比例尺，20µm） ●●●●。（B） DCFH-DA染色的荧光强度使用ImageJ进行量化，并通过打乱组进行标准化，*与打乱组相比p<0.05。（C） 线粒体用四甲基罗丹明甲酯（TMRE）（Ex/Em，549/573 nm）标记以检测线粒体膜电位，并用荧光显微镜（标尺，20µm） ●●●●。（D） 使用ImageJ量化TMRE染色的荧光强度，并通过打乱组进行标准化，*与打乱组相比p<0.05；#与scramble+晚期糖基化终产物（AGE）组相比，p＜0.05。
图5
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Bcl-2-相关athanogene 3（BAG3）对血管平滑肌细胞（VSMC）氧化应激和线粒体膜电位的影响。（A） 用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）（Ex/Em，485/530 nm）标记细胞，检测活性氧（ROS），并用荧光显微镜（比例尺，20µm） ●●●●。（B） DCFH-DA染色的荧光强度使用ImageJ进行量化，并通过打乱组进行标准化，*与打乱组相比p<0.05。（C） 线粒体用四甲基罗丹明甲酯（TMRE）（Ex/Em，549/573 nm）标记以检测线粒体膜电位，并用荧光显微镜（标尺，20µm） ●●●●。（D） 使用ImageJ量化TMRE染色的荧光强度，并通过打乱组进行标准化，*与打乱组相比p<0.05；#与scramble+晚期糖基化终产物（AGE）组相比，p＜0.05。
图6
图6
晚期糖基化终产物（AGEs）通过氧化应激促进血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖和迁移。细胞与100µ克/毫升N个-乙酰半胱氨酸（NAC）和100µg/ml AGEs或10µ用DCHF-DA法检测活性氧（ROS）。（B） 用ImageJ定量2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色的荧光强度，并用打乱组归一化。（C和D）通过EdU分析检测细胞增殖。*p<0.05和#与BSA组相比，p<0.05。（E） 采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）法检测细胞活力。用（F）伤口愈合试验和（G和H）Transwell试验检测细胞迁移。实验重复三次，结果可重复。*与BSA对照组相比，p<0.05。
图6
图6
晚期糖基化终产物（AGEs）通过氧化应激促进血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖和迁移。细胞与100µ克/毫升N个-乙酰半胱氨酸（NAC）和100µg/ml AGEs或10µ用DCHF-DA法检测活性氧（ROS）。（B） 用ImageJ定量2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色的荧光强度，并用打乱组归一化。（C和D）通过EdU分析检测细胞增殖。*p<0.05和#与BSA组相比，p<0.05。（E） 采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）法检测细胞活力。用（F）伤口愈合试验和（G和H）Transwell试验检测细胞迁移。实验重复三次，结果可重复。*与BSA对照组相比，p<0.05。
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