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.2000年12月1日；19(23):6361-70.
doi:10.1093/emboj/19.23.6361。

幽门螺杆菌空泡化细胞毒素N端34kDa片段靶向线粒体并诱导细胞色素c释放

加尔米奇 1, J拉索, 阿多伊, S卡格诺, J C香巴德, S污染物, V de Thillot公司, 我只是, V利玛窦, E Solcia公司, E Van Obberghen公司, P球拍
附属公司

幽门螺杆菌空泡化细胞毒素N端34kDa片段靶向线粒体并诱导细胞色素c释放

加尔米奇等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

致病细菌幽门螺杆菌产生细胞毒素VacA，与胃上皮损伤的发生有关。通过用编码VacA N端（p34）或C端（p58）片段的DNA转染HEp-2细胞，发现p34特异性定位于线粒体，而p58是细胞溶质。用纯化的线粒体在体外培养，VacA和p34（但p58没有转移到线粒体中）。微量注射编码VacA-GFP和p34-GFP的DNA，而不是GFP-VacA或GFP-p34，通过凋亡诱导细胞死亡。用p34-GFP或VacA-GFP瞬时转染HeLa细胞可诱导线粒体释放细胞色素c，并激活执行者caspase 3，这由聚ADP-核糖聚合酶（PARP）的裂解决定。通过联合转染编码Bcl-2的DNA（已知可阻断线粒体依赖性凋亡信号），可特异性对抗PARP的切割。这些观察结果与体内VacA作用机制的相关性得到了以下事实的支持：纯化活化的VacA外用于细胞，诱导细胞色素c释放到细胞液中。

PubMed免责声明

数字

无
图1。通过DNA转染在HEp-2细胞中表达VacA嵌合蛋白。在CMV启动子的控制下，在pEGFP-C1和-N1载体中构建与GFP融合的包含VacA细胞毒素或毒素的各种片段的DNA构建体。数字是指成熟的VacA毒素氨基酸（对应于信号序列的前33个氨基酸不包括在内）。p34及其片段由空框表示，p58由阴影框表示。
无
图2。p34和p58的细胞质内表达。编码GFP–p34的DNA转染HEp-2细胞的共焦免疫荧光显微镜(A类)，GFP–第58页(C类)或GFP–VacA(E类)。表达的蛋白用针对p34的抗体染色(B类)和VacA的C端子部分(D类和如果)。箭头表示存在未经转染的细胞，这些细胞与特定抗体无反应。棒材，10µm。
无
图3。转染GFP–p34定位于线粒体。HEp-2细胞，转染GFP-p34（绿色，A类)，用抗线粒体单克隆抗体1273（红色，B类)。合并后的图像显示黄色荧光，指示标记的共定位(C类)。棒材，10µm。
无
图4。GFP–p34的透射电镜免疫定位。使用抗GFP抗体和金胶粒对转染GFP–p34的HEp-2细胞进行免疫定位。箭头指示金颗粒的位置。
无
图5。兔网织红细胞系统中产生的VacA、p34和p58变性/天然蓝色凝胶电泳。对VacA、p34和p58进行电泳分析在体外兔网织红细胞裂解物的合成。(A类)在变性条件下（12%SDS–PAGE），观察到蛋白质的预期分子量。(B类)同样的蛋白质也在天然条件下被分解（使用蓝色天然-PAGE技术，具有3-16%的丙烯酰胺梯度）。该技术允许观察由VacA和p58（星号）形成的大低聚物。
无
图6。将p34、p58和VacA导入分离的线粒体(A类)p34、p58和VacA对蛋白酶K的敏感性。35用10 mM MOPS（pH 7.4）稀释网织红细胞裂解物中合成的S标记p34、p58或VacA，并在0°C下与增加量的蛋白酶K孵育10 min。通过添加PMSF停止蛋白质水解，将样品与Laemmli缓冲液混合，在SDS–PAGE上分离，并使用荧光成像仪进行分析。(B类)p34、p58和VacA与线粒体的结合和导入。含有p34、p58或VacA的网织红细胞裂解物与酵母线粒体在25°C下培养5或10分钟。为了测定线粒体输入（右侧面板），随后用蛋白酶K（30µg/ml）在0°C下处理样品10分钟。通过添加1 mM PMSF停止反应。线粒体再次分离后，样品在SDS-PAGE上分离并在磷成像仪上分析。(C类)进口的特殊性。线粒体导入效率的量化考虑了最初添加的p34、p58或VacA的总量。导入反应在与（B）相同的条件下进行10分钟，无论是否存在线粒体(D类)进口动力学。将含有p34（空圈）、VacA（填充圈）、固有线粒体蛋白孔蛋白（空方块）和AAC（填充方块）的网织红细胞裂解物与线粒体在导入缓冲液中孵育1、2、5或10分钟。蛋白酶K消化10分钟后，用SDS-PAGE对样品进行分析，以10分钟输入量为100%计算相对靶向效率。
无
图7。导入蛋白质在线粒体中的定位。为了在线粒体中定位导入蛋白质，使用肿胀或洋地黄素提取方案（如材料和方法中所述）破坏其外膜。(A类)膨胀。在有丝分裂体形成后，测定蛋白酶K处理后保持保护的p34/VacA导入量。在1 mM EDTA和10 mM MOPS（pH 7.2）中，以15分钟的渗透冲击获得线粒体。对标记蛋白AAC和Mge1进行免疫修饰，以跟踪线粒体外膜的开放程度。通过监测蛋白水解片段（星号）的形成来检测内膜蛋白AAC的可及性。使用基质蛋白Mge1作为标记物来测定内膜的完整性。对蛋白酶K保护蛋白的量进行量化，并将获得的无膨胀值设置为100%（对照）。(B类)洋地黄治疗。梯度浓度的洋地黄素（0至0.5%）在0°C下施用2分钟。绘制了每种洋地黄素浓度下蛋白酶K无法访问的p34、VacA、AAC和孔蛋白的百分比。
无
图8。VacA DNA微注射。HEp-2细胞微注射编码GFP–VacA的DNA(A类——C类)或VacA–GFP(D类——如果)。微注射后6 h观察微注射细胞（白色箭头）。使用相同的微注射制剂进行相控观察（A和D）和测定膜联蛋白V结合（B和E）。使用单独的盖玻片进行DAPI染色质染色（C和F）。棒材，10µm。
无
图9。p34 DNA微量注射。HEp-2细胞微注射编码GFP–p34的DNA(A类——C类)或p34–GFP(D类——如果)。微注射后6 h观察微注射细胞（白色箭头）。使用相同的微注射制剂进行相位对照观察（A和D）和膜联蛋白V细胞结合测定（B和E）。使用单独的盖玻片进行DAPI染色（C和F）。棒材，10µm。
无
图10。VacA和p34诱导细胞色素c（c）释放和PARP切割。(A类)细胞色素c（c）在胞浆中释放。用不同的VacA构建物转染HeLa细胞。过夜表达后，收集细胞并按照材料和方法中的描述制备细胞溶质部分。细胞色素c（c）western blotting检测到。(B类)PARP裂解。HeLa细胞与编码c-myc标记PARP片段的DNA以及GFP或p34结构体共同转染。过夜表达后，用c-myc（9E10）抗体进行免疫检测，对细胞进行裂解，并对细胞溶质提取物进行PARP裂解分析。箭头表示完整PARP碎片的大小，而箭头表示劈开的PARP碎片。其他谱带为非特异性交叉反应物，由对照非转染细胞中的抗myc 9E10抗体识别。(C类)通过DNA转染HeLa细胞过度表达Bcl-2或显性阴性FADD蛋白对p34-GFP转染诱导的PARP裂解的影响。(D类)细胞外应用纯化活化VacA（5µg/ml，24小时）对细胞色素的影响c（c）HeLa细胞胞浆的含量。对于阳性对照，如材料和方法中所述，用紫外线照射或1µg/ml staurosporine诱导细胞凋亡。
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    1. Atherton J.C.（1997）《幽门螺杆菌菌株类型的临床相关性》，肠道，40，701-703。-项目管理咨询公司-公共医学
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