细胞生物学杂志。1997年12月1日；139(5): 1281–1292.
细胞凋亡过程中Bax从细胞溶胶向线粒体的迁移
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基思·G·沃尔特
*外科神经科生物化学科‡马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所分子生物学实验室光学显微镜设备，邮编：20892
徐一泰
*外科神经科生物化学科‡马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所分子生物学实验室光学显微镜设备，邮编：20892
卡罗琳·史密斯
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Amotz Nechushtan公司
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徐光喜
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理查德·尤尔
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1997年7月15日收到；1997年9月12日修订
摘要
Bax是Bcl-2蛋白家族的一员，通过一种未知机制加速细胞凋亡。最近有报道称Bax是一种与细胞器相关的完整膜蛋白，或通过Bcl-2或胞浆中的可溶性蛋白与细胞器结合。为了探索Bcl-2家族成员在活细胞中的定位，将绿色荧光蛋白（GFP）与NH融合2Bax、Bcl-2和Bcl-X的终点L（左）在活的Cos-7肾上皮细胞和L929成纤维细胞上进行的共聚焦显微镜显示GFP–Bcl-2和GFP–B cl-XL（左）具有点状分布并与线粒体标记共定位，而GFP–Bax在整个细胞液中广泛存在。光漂白分析证实GFP–Bax是一种可溶性蛋白质，而细胞器结合的GFP–Bcl-2则相反。GFP–Bax的弥散定位不随Bcl-2或Bcl-X高水平的共表达而改变L（左）然而，在诱导凋亡后，GFP–Bax在细胞内移动到点状分布，部分与线粒体共定位。一旦启动，Bax运动在30分钟内，即细胞收缩或核凝结之前完成。从GFP–Bax中去除COOH末端疏水结构域可抑制细胞凋亡过程中的再分配，并抑制Bax和GFP–Bax的致死活性。这些结果表明，在发生凋亡的细胞中，Bax的细胞内定位发生了早期的剧烈变化，可溶性Bax重新分布到细胞器对Bax促进细胞死亡似乎很重要。
P（P）程序化的在多细胞生物中，细胞死亡对许多组织的正常发育和维持至关重要。细胞程序性死亡的一种形式，即凋亡，其形态和生化特征包括细胞膜起泡、细胞体积减少、核浓缩和DNA的核小体内裂解(37).
Bcl-2相关蛋白家族在细胞凋亡的调节中起着关键作用。单个家庭成员可以阻止或促进程序性细胞死亡(38). 三个具有广泛特征的哺乳动物家族成员是抗凋亡基因bcl-2基因和bcl-X公司L（左）和促凋亡基因巴西。体内研究表明，每个基因都有一种单一的蛋白质产物：Bcl-2α，一种26kD蛋白质(36)；Bcl-X公司L（左），一种27-kD蛋白质(9)；和Baxα，一种21-kD蛋白质(27). （以下将Bcl-2α和Baxα称为Bcl-2和Bax。）Bcl-2，Bcl-XL（左）和Bax在其COOH末端均含有一段长度约为20个氨基酸残基的疏水性氨基酸。这些尾巴中几乎没有氨基酸序列保持，但根据亲水性图谱分析，推测它们在将这些蛋白质锚定到细胞器膜中起作用(2,25). Bcl-2定位于核膜、内质网和线粒体外膜(3,12,19,24). 从Bcl-2中去除COOH末端的尾部会改变细胞液的亚细胞定位，但尚不清楚尾部的去除对Bcl-2抑制凋亡的能力有什么影响(1,2,13,35). Bcl-X公司L（左）也定位于线粒体的外膜(9). 尽管对Bax的定位研究较少，但Bax被认为是靶向细胞器膜的(11)尤其是线粒体(39)通过COOH末端疏水区域。然而，最近有报道称，在BHK细胞中，Bax的低水平表达具有点状的细胞器定位，而免疫细胞化学显示，Bax过表达呈弥漫的细胞溶质分布(32). 在该研究中，高水平Bcl-2的共表达导致Bax呈点状分布，表明Bax与细胞器膜的结合需要Bcl-2。在另一项最近的研究中，通过亚细胞分离发现，小鼠胸腺细胞、脾细胞和HL-60人白血病细胞中的内源性Bax主要是可溶的，与膜结合的Bcl-2分开定位(14,15). 在胸腺细胞凋亡过程中，发现有很大一部分Bax从细胞质重新分布到细胞膜。后一发现增加了凋亡过程中Bax亚细胞定位调控的可能性(14).
以前对Bax定位的研究依赖于细胞固定或分离。在本研究中，我们检测了Bax在活细胞中的定位。编码人类Bcl-2、Bcl-X的基因L（左）和Bax与绿色荧光蛋白（GFP）融合，1本文报道了这些融合蛋白在健康细胞和凋亡细胞中的共焦显微镜定位。描述了与凋亡期间发生的其他细胞事件相关的GFP–Bax定位变化的时间进程。此外，Bcl-2和Bcl-X的影响L（左）检测Bax定位的过度表达。我们已经从Bax、Bcl-2和Bcl-X中删除了COOH末端疏水尾L（左）研究这些区域在亚细胞定位中的重要性，以及这些蛋白质影响细胞死亡的能力。
材料和方法
除非另有说明，试剂购买自西格玛化学公司。（密苏里州圣路易斯）。
表达式构造的生成
人Bcl-2、Bcl-X的全长和COOH-末端截断形式（ΔCT）L（左）、和Bax通过PCR扩增合成并克隆到pcDNA-3哺乳动物表达载体（Invitrogen，Carlsbad，CA）中。GFP融合构建采用了类似的策略，使用C3-EGFP质粒(克隆泰克实验室。加利福尼亚州帕洛阿尔托）。人类的cDNAbcl-2基因，人类bcl-X公司L（左）、和人类bax（巴克斯）分别是C.M.Croee（宾夕法尼亚州费城杰斐逊癌症中心）、C.B.Thompson（密歇根州立大学和伊利诺伊州芝加哥大学）和S.J.Korsmeyer（密歇根州立大学和密苏里州圣路易斯华盛顿大学）的礼物。这个bcl-2基因ΔCT，bcl-X公司L（左）ΔCT，以及bax（巴克斯）构建的ΔCT形式编码分别在COOH末端缺失23、25和21个氨基酸的蛋白质。对于每个基因的全长结构，合成了一个限制性内切酶位点紧邻起始密码子（正向引物）或终止密码子（反向引物）的寡核苷酸(GIBCO巴西雷亚尔，盖瑟斯堡，医学博士）。对于截断型（ΔCT），反向引物引入了一个终止密码子。使用Pfu聚合酶（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳）进行PCR，以减少错误。PCR片段被纯化，用限制性内切酶消化，并连接到表达载体中。这个bcl-X公司L（左）,bcl-X公司L（左）ΔCT,bcl-2基因，以及bcl-2ΔCT在pcDNA3和C3-EGFP多克隆区的XhoI和XbaI位点之间亚克隆基因。这个bax（巴克斯）和baxΔCT在pcDNA3和C3-EGFP多克隆区的HindIII和EcoRI位点之间亚克隆基因。使用Sequenase 2试剂盒（美国生化公司，俄亥俄州克利夫兰）对所有结构进行测序。
细胞培养和瞬时转染
L929小鼠纤维肉瘤细胞系和Cos-7绿猴肾上皮细胞系（美国型培养物收藏馆，马里兰州罗克维尔）分别在最低必需培养基、Earle’s平衡盐溶液和DME中培养，每种细胞系均添加2 mM谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、2.5 mM丙酮酸钠、100 U/ml青霉素、，100μg/ml链霉素（全部来自马里兰州罗克维尔的Biofuids Inc.），50μg/ml庆大霉素(GIBCO巴西雷亚尔)和10%热处理FCS。细胞在37°C和5%CO中培养2然后使用0.05%胰蛋白酶/0.02%versene（Biofuids Inc.）每周分割两次。在准备转染时，细胞以2×10的密度进行电镀5六孔组织培养板中每孔的细胞数(Becton Dickinson实验室马萨诸塞州贝德福德）。一天（Cos-7）或两天（L929）后，使用阳离子脂质LipofectAmine瞬时转染细胞(GIBCO巴西雷亚尔)如制造商所述，每孔使用2μg质粒DNA和8（L929）或10μl（Cos-7）LipofectAmine。在无血清培养基中培养5h后，加入等量的含有2×正常FCS的培养基。转染后1d，将细胞清洗一次，置于正常生长介质中。然后将转染细胞再培养24小时，并通过显微镜观察。对于共转染实验（见图。)，遵循上述程序，除了每个孔总共使用4μg质粒DNA：1个C3–EGFP–Bax和3个pcDNA3–Bcl-2或pcDNA3–Bcl-XL（左）.
GFP–Bax在Cos-7细胞中的分布不受Bcl-2共表达的影响。将含有Bcl-2和GFP–Bax的质粒以3:1的比例瞬时转染细胞，48小时后通过共焦显微镜检查。(A类)在与Bcl-2和GFP–Bax共同转染的Cos-7细胞中，GFP–Bax以与单独表达GFP–Bax的细胞无法区分的模式分布在整个细胞中。(B类)用α-人Bax 2D2和α-人Bcl-2 8C8单克隆抗体通过蛋白质印迹监测GFP–Bax和人Bcl-2在Cos-7细胞中的共表达。车道a是仅用pcDNA 3载体转染的Cos-7细胞裂解物。车道b是来自pcDNA 3–Bcl-2转染的细胞裂解物，以及车道c来自C3–EGFP-Bax和pcDNA 3–Bcl-2的共转染。箭头a,b条，以及c（c）代表GFP–Bax，其NH2-终端翻译变体和内源性猿猴Bax。棒材，20μm。
抗人Bcl-2单克隆抗体的制备
与人类Bcl-2的氨基酸41–54对应的肽（GAAPAPGIFSSQPGC；肽技术公司，马里兰州盖瑟斯堡）与马来酰亚胺激活的锁孔帽贝血蓝蛋白（KLH）偶联(皮尔斯化学公司。，Rockford，IL）通过半胱氨酸残基，符合制造商提供的协议。用肽-KLH结合物免疫小鼠，免疫反应小鼠的脾细胞通过PEG 4000与小鼠NS-1骨髓瘤细胞融合，并用组蛋白乙酰转移酶（HAT）培养基进行筛选，如前所述(15). 抗人Bcl-2抗体命名为αhBcl-2 8C8。
细胞裂解和Western印迹
将来自六孔板两孔的转染细胞用PBS洗涤一次，然后在含有1%Triton X-100的冷溶解缓冲液（PBS、25μg/ml苯甲基磺酰氟、1μg/ml亮氨酸蛋白酶和1μg/ml抑肽酶）中溶解。对于Western blotting，使用12%SDS-PAGE凝胶电泳分离20μl每个样品。凝胶被电转移到Immobilon-P上(Millipore公司。，Waters色谱法，Milford，MA）膜。在含有5%胎牛血清的PBS/0.05%吐温20中阻断印迹，并与适当的抗体：抗人Bcl-2 8C8、抗通用Bcl-X孵育L（左）2012年下半年(15)，或抗人Bax 2D2单克隆抗体(15). 用与辣根过氧化物酶连接的羊抗鼠F（ab'）印迹法检测一级抗体结合(Amersham公司。（伊利诺伊州阿灵顿高地），然后使用制造商描述的增强化学发光进行波段可视化(Amersham公司。).
共焦显微镜
如上所述，将用于共焦显微镜的细胞转染在用5μg/ml聚乙烯预处理的1.5厚度玻璃盖玻片上-我-赖氨酸。24–48小时后，通过与20 ng/ml线粒体特异性染料（Mitotracker Red CMXRos；Molecular Probes Inc.，Eugene，OR）和/或100 ng/ml双苯甲酰胺孵育30分钟，准备细胞进行显微镜检查，如个别实验所示。预处理后，将细胞转移到含有新鲜培养基的密封安装室中；在指定的实验中，该培养基添加了1–3μM staurosporine（STS）。在显微镜上收集图像（LSM 410型，40×1.2 NA Apochro物镜；纽约州桑伍德卡尔蔡司）。氪/氩激光的488 nm和568 nm线分别用于GFP和Mitotracker Red CMXRos的荧光激发，氩激光的364 nm线用于双苯甲酰胺染料的激发。使用气流培养箱将样品温度保持在35°C至37°C之间。
为了研究GFP融合蛋白的迁移率，通过用488nm激光线在全功率（无衰减）下扫描该区域，对细胞区域内的荧光进行光漂白，然后用低激光功率（10%功率，0.3%衰减）以10s的间隔扫描整个细胞，以监测荧光的恢复。按照所述计算荧光蛋白的流动分数(4)通过比较细胞中两个区域的荧光强度，一个在光漂白区内，另一个在其他地方，在光漂白前和光漂白后100 s（流动分数=100 s恢复后的比率/光漂白前的比率）。荧光恢复的时间进程是通过对细胞平坦区域内的16μm条带进行光漂白，然后监测条带内荧光恢复的情况来确定的（200张图像，间隔0.46秒）。
细胞活性测定
评估Bcl-2、Bcl-X全长和ΔCT形式的影响L（左）和Bax，对L929或Cos-7细胞进行共转染试验。将如上所述的孔板与一个包含pcDNA3中给定基因的载体构建物和第二个载体EGFP进行共转染(Clontech Laboratories Inc.公司。)，包含红移GFP基因。前者与后者的摩尔比为3:1，每个孔的DNA总量为4μg。否则，按上述方法转染细胞。转染后36–48小时，将细胞清洗两次，添加新鲜培养基，并通过荧光显微镜检查确定特定区域内GFP阳性细胞的数量。然后通过添加所示浓度的含有STS的培养基诱导细胞凋亡，并在接下来的24–42小时内定期评估同一区域内GFP阳性细胞的数量，以测试向NH中添加GFP对生物活性的影响2在Bcl-2家族成员的末端，对转染2μg合适全长或ΔCT基因并与GFP融合的细胞进行类似的检测，GFP插入C3-EGFP。对于每个构造，该分析重复三到四次。为了使转染效率的变化正常化，活力的变化表示为给定场中荧光细胞数量随时间减少的百分比。
结果
GFP–Bax是健康细胞中的一种细胞质蛋白，而GFP–Bcl-2和大多数Bcl-XL（左）与线粒体相关
我们检查了Bcl-2和Bcl-X的位置L（左）和Bax在单个活细胞中的表达。含有GFP的融合构建物已成功用于研究一些蛋白质的亚细胞定位(16,26,33). 编码高荧光红移GFP变体的基因(5)融合到编码人类Bcl-2、Bcl-X的cDNA的5′末端L（左）或Bax。用编码GFP–Bcl-2、GFP–B cl-X的融合构建物转染L929小鼠纤维肉瘤和Cos-7绿色猴肾上皮细胞L（左），和GFP–Bax。
这些瞬时表达的GFP连接融合蛋白在活细胞中的定位使用共焦显微镜观察。在两个Cos-7中（图。,一和b条)和L929电池（图。,一和b条)如前所述，GFP单独呈弥散分布，充满整个细胞(28). GFP–Bcl-2在两个Cos-7中都表现出点状分布模式，主要分布在细胞核附近的区域（图。,e（电子）和（f）)和L929（图。,e（电子）和（f）)细胞系。该分布与之前通过免疫荧光测定的Bcl-2定位相匹配(24,41)，并表明与细胞内的一个或多个细胞器有关。GFP–Bcl-X公司L（左）显示了一个明亮的点状分布，类似于GFP–Bcl-2叠加在较暗的漫反射背景上的分布（图。和,我和j个)表明单个细胞中存在可溶性和膜结合群体。这与Bcl-X的双重定位一致L（左）细胞分馏实验中的可溶颗粒和膜颗粒(14,15). 与GFP–Bcl-2和GFP–B cl-X的定位相反L（左），GFP–Bax在两个Cos-7中的扩散分布类似于GFP单独的扩散分布（图。,米和n个)和L929（图。,米和n个)单元格类型。
STS治疗前后活Cos-7细胞中表达的GFP融合蛋白的分布。转染后48小时，用共焦显微镜检查细胞。每个区域通过激光荧光进行可视化，以检测GFP(一,c（c）,e（电子）,克,我,k个,米，以及o个)，并通过DIC说明细胞形态(b条,d日,（f）,小时,j个,我,n个，以及第页). 本地GFP(一和b条)分布在未经处理的细胞中，显示出健康的形态。相反，GFP–Bcl-2(e（电子）和（f）)显示点状分布，主要为核周。GFP–Bcl-X公司L（左）(我和j个)似乎以类似于GFP–Bcl-2的主要点状模式分布，但也有微弱的弥漫荧光延伸至整个细胞。GFP-Bax公司(米和n个)在整个细胞中自由分布，其模式与GFP无法区分。用1μM STS处理6小时后，Cos-7细胞呈现凋亡的形态，包括细胞体积损失、突起收缩和细胞膜起泡。尽管有这些变化，天然GFP(c（c）和d日)仍然分布在整个细胞中。GFP–Bcl-2(克和小时)STS治疗后保留点状分布。GFP–Bcl-X公司L（左）(k个和我)STS处理也没有改变分布，主要以点状为主，背景为弥漫荧光。然而，GFP–Bax(o个和第页)在STS治疗后，分布发生显著变化，变得完全点状。棒材，20μm。
STS治疗前后活L929细胞中表达的GFP融合蛋白的分布。转染后48小时，用共焦显微镜检查细胞。每个区域通过激光荧光进行可视化，以检测GFP(一,c（c）,e（电子）,克,我,k个,米，以及o个)，并通过DIC说明细胞形态(b条,d日,（f）,小时,j个,我,n个，以及第页). 天然绿色荧光蛋白(一和b条)分布在健康细胞中。GFP–Bcl-2(e（电子）和（f）)显示点状核周分布。GFP–Bcl-X公司L（左）(我和j个)似乎既有点状部分又有弥散部分。GFP–Bax公司(米和n个)在细胞中自由分布。在用1μM STS处理6小时后，L929细胞会出现细胞体积损失、收缩和长时间起泡。本地GFP(c（c）和d日)STS治疗后发现遍及细胞，包括水泡。GFP–Bcl-2(克和小时)STS治疗后保留点状分布。STS治疗后，GFP–Bcl-XL（左）(k个和我)显示了以漫反射荧光为背景的点状分布。与Cos-7细胞一样，GFP–Bax(o个和第页)经过STS处理后，分布发生变化，变成点状。棒材，30μm。
我们在转染后36小时通过瞬时转染的Cos-7细胞的Western blot分析检测GFP融合蛋白的表达。这些裂解物的免疫印迹证实GFP–Bcl-2（图。,中间的,箭头a)，GFP–Bcl-XL（左）（图。,底部,箭头a)和GFP–Bax（图。,顶部,箭头a)尺寸合适。低分子量带（lanec（c）)代表原生Bcl-2、Bcl-XL（左）在所有裂解液中检测到Bax。额外的、意想不到的蛋白质带(箭头b)对于每个表达构建体检测到中等分子量的（图。). 当Bcl-2的COOH-末端截短形式时，也发现了这种中间分子量形式(车道c)，Bcl-XL（左）(车道e)和Bax(a车道)表达融合GFP并进行免疫印迹。与全长形式相比，所有三种COOH末端截短蛋白的预期分子量稍低（图。). COOH末端截短结构的高分子量和中分子量条带的分子量都稍低，表明中分子量的条带可能代表NH缩短的蛋白质2-融合蛋白的末端，GFP末端。因此，中等大小的条带可能是由GFP基因内部起始密码子启动的转录物或缺乏部分GFP分子的蛋白水解片段的表达引起的，因此它们可能会或可能不会发出荧光。
截短和全长GFP–Bax、GFP–Bcl-2和GFP–B cl-X的表达L（左）COS细胞中的融合蛋白。Bax（车道）的COOH终端截断和全长GFP融合构造一和b条)，Bcl-2（车道c（c）和d日)和Bcl-XL（左）（车道e（电子）和（f）)转染COS细胞。融合产物的表达通过用α人Bax 2D2、α人Bcl-2 8C8和α通用Bcl-X细胞裂解物的Western blotting进行监测L（左）检测Bax、Bcl-2和Bcl-X的2H12单克隆抗体L（左）分别是。箭头a是表达的融合产物。箭头b很可能是框架内NH2-终端翻译变体。箭头c代表内源性猴Bax、Bcl-2或Bcl-XL（左）与上述特定抗体发生交叉反应。
确定GFP与Bcl-2、Bcl-X的融合L（左）在STS诱导细胞凋亡后，我们比较了转染野生型cDNA构建物的L929或Cos-7细胞与转染GFP融合构建物的细胞的活性。如图所示。，GFP–Bcl-2的保护活性（图。
A类)和GFP–Bcl-XL（左）（图。
B类)L929细胞与野生型细胞相当。同样，GFP–Bax的活性似乎可以像野生型Bax一样有效地加速Cos-7细胞的细胞死亡（图。
C). 因此，在NH中添加GFP2-Bcl-2，Bcl-X的终点L（左）或Bax不会阻止其影响凋亡的能力。然而，NH中添加了大量蛋白质2末端可能改变Bcl-2家族成员调节细胞凋亡的效力或影响其细胞内定位。
野生型和COOH末端截短型Bcl-2家族成员瞬时表达对细胞活性的影响，有无GFP在NH融合2-终点站。细胞要么单独转染GFP融合构建物，要么与GFP和各种Bcl-2家族成员共同转染。转染后48小时，用STS处理细胞。从添加STS时开始，每隔一段时间对给定区域内的GFP阳性细胞数进行计数（每个实验通常在时间零点处有~500个GFP阳性的细胞）。细胞活力的变化显示为一个区域内发光细胞的数量，并表示为该区域时间零值的百分比。(A类)Bcl-2结构在L929细胞中表达。(n个=4）。pcDNA3矢量控制（⋄），Bcl-2(○), GFP–Bcl-2（•），Bcl-2ΔCT(□），GFP–Bcl-2ΔCT(▪), 和Bax(▵) (B类)Bcl-X公司L（左）在L929细胞中表达的结构。(n个=4）。pcDNA3矢量控制（⋄），Bcl-XL（左）(○), GFP–Bcl-X公司L（左）（•），Bcl-XL（左）ΔCT(□），GFP–Bcl-X公司L（左）ΔCT(▪), 和Bax(▵) (n个=4）。(C)Bax结构在Cos-7细胞中表达。(n个= 3). pcDNA3矢量控制（⋄），Bax(○), GFP–Bax（•），BaxΔCT(▵), GFP–BaxΔCT(（）。
研究GFP–Bcl-2和大多数GFP–B cl-X的细胞器的特性L（左）定位，我们用Mitotracker Red CMXRos处理瞬时转染的Cos-7细胞。如图所示。(a–c)GFP–Bcl-2的分布模式与线粒体标记的分布模式非常吻合，表明GFP–B cl-2的大部分与线粒体有关L（左）也分布于线粒体（图。,d–f日). 这些结果与早期定位Bcl-2和Bcl-X的发现相符L（左）使用其他成像方式检测线粒体膜(19,24). 与GFP–Bcl-2和GFP–B cl-X相比L（左），GFP–Bax在健康Cos-7细胞中不定位于线粒体（图。,g–i类).
GFP–Bcl-2和GFP–B cl-X的点状部分L（左）在Cos-7细胞中与线粒体共定位。用20 ng/ml Mitotracker Red CMXRos处理瞬时转染的Cos-7细胞，对线粒体进行染色，然后用激光荧光共聚焦显微镜进行检测。每个字段都用GFP的适当波长进行独立可视化(一,d日，以及克)和Mitotracker Red CMXRos(b条,e（电子），以及小时)然后将两幅图像叠加(c（c）,（f），以及我). GFP–Bcl-2主要定位于线粒体(a–c). 大多数GFP–Bcl-XL（左）也定位于线粒体，尽管有一个不点状的模糊弥散背景(d–f日). GFP–Bax在健康细胞中不定位于线粒体(g–i类). 棒材，20μm。
FRAP表明Bcl-2基本上不动，而Bax自由扩散
GFP–Bax的分布与GFP的分布相似，这导致我们研究GFP–Bax是否可以在细胞质内自由扩散，因为GFP已被证明是(34). 通过对细胞小区域的荧光进行光漂白，然后监测未漂白分子进入漂白区导致的荧光恢复，比较GFP–Bax和GFP的流动性。GFP和GFP–Bax都迅速进入漂白区（图。). GFP和GFP–Bax荧光恢复的时间过程基本相同（图。
B类)、和符合扩散动力学。相对于我们可以进行光漂白和监测回收率的速率，蛋白质扩散得太快，从而使我们能够准确地确定扩散常数。
健康人和STS治疗细胞中GFP、GFP–Bax和GFP–Bcl-2的FRAP分析。(A类)在单个处理细胞中显示荧光恢复。在表达GFP–Bax的健康Cos-7细胞中(a–d)，荧光在光漂白区迅速恢复。STS治疗后，Cos-7细胞带有点状GFP–Bax(e–h)光漂白后不再恢复。在表达GFP–Bcl-2的健康Cos-7细胞中(i–l)，在光漂白区域不会发生恢复。(B类)定量FRAP分析，以确定仅表达GFP、GFP–Bax和GFP–Bcl-2的细胞中的蛋白质流动性。绘制了光漂白后恢复期间的荧光强度随时间的变化曲线。恢复期间每隔0.46秒收集数据。GFP和GFP–Bax迅速恢复，时间进程与扩散一致。GFP–Bcl-2显示出最小的恢复，表明它在很大程度上是不动的。所有强度值均归一化为预漂白强度（I=100）和光漂白后立即的强度（I=0）。棒材，20μm。
对表达GFP–Bcl-2的细胞也进行了光漂白实验（图。). 与GFP和GFP-Bax相比，GFP-Bcl-2似乎在很大程度上是不动的。流动分数(回收率)GFP–Bcl-2在光漂白后100 s（按照材料和方法中的描述计算）为9至13%(n个=3），而GFP–Bax为45%至85%(n个=4），仅GFP为82±2%(34). GFP–Bcl-2的低流动性支持了这样一个结论，即它存在于离散的细胞器（线粒体）中，而不是存在于内质网等连续的膜系统中（其中荧光在光漂白后迅速恢复[4]）。
Bcl-2在Bax对接中的作用
最近的研究表明Bax(32)和坏(40)需要Bcl-2与细胞器膜结合。测试GFP–Bax在细胞器中的定位是否受到Bcl-2或Bcl-X内源性水平的限制L（左），表达Bcl-2或Bcl-X的载体L（左）与GFP–Bax载体共转染。如图所示。
A类，Bcl-2高水平共表达，通过细胞裂解物的免疫印迹证实（图。
B类)没有改变GFP–Bax的细胞质分布。当Bcl-XL（左）与GFP–Bax共存（数据未显示）。因此，我们发现Bax是健康细胞中的一种可溶性细胞溶质蛋白，即使在Bcl-2或Bcl-X水平升高的情况下也不能结合细胞器L（左）.
细胞凋亡过程中Bax的定位和迁移变化
内源性Bax和一些内源性Bcl-XL（左）在胸腺细胞凋亡的细胞分馏实验中从上清液迁移到膜颗粒(14). 为了研究活细胞中的这种现象，将天然GFP、GFP–Bcl-2、GFP-Bcl-X瞬时转染Cos-7细胞L（左）和GFP–Bax。表达每个结构的细胞用1μM STS处理，6小时后用共焦显微镜检查STS处理的和未处理的细胞。STS处理的细胞发生了细胞收缩和细胞膜起泡，这一形态学表明细胞凋亡（图。，比较b条,（f）,j个，以及n个具有d日,小时,我，以及第页). GFP–Bax显著改变了其细胞内分布，在细胞内从弥漫性细胞凋亡中重新定位（图。
米)点状图案（图。
o个). 仅GFP未观察到这种变化（图。
c（c）). GFP–Bcl-2的分布模式没有变化（图。
克)或GFP–Bcl-XL（左）（图。
k个)除了与细胞大小和形状变化相关的那些之外，在处理的细胞中观察到了。可溶性GFP–Bcl-X的重新分布是可能的L（左）由于过度表达GFP–Bcl-X的能力，在该系统中在一定程度上减少L（左）抑制细胞凋亡（图。
B类). 使用另一种细胞系L929成纤维细胞进行的类似实验证实，GFP–Bax在凋亡过程中经历了从弥散分布到点状分布的转变，而GFP–Bcl-2和GFP–B cl-X的定位模式L（左）基本保持不变（图。).
表达GFP–Bax的Cos-7细胞发生凋亡时的线粒体染色表明，大部分GFP–Bax附着或进入线粒体（图。,a–c). 然而，由于也有Bax凝集的部位对线粒体没有染色，因此在诱导凋亡时，GFP–Bax也可能定位于其他细胞器，或者在凋亡期间线粒体失去其Mitotracker Red CMXRos染色。
STS处理后，GFP–Bax与Cos-7细胞线粒体共定位。瞬时表达GFP–Bax的Cos-7细胞用1μM STS诱导凋亡，用20 ng/ml Mitotracker Red CMXRos染色线粒体，4h后用激光荧光共聚焦显微镜检查。在GFP的适当波长下，通过激光荧光共焦显微镜独立显示显示的场(一)和Mitotracker Red CMXRos(b条)，然后将两幅图像叠加(c（c）). 虽然大多数点状GFP–Bax似乎定位于线粒体，但也有GFP–Bax点状但不标记线粒体染料的区域(c（c）,箭头). 棒材，20μm。
STS处理诱导Bax向细胞器的再分配与Bax迁移率的降低有关（图。). 在GFP–Bax具有点状（线粒体）定位的细胞上进行的FRAP实验表明，流动分数为10至30%(n个=2），而未经处理的细胞为45%至85%。因此，点状形式的GFP–Bax的流动性低于弥漫形式的GFP-Bax，这与凋亡期间Bax从细胞质分布到膜结合的模型一致。
细胞凋亡过程中Bax再分布的时间过程
为了将GFP–Bax定位转移的时间与凋亡过程中发生的其他形态学事件联系起来，在STS诱导的细胞死亡过程中，对表达GFP–Bax的单个Cos-7细胞进行共焦显微镜观察。GFP-Bax在单个细胞内的定位在启动后的约30分钟内迅速发生变化（图。,c–e类). 给定场中的不同细胞可能在不同时间开始GFP–Bax重新分布过程，如图所示。当GFP–Bax开始重新分布时，用微分干涉对比（DIC）显微镜观察时，细胞的整体结构几乎没有变化（图。
小时)或通过显示细胞-基质相互作用的干涉反射显微镜（未显示数据）。在Bax重新分布开始后的10-30分钟，细胞收缩首先通过DIC成像变得明显（图。,我和j个，箭头）。
GFP–Bax重新分布发生在与凋亡相关的细胞收缩之前。在添加1μM STS后，随时间观察含有三个表达GFP–Bax的活Cos-7细胞的区域。在每个时间点，通过激光荧光对该区域进行可视化，以检测GFP–Bax(a–e和k–o（k–o）)，并通过DIC说明细胞形态(f–j和p–t型). 添加STS后经过的时间显示在每个激光荧光板的角落。在添加STS后1 h，24 min，首次检测到GFP–Bax的重新分布，这两个细胞朝向视野顶部(c（c）). 细胞形状的变化在12–24分钟后第一次变得明显，细胞轮廓的收缩证明了这一点(箭头,我和j个). 请注意，在这些时间点，最底层的细胞尚未启动GFP–Bax重新分布或细胞收缩。GFP–在2小时36分钟时，最下面的细胞首次检测到Bax重新分布(n个). 棒材，20μm。
表达GFP–Bax的细胞与双苯甲酰胺核染色剂（Hoechst 33342）孵育，双苯甲胺标记DNA，通常用于检测凋亡特征的核变化。在低浓度下，这种染色剂可以用于研究DNA在活细胞甚至分裂细胞中的位置，而不会影响细胞的活力(8). 双苯甲酰胺染色后，用STS处理细胞以诱导凋亡。如图所示。当GFP-Bax最初开始再分配时，没有证据表明核变化。在GFP–Bax转变开始后的～3小时，可以在细胞核中看到更不均匀的双苯甲酰胺染色模式（图。
e（电子）)，暗示核凝结。这逐渐发展为核碎裂，在GFP–Bax重新分布开始后的12小时内明显可见（图。
（f）). 因此，GFP–Bax分布的改变似乎是细胞凋亡的早期事件，先于与细胞凋亡相关的几个已确定的形态学变化。
GFP–Bax再分布先于核碎裂。在添加1μM STS和100 ng/ml双苯甲酰胺核染色剂后，随时间观察含有三个表达GFP–Bax的活Cos-7细胞的区域(a–e). 在每个面板中，使用适当波长的激光荧光共聚焦显微镜来观察GFP(绿色)和双苯甲酰胺(蓝色). STS添加后经过的时间显示在每个面板中。15小时后(（f）)细胞显示与凋亡相关的细胞核碎片。棒材，20μm。
Bax再分布需要COOH末端疏水区
COOH末端疏水区，跨越Bcl-2、Bcl-X的最后20–24个氨基酸L（左）Bax被认为是将这些蛋白质定位在细胞器膜上的锚定物。由于我们的结果表明Bax仅在诱导凋亡时定位于细胞器，因此我们研究了COOH末端在Bax转运中的作用。GFP–Bcl-2的ΔCT结构（图。,一和c（c）)，GFP-Bcl-XL（左）（图。,e（电子）和克)和GFP–Bax（图。,我和k个)当在Cos-7或L929细胞系中表达时，它们在健康细胞中均呈弥散分布，与整个胞浆的定位一致。凋亡诱导不会导致任何细胞系中ΔCT结构的明显重新分布（图。). 这表明COOH末端可能不仅在锚定Bcl-2和Bcl-X中发挥关键作用L（左）健康细胞中的细胞器，以及在凋亡细胞中观察到的Bax的介导细胞器关联。
STS处理前后缺乏COOH末端疏水结构域的GFP融合蛋白的分布。用合适的构建物瞬时转染Cos-7和L929细胞，48小时后用共焦显微镜检查。每个区域通过激光荧光显示以检测GFP。在两个健康的Cos-7细胞中(一)和L929电池(c（c）)，ΔCT GFP–Bcl-2弥散分布于整个细胞液中。同样，在健康的Cos-7细胞中(e（电子）)和L929电池(克)，ΔCT GFP–Bcl-XL（左）弥散分布于整个细胞液中。最后，在两个健康的Cos-7细胞中(我)和L929电池(k个)，ΔCT GFP–Bax弥散分布于整个细胞液中。用1μM STS处理表达截短GFP融合蛋白的细胞，6小时后在两个Cos-7细胞中进行检测(b条,（f），以及j个)和L929电池(d日,小时，以及我)STS处理后，截短的蛋白质没有重新分布。棒材，20μm。
COOH末端尾部的缺失减弱了Bcl-2、Bcl-X的影响L（左）和Bax对细胞活性的影响
如果Bax插入细胞器是促死亡活性所必需的，那么BaxΔCT相对于野生型Bax而言，其增强细胞凋亡的潜力将降低。Bax、Bcl-2和Bcl-X的ΔCT结构的生物活性L（左）在细胞活性测定中，比较了融合到NH的GFP和不融合GFP的全长基因2用STS诱导细胞凋亡时每种蛋白质的末端。如图所示。,A类和B类，适用于Bcl-2和Bcl-XL（左）COOH末端疏水结构域的缺失导致L929细胞的凋亡保护降低。对于Bax，COOH末端结构域的缺失也导致野生型和GFP-连接蛋白加速Cos-7细胞凋亡的能力急剧下降（图。
C)和L929单元（数据未显示）。这些结果表明，COOH末端疏水结构域对Bax功能很重要，将Bax在凋亡过程中重新分布到细胞器的能力与其死亡加速活性联系起来。
讨论
Bax促进哺乳动物细胞程序性细胞死亡(18,27). 然而，Bax的表达本身，至少在生理水平上，对细胞来说并不是致命的。例如，交感神经元表达高水平的bax（巴克斯）mRNA，但除非去除生长因子，否则不会发生凋亡(6). 正如最初的特征，即使稳定过度表达Bax的细胞也能正常增殖(27)Bax只会在外部信号（如白细胞介素-3退出）后加速细胞死亡。Bax的蛋白水平在细胞凋亡过程中没有变化(14,27)Bax的翻译后激活可能发生在细胞凋亡过程中。我们的研究结果表明，Bax活性可能在细胞内定位水平上受到调节，Bax在诱导凋亡后，但在核碎裂之前移动到细胞器的膜上。从COOH末端消除21个氨基酸可以防止Bax的再分配，并消除Bax促凋亡活性，使细胞器结合与生物活性相关。
与细胞溶质GFP–Bax相比，GFP–Bcl-2在健康细胞中呈点状分布，与线粒体标记物非常吻合。GFP–Bcl-X公司L（左）显示了一种混合模式，这表明尽管大部分蛋白质与线粒体有关，但大量蛋白质在胞浆中扩散。在细胞分馏研究中，这种可溶性Bcl-XL（左）在健康细胞中发现，在凋亡过程中，细胞重新分布与细胞膜相关(14). GFP-Bcl-2或GFP-Bcl-X的分布没有变化L（左）添加STS后。然而，GFP–Bcl-X的水平L（左）在转染实验中足以延迟甚至阻断细胞凋亡（图。)；因此，GFP–Bcl-XL（左）可能实际上阻止了细胞内环境的改变而导致其重新分布。进一步的实验将有必要探索GFP–Bcl-X的细胞内分布L（左）在凋亡过程中，可能通过使用Bcl-X的凋亡途径L（左）不敏感。
对于本文检测的所有三个Bcl-2家族成员，COOH末端缺失消除了GFP标记蛋白与细胞器结合的能力。Bax重分布对COOH末端疏水结构域的依赖性表明，Bax在凋亡过程中可能发生构象变化或其他修饰，使先前无法进入或堵塞的疏水性尾插入膜中。值得注意的是，白喉毒素的易位结构域与Bcl-X具有结构同源性L（左）显示出从可溶性状态转变为膜相关状态的类似能力。在白喉毒素易位域的情况下，这种插入是由低pH值触发的构象变化驱动的(7,30). Bax插入膜的过程是如何控制的，目前尚不清楚。一个有趣的候选者是磷酸化：最近描述了一种涉及磷酸化的调节机制，它影响凋亡启动子Bad的定位和活性(40)，Bcl-2的磷酸化被建议调节其功能(10,17,22).
我们的发现与之前的报告相冲突，这些报告表明Bax构成性地定位于细胞器膜（有关综述，请参阅参考文献29). 对这种差异的一个可能解释是，在早期的研究中，Bax定位是在Bax的过度表达足以导致细胞凋亡而没有明显诱导细胞凋亡的情况下进行的。在一项检测转化BRK细胞系中Bax定位的研究中，Bax过度表达直接导致细胞死亡(11). Bax定位于线粒体的最新研究(39)据报道，含有全长Bax的融合蛋白的表达对酵母细胞是致命的，去除COOH末端会破坏Bax杀死酵母细胞并定位于酵母线粒体的能力。我们发现阳离子脂质转染程序本身可以触发细胞凋亡（Wolter，K.G.和X-G。Xi，未发表的观察结果）。GFP-Bax中COOH末端尾部的缺失消除了转染相关死亡的增加。因此，高水平的全长GFP–Bax表达可能直接导致转染细胞死亡，特别是如果这种表达紧随转染过程的细胞应激。也许之前对细胞器定位Bax的一些观察是在进入凋亡程序的细胞上进行的。这些报告和我们自己的数据一致表明Bax在细胞器中的定位是其促进死亡能力的一个重要方面。
然而，我们对Bcl-2在Bax定位中的作用的研究结果与Shibaski及其同事的研究结果明显不同(32)他观察到表达高水平Bcl-2的BHK细胞中可溶性Bax重新分布成点状。在我们的系统中，没有证据表明Bax在Bcl-2或Bcl-X驱动的膜上定位L（左）共表达。这与Bax和Bcl-X的早期发现一致L（左）在健康细胞中不形成异二聚体(15).
最近的报道表明，Bcl-2家族成员在细胞凋亡过程中控制线粒体细胞色素C和凋亡诱导因子的释放，并通过半胱氨酸天冬氨酸酶激活参与细胞死亡(20,21). 据报道，Bcl-2的过度表达可以阻止细胞色素C的线粒体释放，从而防止细胞凋亡(38). 考虑到Bcl-X之间的结构连接，这些结果很有趣L（左）白喉毒素易位域。该结构域能够形成跨膜离子通道，并且被认为可以通过多重聚合形成孔，介导白喉毒素催化结构域跨膜转运。Bcl-X公司L（左）和Bcl-2已被报道形成跨膜通道(23,31). 在这种情况下，Bax插入细胞膜后，Bax可能会形成通道或孔，允许从线粒体内释放细胞色素C等因子，以传播凋亡途径。该模型不排除Bax与Bcl-2和Bcl-X的相互作用L（左）膜插入后。未来，阐明调控Bax插入细胞器膜的触发因子以及膜结合Bax的分子后果将是至关重要的。
致谢
感谢C.Croce、C.Thompson和S.Korsmeyer赠送Bcl-2、Bcl-XL（左）和Bax基因。我们感谢R.Kocher、J.Castelli、X.-H.Liu、C.Ng和P.Johnson的帮助，以及L.Marrone（均来自国立卫生研究院[NIH]、Bethesda，MD）和K.Wood（Trevigen Inc.，Gaithersburg，MD，）阅读手稿。
本文中使用的缩写
| ΔCT | COOH-终端截断 |
| 驾驶员信息中心 | 微分干涉对比度 |
| GFP公司 | 绿色荧光蛋白 |
| STS公司 | 葡萄孢菌素 |
脚注
K.G.Wolter得到了霍华德·休斯医学院-国立卫生研究院学者计划的支持。
将所有信件寄给Richard J.Youle，10号楼，5D-37室，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，20892。电话：（301）496-6628。传真：（301）402-0380。电子邮件：vog.hin.xileh@eluoy先生
工具书类
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