液泡细胞毒素A（VacA）是由幽门螺杆菌感染超过50%人口的革兰氏阴性菌。幽门螺杆菌导致消化性溃疡病，是胃癌的早期危险因素。1VacA不仅是导致细胞空泡化的毒素幽门螺杆菌培养滤液，2但也显示出对哺乳动物细胞的多效性效应。3,4VacA是以140 kDa的前体形式产生的，在细菌分泌过程中被切割成87–95 kDa的成熟毒素。后者可进一步裂解为氨基末端p37结构域和羧基末端p58结构域，它们保持非共价连接。分泌型VacA是一种花状低聚物，由六或七个单体组成。短时间接触酸性或碱性pH值后，低聚物被分解，VacA能够与脂质双层相互作用。与生物膜的相互作用触发低聚物的恢复，形成阴离子选择性、电压依赖性通道。5VacA的膜通道形成能力位于其氨基末端部分，p37结构域中的单个氨基酸取代（P9A和G14A）完全消除了它。6,7VacA对上皮细胞的真空化严格依赖于阴离子选择性膜通道的形成，这些通道在毒素内化后靶向晚期内体。3,5,8,9事实上，VacA一旦结合到细胞表面，就会被一种涉及F-actin但不依赖于网格蛋白、动力蛋白和ARF6 GTPase的胞饮机制迅速内化。然后，在到达晚期内体之前，它被输送到早期内体。10,11
幽门螺杆菌与人类胃粘膜细胞凋亡水平增加有关。12-15有人提出，特殊细胞（尤其是胃壁细胞）的丢失导致关键细胞串扰通路的改变，最终导致分化障碍和化生/异型增生/癌序列的启动。16尽管有多个幽门螺杆菌因素，包括cag（控制室）致病岛17和脂多糖，18很可能会牵涉其中，VacA是就其本身而言足以导致细胞死亡。19,20
细胞凋亡是一种遗传控制的、进化上保守的途径，其中细胞器起着重要的调节作用。尤其是线粒体，通过释放到胞浆（Cyt）细胞色素，整合和放大不同的凋亡信号c（c）以及激活效应器半胱天冬酶所需的其他辅因子，这些辅因子随后会破坏细胞结构。细胞色素的释放c（c）由BCL-2家族成员控制，包括抗凋亡和促凋亡蛋白。在一个广为接受的模型中，所谓的“仅BH3”促凋亡家族成员感知损伤信号，并将其传递给所谓的“多域促凋亡”BAX和BAK，后者是激活线粒体凋亡途径所必需的。一旦被BH3-only蛋白激活，BAX和BAK为细胞色素的流出提供了物理途径c（c）此外，它们还控制着稳态钙2+内质网（ER）中的水平，从而控制对钙的反应2+-介导死亡刺激。21
VacA可降低线粒体膜电位（ΔΨ米)22释放细胞色素c（c）.23因此，VacA（p37）和GFP N末端片段之间的融合蛋白和纯化毒素都定位于线粒体。24Δ损失Ψ米和细胞色素c（c）释放需要VacA的通道形成域。7,24,25这导致假设ΔΨ米耗散和/或细胞色素c（c）释放是线粒体内膜VacA通道的直接结果，与宿主因子无关。26然而，VacA在细胞色素释放之前激活多域促凋亡蛋白BAX和BAKc（c）.27这使情况变得复杂，并给我们留下了许多悬而未决的问题：VacA是针对线粒体的吗？怎么用？它需要BAX和BAK来杀人吗？它依赖于充足的ER Ca吗2+BAX和BAK的直接线粒体功能？
在本研究中，我们使用遗传方法研究了VacA诱导细胞凋亡的机制。VacA需要线粒体水平的BAX和BAK才能杀死。出乎意料的是，活性VacA还诱导BAX向内胚体移位，同时内胚体和线粒体膜同时分离。协同进化和细胞死亡严格依赖于毒素的通道形成域以及BAX和BAK的存在。因此，VacA诱导的凋亡程序包括BAX和BAK依赖的内体并列到线粒体的意外子程序，扩展了这些促凋亡蛋白的已知作用。
结果
VacA的凋亡需要其通道形成域以及BAX和BAK的完整性
我们评估了细胞凋亡是否由幽门螺杆菌小鼠胚胎成纤维细胞培养上清（CS）需要多域促凋亡药物BAX和BAK。MEF双重缺陷Bax公司和贝克（双淘汰赛（DKO））28对由幽门螺杆菌上清液与野生型（wt）上清液进行比较(). 然后我们验证了wt细胞中发生的凋亡是否需要VacA的通道形成活性。CS来自两个同基因突变体幽门螺杆菌VacA基因（P9A和G14A）发生点突变，导致毒素无法形成阴离子通道7,29在诱导细胞死亡方面非常无效(和补充图1a）。当我们测量wt和DKO MEF对CS的反应时幽门螺杆菌我们发现DKO细胞反应更灵敏，5小时后达到最大空泡化()而wt细胞在24小时前几乎没有空泡化（未显示）。正如预期的那样，DKO细胞在暴露于CS后没有空泡化幽门螺杆菌突变株（未显示）。因此，空泡化和凋亡似乎是独立的，前者甚至受到BAX和BAK缺乏的刺激。总之，促凋亡蛋白BAX和BAK是VacA诱导凋亡所必需的，这取决于其VacA通道特性。
VacA诱导的细胞死亡需要促凋亡蛋白BAX和BAK。(一)Wt-MEF细胞与幽门螺杆菌CS，wt或P9A突变。在6、18、24、48和72小时后，按照制造商的说明进行Annexin-V分析。细胞荧光法测定Annexin-V-Alexa 568-阴性细胞的存活率。(b条)如上所述，培养Bax/Bak DKO MEF细胞并分析其活性。细胞未暴露于幽门螺杆菌CS被定义为未经处理的细胞。数据表示平均值±S。20个独立实验的D。使用Student’st吨-CS-中毒细胞与未处理细胞的配对数据检验***P<0.01
VacA在DKO中诱导空泡化，但在wt MEF中不诱导。Wt和DKO MEF与幽门螺杆菌重量CS。5小时后，用中性红摄取试验测定空泡化程度。结果表示为540 nm和405 nm处获得的OD值之间的差值，为平均值±S。三个独立实验的D
VacA诱导的凋亡涉及线粒体水平的BAX依赖性调节
由于BAX和BAK在多个水平上调节细胞凋亡，30我们推断，DKO细胞对VacA诱导的凋亡不敏感可能反映了其对Ca的下调2+为了测试这种可能性，我们使用了一种DKO MEF模型，该模型的多种缺陷都经过了遗传和选择性纠正：线粒体模型通过将BAX专门靶向线粒体，ER模型通过过度表达肌/内质网Ca2+-ATP酶（SERCA），30加利福尼亚州2+-负责钙吸收的ATP酶2+从Cyt进入ER管腔。31线粒体靶向BAX（mtBAX）的表达恢复了DKO MEF细胞对VacA诱导的凋亡的敏感性，尽管细胞仍比wt细胞更具活力（对比图具有)可能是因为缺少BAK。相反，SERCA的过度表达没有影响(). 这表明VacA属于需要以线粒体为基础的多域促凋亡药物的刺激类型，尽管细胞内Ca耗竭，VacA仍能继续进行2+商店。如预期，来自幽门螺杆菌VacA P9A通道突变也无法触发mtBAX校正的DKO细胞的凋亡。总之，VacA利用所谓的凋亡“线粒体网关”杀死中毒细胞。
VacA诱导的细胞死亡涉及线粒体凋亡通路。对DKO MEF细胞进行基因和选择性纠正：通过将BAX专门靶向线粒体来纠正线粒体缺陷(一)SERCA过度表达导致ER缺陷(b条). 培养细胞并分析其活力，如.细胞未暴露于幽门螺杆菌CS被定义为未经处理的细胞。数据表示平均值±S。20个独立实验的D。使用Student’st吨-CS-中毒细胞配对数据检验与未处理的细胞**P（P）<0.02; ***P（P）<0.01
VacA诱导BAX活化及其向线粒体募集
在静息细胞中，多域促凋亡蛋白BAX作为单体存在于Cyt中或松散地附着于细胞膜上。一旦细胞受到凋亡刺激的应激，BAX就会激活，暴露其C末端α-9螺旋，并转移到线粒体。32-34这种构象变化可以通过使用特定抗体暴露新的表位来监测。重量幽门螺杆菌CS诱导的BAX活化和抗VacA抗体的平行染色显示，这两种蛋白之间存在部分但显著的共定位(). 给突变株的CS后未观察到BAX激活，再次强调了VacA通道形成活性的中心作用。在后一种情况下观察到的较弱的VacA染色可能是因为毒素进入细胞的效率较低。因此，我们一直等到48小时，VacA染色增加；然而，BAX没有激活（未显示）。此外，从用wt-CS培养24小时的细胞中提纯的线粒体显示出BAX的明显补充，这在未经处理的细胞或暴露于突变株的细胞中是完全缺失的(). 这不是BAX总量增加的结果，这是通过暴露于wt和突变CS的细胞裂解液中的特异性免疫印迹测定的（数据未显示）。
VacA触发BAX活化并将其转移到线粒体(一)wt MEF细胞经24小时孵育后的典型共焦图像幽门螺杆菌CS，wt或P9A突变。用兔抗VacA抗体和二级FITC抗兔抗体对细胞进行免疫染色。BAX是用对其活化形式（克隆6A7）特异的鼠单克隆一级抗体和二级TRITC抗鼠抗体检测的。这些图像代表了五个独立实验中检测的60个细胞。比例尺：10μm.VacA和活化BAX共定位的曼德系数为0.21±0.0231（wt）幽门螺杆菌CS-中毒细胞与P9A突变CS-处理细胞中0.09±0.00198的比较(n个=5个独立实验，每个实验60个细胞）。(b条)从与wt或P9A突变株孵育的wt MEF细胞中纯化线粒体幽门螺杆菌指示时间点的上清液；15μ用SDS-PAGE和免疫印迹法分离线粒体蛋白g；用兔抗BAX抗体显示BAX。使用抗COX II单克隆抗体作为等负荷对照。细胞未暴露于幽门螺杆菌CS定义为未经处理的细胞
VacA的通道形成区是其定位于线粒体所必需的
VacA是在凋亡过程中靶向线粒体，还是滞留在晚期内体中，仍然是一个悬而未决的问题。23,24,27鉴于线粒体通道诱导凋亡的需要，我们研究了VacA从进入细胞到诱导凋亡的亚细胞定位。在一组初步实验中，我们证实了我们的细胞亚细胞分离得到了纯线粒体和早期和晚期内体部分(). 因此，我们通过免疫印迹监测纯化线粒体和早期和晚期内胚体亚细胞组分中VacA的积累，这些组分来自与wt或VacA P9A孵育24小时的细胞幽门螺杆菌完。Wt-VacA存在于两个内胚小室中，正如预期的那样，毒素通过内吞作用进入细胞，有趣的是，部分也存在于线粒体部分(). 相反，VacA P9A在内胚小室中积累，但没有到达线粒体(). 此外，尽管CS中的浓度相似（未显示），但突变毒素的内化效率低于wt毒素。从VacA P9A中毒细胞中提纯的含有内胚体和线粒体蛋白质的凝胶，可以排除线粒体部分缺乏蛋白质是因为其内化效率较低(). 通过将另一个通道缺陷突变体VacA G14A应用于细胞，进一步证实了VacA通道活性在其靶向线粒体中的作用；7它在内胚体和wt对应物中积累，但没有到达线粒体（补充图1b）。我们通过共焦显微镜进一步证实了在表达线粒体靶向红色荧光蛋白的MEF中使用抗VacA抗体对VacA进行亚细胞定位。虽然在用突变的VacA处理的细胞中，毒蛋白阳性小泡的分布与线粒体的分布明显不同，但在用wt-VacA孵育24小时的细胞中有几个毒蛋白阳性斑点与线粒体紧密相连(). 因此，VacA与线粒体的结合似乎需要参与通道形成的相同结构域。
EEA1、LAMP1和TOM20在从wt MEF细胞纯化的内体和线粒体组分中的分布。如前所述分离早期内体（EE）、晚期内体（LE）和线粒体，15μ用SDS-PAGE分离g蛋白质，并用所示抗体进行免疫印迹
VacA靶向线粒体(一)Wt MEF细胞与Wt或P9A突变体孵育24小时幽门螺杆菌上清液，如前所述采集并分馏。十五或五十μ用SDS-PAGE分离g早期内体（EE）、晚期内体（LE）和线粒体（Mt）蛋白，并用所示抗体进行免疫印迹。(b条)转染mtRFP质粒编码的Wt MEF细胞与Wt或P9A突变株孵育幽门螺杆菌反恐精英。孵育24小时后，固定细胞，并用兔抗VacA抗体染色毒素，然后用二级FITC抗兔抗体染色。这些图像代表了从三个单独的实验中检测到的60个细胞。比例尺，10μ米(c（c）)平均值±S。D.（n=3，每个独立实验20个细胞）共定位数据b条.使用Student的t吨-小波变换的配对数据检验幽门螺杆菌CS-处理与P9A幽门螺杆菌CS-处理细胞***P（P）< 0.01
在VacA中毒的细胞中，内体与线粒体并列
我们之前的实验留下了一个悬而未决的问题，即VacA是如何从内体过渡到线粒体，从而导致BAX激活的。因此，我们决定跟踪VacA在感染的wt和DKO细胞中的亚细胞定位，并在前者中激活BAX。早在感染后2小时和30分钟，wt毒素就积聚在内胚体部分，尽管线粒体部分已经检测到一小部分蛋白质。12小时后，线粒体部分广泛回收wt VacA，而内切体对突变毒素（缺乏通道活性）保持阳性。出乎意料的是，在用活性幽门螺杆菌CS，在2小时30分钟后，BAX在早期内体部分中被回收，没有受到Cyt的污染，这一点得到了缺乏细胞溶质标记物GAPDH的证实（补充图2b）。内体上吸收的BAX的主要比例不是膜完整性，这可以通过其对碱提取的敏感性得到证实（补充图2a）。值得注意的是，在暴露于突变VacA的细胞以及未经处理的细胞中，在内胚体和线粒体部分未检测到活性BAX的募集(). 此外，wt-VacA在线粒体部分诱导了早期（EEA1）和晚期（LAMP1）内体标记的渐进积累(). 相反，当细胞与VacA（P9A突变体）通道形成区的突变体一起孵育时，这两个标记物都局限于它们相应的部分，并且没有与线粒体共同纯化(). 同样，在暴露于另一个通道缺陷突变体VacA G14A的细胞中，也没有发现内体标记物和BAX与线粒体相关(). 重要的是，wt VacA处理细胞的内体部分线粒体标记物不阳性()表明BAX在内胚体中的回收不是线粒体片段在内胚体内积累的附带现象。因此，VacA诱导了囊泡交通的重大改变，导致早期和晚期内体与线粒体的共同分离，这种情况与Fas活化T细胞的情况类似。35这种早期改变与早期内体部分中活性BAX的积累大约在同一时间发生，早于其在线粒体上的恢复。值得注意的是，未观察到已经存在的线粒体BAK的内体募集（未显示）。
VacA诱导内膜和线粒体膜的共同分离。Wt或DKO MEF细胞与幽门螺杆菌CS，wt或P9A突变体；在指定的时间点进行亚细胞分离，15μ用SDS-PAGE和免疫印迹法分离早期内体（EE）、晚期内体（LE）和线粒体（Mt）蛋白g；特异性抗体显示VacA、BAX、EEA1和LAMP1。细胞未暴露于幽门螺杆菌CS定义为未经处理的细胞
(一)VacA G14A不会诱导线粒体内体劫持。线粒体是从细胞中纯化出来的，用幽门螺杆菌CS（wt或G14A突变型）。使用SDS-PAGE，15μ然后分离g蛋白，并用多克隆抗EEA1、抗LAMP1和抗BAX抗体探测膜。COX II被用作线粒体等负荷的标记(b条)COX II在从醉酒wt MEFs纯化的内体和线粒体部分中的分布。总共15个μg从未经处理的wt MEF细胞中纯化的早期内体（EE）、晚期内体（LE）和线粒体（Mt）蛋白，用wt处理幽门螺杆菌将CS或带有突变P9A的CS装入SDS-PAGE并进行免疫印迹。COX II在线粒体中的独家定位允许在亚细胞分级过程中排除线粒体片段对内体的任何污染
中毒12小时后，线粒体部分积累了大量的VacA()当细胞凋亡仍然无法测量时，表明靶向性先于诱导死亡。为了证实这一点，我们求助于DKO细胞，在该细胞中，我们希望能够在完全没有凋亡的情况下，重现VacA的线粒体靶向性及其与内体的共分馏。令人惊讶的是，在这些细胞中，VacA根本没有与线粒体标记物共定位，也没有在中毒12小时内诱导内体膜和线粒体膜的共同分离(). 24小时时，即使内体标记物未达到线粒体部分，VacA的一小部分似乎是针对线粒体的。
我们希望证实，在VacA中毒的细胞中，线粒体和内体变得更紧密。VacA暴露细胞的免疫荧光分析进一步证实了wt毒素促进早期/晚期内体和线粒体并列的能力()，并提出了内胚体小泡（含VacA）与线粒体的关联。值得注意的是，在暴露于内源性或外源性凋亡刺激（如staurosporine、etoposide和TNF-α）的细胞中，未观察到靠近线粒体的内胚体的重定位（补充图3）。这表明，在暴露于VacA的细胞中，内体与线粒体并置是特异性的，并不是细胞凋亡的一般特征。
在VacA中毒的细胞中，早期和晚期内体靠近线粒体。Wt MEF细胞与幽门螺杆菌CS，wt或P9A突变体，在进行免疫荧光处理之前。（左面板）抗Rab5（绿色染色）和抗TOM20（红色染色）抗体分别用于标记早期内体膜和线粒体膜。（右面板）抗LBPA（绿色染色）用于标记晚期内膜。比例尺，10μ含有放大细节的m.正方形显示了暴露于wt毒素的细胞内体和线粒体标记之间的明显共定位。细胞未暴露于幽门螺杆菌CS定义为未经处理的细胞。所有这些图像代表了从三个单独的实验中检测到的每种条件下的60个细胞。平均值±S。D(n个=3，每次实验20个细胞）。使用Student’st吨-对暴露于326 P9A的wt CS-中毒细胞与未处理细胞/细胞的配对数据进行测试***P（P）<0.01
对醉酒的MEF细胞进行的免疫电镜分析进一步证实了这一发现。使用来自幽门螺杆菌wt菌株，但不是来自突变菌株，持续2小时30分钟，触发了内体区室（对晚期内体标记物溶二磷酸（LBPA）呈阳性）与线粒体的并置(见b）中的量化。同时，wt VacA中毒细胞和未经处理的细胞内体面积保持不变(). 不幸的是，由于我们的免疫电镜方案中EEA1抗体的免疫反应性很差（未显示），任何显示早期内体阳性结构的尝试都失败了。
在VacA中毒的细胞中，内膜与线粒体共分馏。将Wt MEF细胞与幽门螺杆菌CS，wt或P9A突变体，在进行免疫电子显微镜处理之前。(一)用抗LBPA抗体分别标记P9A突变体（左面板）和wt-CS（右面板）暴露细胞的晚期内体膜。N、 细胞核；箭头指向线粒体；金颗粒识别晚期内体。比例尺对应于0.84μ左侧面板为m，小于等于0.47μm表示右侧面板。(b条)MEF的形态计量学分析一线粒体数量在5.25以内μ从内体表面计算m（未处理细胞为22.37±1.1，326个P9A处理细胞为46.74±2.33，326 wt处理细胞为90.63±4.53）。数字是指线粒体总面积为65μ米2围绕内体。(c（c）)MEF细胞的形态计量学分析一测量晚期内体所占的总细胞面积（每种情况下平均考虑12个内体）
总之，亚细胞分馏、成像和免疫电镜的结合表明，在被VacA中毒的细胞中，线粒体和内体非常接近。值得注意的是，在较长的时间点，并置进化为自噬体中线粒体的吞噬（未显示）。36
讨论
在这项研究中，我们报告了在细胞中幽门螺杆菌细胞毒素VacA内体在线粒体附近回收，同时毒素在后一个细胞器中积累。中毒后2小时和30分钟，线粒体部分富集了内吞体标记物EEA1（早期内吞体特有）和LAMP1（晚期内吞体更典型）。因此，山崎报道了VacA与Rab7的共定位等.27可能反映出与此处记录的相同的膜定位错误。我们认为，VacA通过这些细胞器之间的串扰作用于线粒体，而这些串扰可能在凋亡诱导过程中增强。35为了支持这一结论钡/钡DKO细胞在线粒体中没有内体标记物积累，VacA仍局限于内体水平。VacA和内体标记物与线粒体的共同分离不仅仅是凋亡诱导的结果，因为它发生在任何可检测到的细胞死亡之前。
在TNF-α暴露的肝细胞中，内体和线粒体之间的汇聚交通已被证实，37Fas激活的T细胞35还有网织红细胞，其中铁从一个细胞器直接穿梭到另一个细胞器官，无需任何细胞溶质介质。38此外，在各种凋亡环境中，线粒体的细胞内定位和细胞器簇的生成发生了变化。39尽管这种细胞器间膜交通可能对某些细胞环境具有特异性，但这种交通途径在其他细胞类型中组成性存在的可能性值得进一步研究。
先前的结果表明，VacA诱导凋亡前蛋白BAX和BAK的激活。27然而，主要的促凋亡“多域”蛋白BAX和BAK不仅控制线粒体外膜的物理通透性，28还有ER Ca水平2+因此对钙的敏感性2+-依赖性死亡刺激。30我们的研究结果支持了一个模型，在该模型中，VacA参与了所谓的凋亡“线粒体网关”。缺少这两者的细胞Bax公司和贝克VacA中毒不会死亡，这表明VacA死亡需要这些关键的凋亡介质。专门针对线粒体的BAX突变体的重新表达显著恢复了细胞对毒素的敏感性，而ER-Ca减少的基因校正2+的级别Bax公司-和贝克-缺陷细胞不能恢复其对VacA的易感性。
在凋亡过程中，BAX可以靶向不同的细胞膜，从线粒体到内质网再到高尔基体。40然而，据我们所知，BAX从未在内胚体上定位。更重要的是，这些细胞器可以作为BAX向线粒体募集的平台；BAX在内胚体膜上被激活，然后凭借其与线粒体外膜的亲和力将整个细胞器拖向线粒体；（2）或者，尽管一部分BAX因VacA中毒而直接进入线粒体膜，但另一部分BAX通过涉及内体的膜转运到达线粒体。后一种模型与观察结果一致，即与VacA孵育12小时后与线粒体相关的BAX量明显大于线粒体与内体混合后仅因其补充而预计的量。BAX募集对早期（而非晚期）内体的选择性尚不清楚。共免疫沉淀未显示VacA和促凋亡蛋白之间的任何相互作用。然而，这并不意味着这两种蛋白质不相互作用；例如，BID和BAX之间的共同免疫沉淀与膜中发生的相互作用同样为阴性。41这设想了一种情况，即VacA导致线粒体附近的内胚体膜定位错误。这似乎是线粒体中VacA和BAX积累的关键步骤，从而决定了VacA中毒期间该细胞器中积累的促凋亡蛋白的最终数量。
VacA诱导的内体重定位以及BAX在这些细胞器上的募集需要VacA的通道形成域；该区域的突变阻止了晚期内体中的毒素，消除了BAX向内体和线粒体的募集，并消除了毒素的促凋亡作用。
令人惊讶的是，与wt细胞相比，DKO细胞在VacA中毒后更容易发生空泡化，这表明空泡化和凋亡是两个遗传上可区分的过程，尽管两者都需要通道形成域。由于不同的液泡化并不是由于毒素进入DKO细胞的增加所致，这就增加了BAX和BAK参与细胞膜交通的有趣可能性。在这种情况下，BAX/BAK的缺失会导致内胚体变大，这解释了VacA对DKO细胞液泡大小和范围的显著影响（补充图2）。如果由于缺乏这些多域促凋亡药物，内胚体重塑的构成途径被某种程度的钝化，那么更多的膜将可用于VacA的空泡化。VacA始终不能诱导DKO细胞内胚乳体和线粒体的共分离。
总之，我们的工作表明VacA诱导的细胞凋亡需要BAX和BAK，并且是Ca2+独立。此外，它阐明了VacA在细胞凋亡过程中靶向线粒体的途径，并指出关键促凋亡蛋白BAX在细胞内细胞器动力学中的一种意想不到的新功能。
材料和方法
材料
按照Scorrano的描述培养MEF等.30按照制造商的说明，使用转染脂质试剂（美国加利福尼亚州里士满Bio-Rad）进行转染。除非另有规定，否则所有化学品均来自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。幽门螺杆菌G14A菌株由诺华公司（意大利锡耶纳）提供。蛋白酶抑制剂鸡尾酒来自罗氏公司（德国彭茨堡）。TNF-α来自Alexis Biochemicals（瑞士劳森）。质粒pCDNA3.1编码以线粒体为靶点的红色荧光蛋白（mtRFP）是英国格拉斯哥大学（University of Glasgow，UK）M Zaccolo赠送的礼物。诺华公司提供抗VacA多克隆抗体；抗LAMP1和抗EEA1的多克隆抗体来自Abcam（英国剑桥）；抗BAX单克隆抗体（克隆6A7）来自Biosource（Camarillo，CA，USA）；多克隆抗体抗BAX和单克隆抗体抗COX II来自Upstate（Lake Placid，NY，USA）。抗Rab5的单克隆和多克隆抗体是M Zerial（德国柏林马克斯·普朗克研究所）赠送的；抗LBPA单克隆抗体（克隆6C4）由J Gruenberg（瑞士日内瓦大学）提供；抗TOM20多克隆抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（美国加利福尼亚州圣克鲁斯），抗复合物II单克隆抗体亚单位70 kDa来自MitoSciences（美国俄勒冈州尤金），抗GAPDH单克隆抗体来自Merck（英国诺丁汉）。
细菌和培养条件
幽门螺杆菌菌株SPM 326，编码s1m1型VacA，42和两个等基因真空吸尘器携带点突变的突变株P9A29和G14A，7保持在5%的CO中237°C，在添加5%马血的哥伦比亚琼脂平板上。将菌落接种到含有5%FBS的脑心输液肉汤中，并在37°C、180 r.p.m、微需氧条件下旋转摇晃培养2天。
肉汤培养上清液的蛋白质，在600 nm（OD）下稀释至光密度600)如Skibinski所述，0.8，用50%硫酸铵沉淀，再悬浮在20 mM Hepes中，pH 7.4，初始体积的1/15等.43浓缩上清液在同一缓冲液中进行透析。对来自wt或突变体的细菌上清液进行western blot分析幽门螺杆菌菌株显示，两种制剂的毒素含量相当，约占总蛋白的4%。
细胞中毒
对于所有的实验幽门螺杆菌如上所述制备上清液326野生型、326 P9A和326 G14A；在含有2%FBS的Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）中稀释四倍后，在指定的时间点将其注入细胞。
细胞空泡化试验
MEF电池（7.5×104/ml）接种在含有10%FBS和2 mM谷氨酰胺的DMEM中96周板中，37°C，5%CO2检测前18小时。细胞暴露于幽门螺杆菌在含有2%FBS和5 mM氯化铵的DMEM中稀释的上清液。在不同的时间点，通过测量中性红染料的吸收来定量确定液泡化的程度。44简而言之，细胞在0.05%中性红PBS中培养8分钟，并用0.2%牛血清白蛋白（BSA）洗涤三次。添加100后μ用Packard Fusion微孔板阅读器（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆Perkin Elmer）在540 nm处测量吸光度，减去405 nm处的吸光度。
免疫荧光
MEF细胞接种在盖玻片上（2.5×104/ml接种在24孔板中的野生型MEF细胞）用编码mtRFP的质粒pCDNA 3.1转染；18h后，细胞暴露于幽门螺杆菌含2%FBS的DMEM上清液达到指定时间。然后用3.7%甲醛在PBS中固定细胞30分钟，用0.01%Nonide P40在室温下渗透20分钟，用0.5%的PBS BSA封闭细胞。VacA用多克隆抗VacA抗体染色45然后是异硫氰酸荧光素（FITC）结合的抗兔二级抗体。用对蛋白活性形式特异的单克隆抗BAX抗体（克隆6A7）对BAX进行染色，然后用四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）结合的抗小鼠二级抗体对BAX染色。用单克隆抗Rab5和抗LBPA抗体标记内体蛋白Rab5和LBPA，然后用FITC抗小鼠二级抗体标记；线粒体蛋白TOM20用多克隆抗TOM20抗体标记，然后用TRITC抗兔二级抗体标记。在暴露于足叶乙甙的细胞中（补充图3），用兔多克隆抗体标记Rab5，用单克隆抗体抗复合物II亚单位70kDa鉴定线粒体。在激光扫描共聚焦显微镜上用×63油浸物镜对细胞进行可视化，并使用LAS-AF软件（Leica TCS-SP5，Leica Microsystems，Wetzlar，德国）获取图像。然后使用ImageJ（美国马里兰州贝塞斯达国家心理健康研究所研究服务处）软件对图像进行处理。如前所述，使用ImageJ的Mander系数插件计算用于共定位分析的Mander系数。46用Mander共定位系数进行盲法定量。
亚细胞分离
MEF细胞以10的密度接种5/ml置于直径为10 cm的组织培养皿中，并在37°C、5%CO、含10%FBS的DMEM中生长2如Genisset所述，在4°C下分离内切体48小时等.29简言之，用冰镇PBS清洗细胞，用细胞刮刀分离细胞并通过离心（500×克，10分钟）。然后在3 ml均质缓冲液（HB-EDTA，0.25 M蔗糖（8%）3 mM咪唑和0.5 mM EDTA，pH 7.4）中清洗，造粒（1300×克，10分钟），重新悬浮在0.7 ml HB-EDTA中，并通过22号（1 1/4英寸）针头将其均匀化10次。离心（1300×g，10 min）后，收集核后上清液（PNS），在HB-EDTA中缓慢添加62%蔗糖，使其蔗糖浓度增加至40.6%。然后将PNS小心地分层放置在1.5 ml的35%和1 ml的25%蔗糖EDTA缓冲液上。用HB填充试管，并在SW60 Ti转子中于4°C下于35000 r.p.m.下离心1 h（美国加利福尼亚州富勒顿贝克曼仪器公司）。分别在25%蔗糖和HB之间以及35%和25%蔗糖之间的界面处收集晚期和早期内胚体富集部分。
纯化线粒体是从内切体纯化过程中排出的核颗粒（NP）中获得的。35简言之，NP在分析缓冲液（0.12 M甘露醇、0.08 M KCl、1 mM EDTA和20 mM K-Hepes，pH 7.4）中被重新组织化，并在600×克将上清液分层放置在1 M甘露醇缓冲液中。试管中填充有2%的BSA分析缓冲液。9000×离心后克在4°C下悬浮15分钟，将颗粒重新悬浮在0.5 ml的分析缓冲液中，以10 000×克持续10分钟，最后在25分钟内再次悬浮μl分析缓冲液。用Bradford法测定所有亚细胞组分的蛋白质浓度。47
为了获得细胞溶质部分，从24h中毒细胞中收集的PNS在8000×克如上所述，在4°C下保持10分钟。无线粒体上清液以10万倍离心克在4°C下，在100 Ti转子（Beckman Instruments）中放置1 h，收集上清液作为细胞溶质部分。
免疫沉淀、碱提取和免疫印迹
按照Sawada的指示进行VacA和BAX的免疫共沉淀等.48纯化的线粒体（1 mg）在NP40缓冲液（142.5 mM KCl，5 mM MgCl）中溶解2、1 mM EGTA、10 mM Hepes、pH 7.4和0.2%Nonide P40）补充蛋白酶抑制剂（1:10稀释的蛋白酶抑制剂混合物）。用20μl蛋白A-琼脂糖在4°C下放置2 h，在4μg抗BAX多克隆抗体。在4°C下孵育16小时后，用NP40缓冲液加0.03%BSA对珠子进行广泛洗涤。在通过蛋白质印迹分析之前，将珠子中的蛋白质最终溶解在SDS-PAGE负载缓冲液中。
对于碱提取，从与幽门螺杆菌如前所述，将wt CS暴露于碱处理24 h。49简言之，早期内体以10万×克在100 Ti转子（Beckman Instruments）中，4°C下放置1小时，15μg重悬于1ml 100mM Na中2一氧化碳3pH 11.5，在冰上培养30分钟，以100 000×克在4°C下保持1小时。收集含有碱溶蛋白的上清液，并用HCl 1 M进行中和。将含有膜完整蛋白的颗粒溶解，用SDS-PAGE分离两个组分中的蛋白质，并用western blot进行分析。
对于免疫印迹，使用了以下抗体：抗EEA1、LAMP1 BAX、VacA、TOM20和COX II（稀释1:1000）。使用抗EEA1和LAMP1抗体代替抗Rab5和LBPA（应用于免疫荧光），分别鉴定早期内体和晚期内体部分，因为信号质量显著提高。
DKO MEF细胞的遗传校正
在Scorrano中描述了DKO SERCA和mtBAX DKO MEF细胞的遗传校正等.30GFP-BAX重组为Bax公司和贝克使用MSCV逆转录病毒载体的双缺陷MEF（Clontech，Mountain View，CA，USA）。通过限制稀释产生表达BAX融合蛋白的稳定克隆。将全长小鼠BAX与11氨基酸N末端血凝素（HA）标记融合，生成HA-BAX。线粒体靶向HA-BAX（mtBAX）是通过融合人类细胞色素第八亚单位的29个氨基酸线粒体靶向序列构建的c（c）氧化酶（COX VIII）位于HA-BAX的N末端，并存在于线粒体外膜表面。将全长兔SERCA-2和mtBAX克隆到pcDNA3中进行瞬时表达实验，并将其克隆到含有loxP-侧翼绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒载体（MFIG）中，在此载体之前有一个内部核糖体进入位点（IRES）进行稳定表达。通过限制稀释建立稳定克隆，并通过FACS分析基于GFP表达进行筛选。免疫印迹法检测基因产物的蛋白表达水平。
细胞死亡测量
根据制造商的说明，用与Alexa 568（Bender MedSystem，加利福尼亚州伯林盖姆，美国）偶联的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Annexin-V培养MEF细胞。通过流式细胞术（FACSCalibur，BD Biosciences，San Jose，CA，USA）测量活度，作为门控人群中Annexin-V阴性事件的百分比。为了评估基因纠正的DKO MEF细胞（SERCA或mtBAX）的生存能力，在GFP阳性门控人群中进行了Annexin-V阴性事件的百分比。
电子显微镜
根据德意志的常规方案进行免疫电子显微镜检查50由Slot和Geuze改编。51MEF细胞在室温下用2%多聚甲醛和0.2%戊二醛在PBS中固定2 h，嵌入12%明胶中，并在4°C下冷却10 min。将方便的块切下，渗透到2.3 M蔗糖中过夜，然后在液氮中冷冻。在1:12.3M蔗糖和2%甲基纤维素中切取超薄冰冻切片（60nm）。用小鼠抗LBPA（稀释1:20）立即对冷冻切片进行LBPA免疫标记，并用兔抗鼠抗体和蛋白a金15nm检测，如前所述。48
统计分析
数据表示为平均值±S。D.学生的t吨-测试用于统计分析幽门螺杆菌重量CS-处理细胞与P9A或G14A幽门螺杆菌CS-中毒细胞/未经处理的细胞。A类P（P）-≤0.05的值被认为是显著的。
