BAX对线粒体的调节靶向性

质粒

采用标准的重组DNA操作，在T7启动子控制下，在pBluescript SK中构建编码小鼠BAXΔ1-19的cDNA；由此产生的翻译产物有一个起始的蛋氨酸，位于全长BAX构建物的原始蛋氨酸下游20个氨基酸。编码DHFR-BAX™的cDNA通过PCR在Bluescript SK中产生，并编码与BAX的COOH末端23个氨基酸（aa 169-192）融合的小鼠二氢叶酸还原酶。类似地，BAX-BCL-2™是通过将BAX的1–168氨基酸与人类BCL-2的218–239氨基酸融合而产生的。

大鼠心脏线粒体

将一只雄性Sprague-Dawley大鼠的心脏（约250 g）置于冰上约100 ml HIM缓冲液（0.2%wt/vol BSA，200 mM甘露醇，70 mM蔗糖，10 mM Hepes-KOH，1 mM EGTA，pH 7.5）中，挤压数次以挤出血液，并在15 ml芯管中转移至7.5 ml HIM。所有后续步骤均在4°C下进行。用Polytron均质器（Brinkmann Instruments Canada Ltd.，Mississauga，ON，Canada）将心脏均质化，在6.5的设置下运行1s。在Sorvall SS34转子中以1800 rpm的转速造粒细胞核和未破碎细胞10分钟。上清液以7000 rpm离心10 min。所得颗粒在HIM（减去BSA）中再次悬浮，以1800 rpm离心，以7000 rpm收集线粒体。线粒体颗粒在cMRM中重新悬浮（250 mM蔗糖、10 mM Hepes-KOH、1 mM ATP、5 mM琥珀酸钠、0.08 mM ADP、2 mM K₂高性能操作₄pH7.5），并在使用前调整为1 mM二硫苏糖醇。

培养细胞的线粒体

收集细胞，用PBS洗涤两次，悬浮在2ml HIM中，然后在6.5的设置下进行Polytron均质化四次，每次10秒。然后根据大鼠心脏方案分离线粒体。

线粒体

蛋白质导入活性有丝分裂体（外膜严重破坏的线粒体）的内膜和跨双层电化学电位保持完整，完全按照McBride等人（1995年）.

体外靶向线粒体蛋白

cDNA在³⁵无细胞兔网织红细胞裂解物系统中的S-蛋氨酸(Promega公司。（威斯康星州麦迪逊市）。对于标准线粒体蛋白导入反应，5μl翻译反应与20μl缓冲液a（20 mM Hepes-KOH，10 mM KCl，2.5 mM MgCl）孵育₂在30°C或37°C条件下，1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 m M二硫苏糖醇、pH 7.5）和25μl线粒体或有丝分裂体在cMRM（1 mg蛋白质/ml）中的培养30分钟至2小时。然后将导入反应分层在1×MRM（250 mM蔗糖、10 mM Hepes-KOH，pH 7.5）的500μl缓冲垫上，并在4°C的微型离心机中以最高速度离心4分钟。对于碱提取，将线粒体颗粒重新悬浮在新制备的0.1 M Na中（0.25 mg蛋白质/ml）₂合作_三pH 11.5，并在冰上培养30分钟。然后在气浮机中对膜进行造粒(贝克曼仪器加拿大公司，蒙特利尔，PQ，加拿大）在30 psi的压力下运行10分钟。用SDS-PAGE和荧光法对颗粒进行分析。对于包括凋亡细胞提取物（见下文）的导入分析，它取代了缓冲液A；用于进行提取的缓冲区（缓冲区A/ext）不影响导入。

凋亡细胞提取物

提取物在4°C下按照Liu等人（1996）做了一些小修改。简而言之，在含有1.3 mM柠檬酸钠和0.6 mM EDTA的PBS中采集人类KB上皮细胞。在缓冲液A/ext（50 mM管道、50 mM KCl、5 mM EGTA、2 mM MgCl）中清洗细胞颗粒₂，1mM二硫苏糖醇，20μM细胞松弛素B，pH 7.4），然后重悬于等体积的缓冲液A/ext.用装有B杵的惠顿玻璃匀浆器通过五个循环的冻融破坏细胞，中间穿插五次冲程，并在10⁵ 克在Beckman Ti75转子中放置1小时。产生的上清液含有10 mg蛋白质/ml(Liu等人，1996年)首先将40μl 2G8.B6抗细胞色素c抗体（7.7 mg蛋白/ml）与100μl蛋白a和蛋白G Sepharose的1:1混合物在200μl PBS中在4°c下再次悬浮4小时。对于对照反应，用40μl缓冲液A代替抗体。收集珠子，用缓冲液A洗涤，然后在4°C下与125μl KB细胞提取物孵育18 h。回收珠子并收集上清液。

凋亡细胞提取物体外刺激靶向线粒体的BAX

为了在体外检测BAX靶向线粒体，我们使用³⁵S标记的转录-翻译产物行李兔网织红细胞裂解物中的cDNA与大鼠心脏分离的完整线粒体结合。这是一个有充分记录的系统，它忠实地反映了不同线粒体蛋白质的体内输入，包括将完整蛋白质插入线粒体外膜(李和肖，1992年；McBride等人，1992年)。图中总结了用于这些测定的各种BAX构建体及其体外靶向能力。​图3。三.

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图3

BAX构建物及其体外线粒体靶向能力。ART域(灰色方框); TM公司(黑匣子); +, 目标能力；−，瞄准能力不足。显示了所示物种BAX的1–20氨基酸。有关其他详细信息，请参阅文本。

转录-翻译行李cDNA产生全长蛋白，以及一个显著的小约2 kD的产物，明显来自内部翻译起始，导致NH₂-终端截断BAX（指定BAXΔART）。然而，只有截短的BAXΔART是膜整合的，这是根据在碱性pH条件下获得的抗萃取性来判断的（图。​（图44 A类; 比较车道2和5)。该产品的插入对温度敏感；它发生在30°C，而不是4°C（图。​（图5，5，条车道2–5)，表示膜整合，而不是紧密但非特异性的结合(McBride等人，1992年)。对BAX序列的检查显示，密码子位置20处存在一个内部蛋氨酸（图。​（图3）。三)。通过删除密码子1实现了met密码子20的强制翻译起始，该密码子产生的产物在SDS-PAGE中与BAXΔART结合，并证明了温度敏感性膜整合（图。​（图44 B类)。因此，我们得出结论，全长BAX的氨基酸1–19含有一个结构域，称为ART，这是BAX在膜插入-无能状态下滞留所必需的。该结构域富含甘氨酸和羟基氨基酸残基（图。​（图3）。三).

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图4

凋亡细胞提取物支持BAX体外靶向线粒体。(A类)³⁵S标记的转录翻译产物行李将兔网织红细胞裂解物（BAX和BAXΔART）中的cDNA与来自大鼠心脏的纯化完整线粒体进行孵育，在标准蛋白导入反应中添加1 mM dATP（lanes3, 4, 6,和7)或1 mM dATP和200μg凋亡胞浆蛋白(提取; 车道4和7)体积为50μl。反应结束时，通过离心法回收线粒体，直接或用0.1M Na萃取后，通过SDS-PAGE和荧光照相法分析颗粒₂合作_三，pH 11.5(碱性; 车道5–7)。车道1，输入翻译产品的10%。(B类)如中所示A类除了进口是用行李Δ1-19cDNA转录产物（泳道2)如图所示，在4°C或30°C下，用0.1M Na提取线粒体后进行分析₂合作_三，pH 11.5（车道4和5)。(C类)³⁵S标记的转录-翻译产物PARP项目网织红细胞裂解物（5%体积）中的cDNA与（lanes）孵育2和三)或不带（车道1)100μg凋亡细胞溶质蛋白，总体积为20μl，存在（lane三)或不在（车道1和2)对1 mM dATP和等效部分的PARP 24-kD裂解产物的外观进行分析(24K帕尔普)通过12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光成像。(D类)如中所示A、，除进口前外，线粒体均用0.4mg/ml胰蛋白酶和50倍重量的大豆胰蛋白酶抑制剂处理（−胰蛋白酶前体; 柱2和4)或者在最后(+胰蛋白酶前体; 柱1和三)反应的结果。通过离心收集线粒体，并在存在的条件下进行导入（柱三和4)或不存在（列1和2)凋亡细胞溶质(提取)，并测定了碱不溶性全长BAX的相对量（最大设置为100）。

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图5

BAX体外靶向线粒体的失败取决于BAX TM.编码BAX的cDNA2–5)，细胞溶质二氢叶酸还原酶在其COOH末端与BAX的169–192氨基酸融合(DHFR-BAX公司™，车道7–10)和BAX，其中COOH末端24个氨基酸被BCL-2的相应结构域（氨基酸218-239）取代(BAX-BCL-2型™，车道12–15)在网织红细胞裂解物中转录和翻译³⁵用SDS-PAGE和荧光法分析S-标记的碱不溶性线粒体输入产物。车道1、6，和11如图所示，占输入翻译产品的10%。显示了BAX的COOH端24个氨基酸和BCL-2的22个氨基酸的序列（单字母代码）；粗体字母表示预测的TM。

重要的是，通过向导入的反应混合物补充KB上皮细胞产生的凋亡细胞提取物，克服了全长BAX体外靶向线粒体的无能。该提取物根据Liu等人（1996），涉及细胞在低渗培养基中的冷冻/解冻和均质化循环，导致线粒体肿胀，并因外膜破裂而释放细胞色素c。由此产生的高速细胞溶质上清液含有内源性前蛋白酶，其激活可通过添加dATP并在37°C下培养提取物来实现，从而导致caspase-3死亡底物聚ADP-核糖基聚合酶（PARP）的诊断性裂解；Liu等人，1996年)。这种提取物在导入反应中的存在刺激了结合（图。​（图44 A类，条车道三和4)以及全长BAX（车道）的耐碱膜插入6和7)，但未刺激BAXΔART插入（车道6和7)。在这些完整的线粒体（未显示）中，膜整合的BAX可被外源胰蛋白酶所利用，表明其插入了外膜。细胞提取物的凋亡活性通过证明其产生PARP 24-kD凋亡片段以响应dATP的能力而得到验证(Liu等人，1996年)（图。​（图44 C类)。非凋亡的高速细胞液不刺激BAX的输入，也不支持PARP的裂解（未显示）。此外，在缺乏凋亡提取物（未显示）的情况下，BAX未能靶向有丝分裂体（线粒体部分或全部剥离外膜），这表明不能用完整的外膜构成屏障来解释为什么不能导入BAX。最后，用胰蛋白酶对完整的线粒体进行预处理，以消除随后对凋亡提取物的反应中全长BAX的膜插入（图。​（图44 D类)，表明插入依赖于细胞器表面暴露的蛋白质。

体外调节BAX靶向需要ART和TM域

结果如图所示。​图44证明通过删除NH可以绕过体外靶向BAX的凋亡调节₂-末端ART结构域，导致蛋白质的结构性靶向。同样，用单体报告蛋白二氢叶酸还原酶（DHFR-BAX™）替换BAX的整个细胞溶质部分（氨基酸1–168），可以在没有凋亡细胞提取物的情况下导入完整线粒体的外膜，如碱性pH条件下耐萃取性的温度敏感性采集所示（图。​（图5，5，条车道6–10)。这表明BAX TM可以作为一个信号锚定序列发挥作用，在适当的环境下，该序列在靶向和膜插入方面独立活跃。它还表明，ART直接或间接地阻止了BAX TM在全长BAX分子背景下的这种信号锚定功能的表现。然而，重要的是，将含有TM的全长BAX的COOH末端22氨基酸替换为BCL-2的相应TM结构域，现在允许靶向先前的膜插入-无能的BAX（图。​（图5，5，条车道11–15)。因此，BAX在体外不能靶向线粒体的机制需要在分子中存在特定的BAX TM以及NH₂-终端ART域。

BAXΔART和BAX-BCL-2™表现出增强的细胞毒性

荧光素酶报告子作为COS-7和CHO细胞存活指标的联合转染实验(Ng等人，1997年)，血凝素表位（HA）-BAXΔART或HA-BAX-BCL-2™的表达导致荧光素酶活性比转染后24小时用HA-BAX获得的荧光素酶活性低三到五倍（未显示）。此外，当用抗HA抗体进行免疫荧光显微镜分析时，在24小时时，7.5%的细胞表达HA-BAX，而<1%的细胞表达微弱的HA-BAXΔART（未显示），表明大多数表达HA-BAX-ART的细胞之前已经死亡。因此，与体内HA-BAX相比，HA-BAXΔART增强的细胞毒性与体外ART结构域对BAX膜整合的抑制有关。

这项工作得到了加拿大国家癌症研究所和医学研究委员会以及CA49712的运营资助。J.N.Lavoie和A.Gross分别获得了医学研究理事会和欧洲分子生物学组织的博士后奖学金。