死亡受体结扎触发高尔基体和线粒体之间的膜混乱

分泌细胞器与线粒体的混合

我们综合运用显微镜、形态学和生物化学方法研究线粒体和高尔基体膜之间的相互关系(图1和​和2）。2). 荧光显微镜图像显示，在FasL治疗T淋巴瘤细胞1小时内，线粒体标记似乎与Golgi特异性膜标记物（如GM130）的免疫染色局部重叠(图1b). 重要的是，这发生在任何明显的凋亡迹象（膜联蛋白V阳性）和caspase-3明显激活之前（未显示，参见。¹⁶).

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图2

FasL处理后高尔基体膜与线粒体部分重叠。(一)Jurkat细胞分别用FasL处理30分钟（i）和60分钟（ii），并在等渗分离后用不同的膜标记物标记（参见。¹⁵). 用印度墨水进行全局蛋白质染色后，负荷相等（第二页底部，右）。(b条)通过使用最先进的Deltavision RT系统与带有×100物镜的自动奥林巴斯IX71显微镜耦合，获得了经过10次反褶积循环（软件Rx.3.4.3，Applied Precision）后获得的33个0.2 nm z截面的投影图像。首先用50nM MTR红对细胞进行染色，然后进行ERGIC53免疫染色。注意，未经处理的细胞中这种染色聚集，反映了高尔基体近端周围ERGIC元件的主要联系。¹⁷(c（c）)用Deltavision RT采集FasL处理1 h前后Jurkat细胞的荧光反褶积图像，如(b条). 首先用50 nM MTR对线粒体进行染色，然后用单克隆抗GM130（BD Pharmingen）进行免疫标记。通过15个反褶积循环获得33个0.2 nm z截面的投影图像，然后使用Deltavision RT软件（阈值设置为50 dpi–右侧面板）进行计算机辅助分色以实现证据共同定位。底部的插入物是分散高尔基染色合并图像中方框区域的放大图

与荧光显微镜结果一致，FasL处理细胞的透射电子显微镜（TEM）分析显示线粒体附近高尔基体元素的频率增加(图1c，左面板），定向小泡向线粒体萌芽(图1c和液泡明显与线粒体外膜融合(图1c，右侧）。为了定量确认这些微观结果，我们随后评估了FasL如何改变与分离线粒体相关的非线粒体膜蛋白的分布（参见。^5,15). FasL治疗逐渐增强了内胚体蛋白（如Rab5）和高尔基体相关蛋白（如ERGIC53）的线粒体水平，ERGIC5是连接高尔基体与内质网（ER）（ERGIC）的中间室的膜标记¹⁷) (图2ai). 当考虑其免疫印迹的上带时，ERGIC53在Fas活化后在轻膜（部分P20）中也增加，表明该蛋白广泛分散(图2aii，右侧）。这种再分配伴随着GM130（高尔基体膜的标准标记）的线粒体结合增加而发生¹⁸(图2ii，参见。图1b)它从通常保留在富含细胞质的部分中的轻质膜上移动。

接下来，我们使用反褶积显微镜改进了细胞荧光分析，这种方法特别适用于圆形T淋巴瘤细胞(图2–4). 与HeLa和其他呈现异质高尔基染色的贴壁细胞相反，^9,11,18超过90%的未经处理的Jurkat细胞显示出高尔基体膜的聚集染色。然而，在FasL处理30–40分钟后，大约三分之一的细胞显示分散的ERGIC53染色，部分与线粒体重叠，特别是向细胞外围(图2b). GM130免疫荧光结果进一步证实分泌细胞器和线粒体细胞器的接触增加(图2c). 尽管与ERGIC53染色相比聚集更紧密，但GM130染色同样显示FasL处理后1小时内扩散增加(图2c). 在表现出高尔基体扩散的细胞中，与线粒体标记物共同染色显示，GM130阳性元素与线粒体离散融合，尤其是在细胞外围（右面板为图2c). 因此，反褶积显微镜的数据与FasL处理细胞中富含线粒体的部分中GM130水平增加的生化证据相一致(图2a)以及TEM结果（参见。图1). 值得注意的是，GM130不仅与堆栈和顺式-高尔基元素，但也有可能与ERGIC重叠的动态隔间。¹⁸

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图4

膜交通的改变和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制的作用。(一)移动膜元件的双重染色是通过用Texas-red-conjugated HPA（外部，20μg/ml）同时作用于FasL（0.5μg/ml），如图3b将相同细胞的等分试样与50μ添加FasL之前的M z-VAD。固定后，用未标记的HPA（52μg/ml），渗透，然后用Alexa Fluor 488-HPA染色（静态HPA，2μg/ml，持续5分钟）。清洗和安装后，使用Deltavision RT反褶积显微镜获得图像，如图3c（40至60 z截面）。(b条)在与中相同的实验中，在稍后的时间点获得合并图像(一)并由34个z截面的去卷积投影导出。(c）FasL缺失和存在时Jurkat细胞HPA摄取和染色的时间进程（如一). 细胞在37°C下在含有10μg/ml德克萨斯红结合HPA；在指定的时间，细胞在冷态下离心，并在不含HPA的相同缓冲液中重新悬浮。计数后，将每个样品的40000个细胞装入四个孔中，并在平板读取器中测量残留荧光，如图3d双HPA染色的代表性图像，如(一)插入指定的培养时间。注意1小时内HPA摄取量的瞬时增加

FasL全球改变膜流量

我们的结果是在Fas信号基本上局限于内吞小泡及其周围的条件下获得的。^4,14因此，观察到的细胞内细胞器的变化(图1和​和2）2)会与膜交通事件交织在一起，例如胞饮作用增强。¹⁹为了评估子宫内膜交通的全球方面，我们开发了不同的荧光衍生物大蜗牛凝集素（HPA）是一种识别内质网和高尔基近端膜糖蛋白的凝集素，²⁰以及淋巴瘤细胞表面。²¹后一方面反映了在凋亡过程中被修饰的糖蛋白的运输，部分是为了刺激清除细胞的结合。²²

内膜的静态HPA染色与ERGIC53阳性膜部分重叠，特别是在“高尔基体周围”区域，同样在FasL处理后不久也显示扩散(图3a). 然而，分散的HPA标记元件减少了它们与分散的ERGIC膜的共同定位(图3a)表明Fas刺激改变了高尔基复合体不同内膜的外向交通。注意到FasL处理后HPA的表面染色增加，我们评估了外HPA在活细胞中的内吞内化。外源性HPA在血浆膜下迅速积累，但未产生明显的细胞毒性作用(图3b). 与另一种凝集素的内化相反，²³内吞HPA几乎没有标记未处理细胞的高尔基周围区域(图3). 然而，FasL处理大大增加了内化HPA的细胞内扩散，HPA与细胞周围的分泌细胞器逐渐混合，如与GM130-和ERGIC53标记膜的融合增加所示(图3b). 因此，在Fas连接后早期，表面的内化糖蛋白与分泌细胞器的元件混合。

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图3

FasL诱导内膜的整体运动。(一)ERGIC53免疫标记后，使用Alexa Fluor488-HPA（绿色）进行双重高尔基染色，与图2b，用红色荧光二级抗体证明。用60倍物镜采集31个z断面的投影图像，并用Deltavision RT软件进行10个周期的去卷积。HPA染色是在没有凝集素预吸收的情况下进行的，以清晰地定义细胞轮廓。注意FasL处理细胞中这种表面染色的扩散。(b条)德克萨斯州红结合HPA（HPA外部，20μg/ml）与FasL（0.5μg/ml）活细胞，并在37°C的RB中培养40分钟。清洗后，将细胞固定、渗透，然后用GM130（左）和ERGIC53（仅右合并图像）进行免疫染色，如图2c。获得了34个z截面的投影图像，如下所示(一). (c（c）)Jurkat细胞首先加载50 nM MTR（参见。图2)然后离心并附在盖玻片上，用未标记的HPA（52）固定并淬火μg/ml），渗透，然后用2μg/ml Alexa Fluor488-HPA（绿色）显示细胞内膜，优先于表面染色（与一). 获得了56个z截面的投影图像，如下所示(一). (d日)用从处理过的小鼠肝脏分离的线粒体定量测量HPA与膜的结合体外带FasL（参见。³⁸)在与淋巴瘤细胞诱导细胞死亡相同的条件下。德克萨斯红结合HPA（50μg/ml）与40μg/ml线粒体蛋白和8μg/ml高尔基蛋白（黑色直方图，从大鼠肝脏中纯化的高尔基是曼彻斯特大学M Lowe博士赠送的礼物）在37°C的分析缓冲液中放置30分钟。然后通过离心分离和清洗膜，在分析缓冲液中重新悬浮，并转移到四个孔中，以便在平板读取器中进行荧光测量（544 nm激发，590 nm发射）

在FasL处理的细胞中，HPA标记膜的分散也产生了与线粒体染色的弥散混合，增加了正常分离良好的膜的接近度(图3c和数据未显示）。为了验证这种高尔基体相关膜和线粒体膜的混合是否在T淋巴瘤以外的细胞中常见，我们将研究扩展到对FasL生理敏感的其他细胞，如小鼠肝细胞。¹⁵由于小鼠肝脏允许大量分离纯化的细胞器，我们可以在与先前细胞研究相同的条件下，将静态HPA结合到用FasL处理的肝脏分离的线粒体上(图3d). 显然，与小鼠肝线粒体膜相关的HPA结合蛋白增加，在FasL治疗1小时内达到最大值(图3d). HPA与纯化高尔基膜结合（黑色直方图图3d)为这些生化测量提供了阳性对照，与上述细胞数据一起表明，在Fas信号的早期阶段，HPA结合元件与线粒体混合。因此，在不同细胞系统中获得的结果有力地支持了Fas活化改变通过高尔基复合体的膜交通的概念，这可能是在细胞表面传播的新内吞门打开之后。^19,24为了详细研究这种可能性，我们扩展了对膜交通的研究。

细胞膜的双重HPA标记

为了测试FasL治疗是否扰乱了胞外途径的膜交通，这可以补偿膜表面的巨大变化，如与胞饮作用相关的变化，^19,25我们结合了外部HPA的内化(图3b)用HPA染色内部高尔基相关膜(图3a、c). 由此产生的双重HPA染色(图4)使参与表面识别事件的相同膜糖蛋白的全球流量可视化。²²

FasL治疗后，内化的HPA标记元素逐渐与分散在高尔基体周围区域的细胞膜融合，表明可接近通常被隔离的HPA结合位点(图4a、b). 加入FasL约30分钟后，合并染色最大(图4). 随后，内HPA标记的膜也分散在细胞外，或降低了其结合HPA的能力(图4b、c). 关于后者的可能性，主要表面糖蛋白如CD43的蛋白水解²²将比糖蛋白的增强去甲酰化更具相关性，²⁶考虑到瞬态变化的快速性(图4c)和有限的O（运行）-Jurkat细胞的糖基化能力。²⁷无论如何，双HPA染色的结果表明，FasL处理诱导了与内膜结合的糖蛋白的早期流出，这些糖蛋白与表面糖蛋白暂时混合，同时通过增强内吞作用进入细胞。

半胱氨酸蛋白酶对内膜运动的调节

如果观察到细胞膜和细胞器的变化(图1–4)是凋亡信号的表达，而不是Fas激活的副作用，它应该受到Fas介导死亡的主要执行者caspases抑制的影响。¹因此，我们研究了抑制激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是否影响FasL处理诱导的膜交通的早期变化。事实上，泛酶抑制剂苄氧羰基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮（z-VAD）明显影响双HPA染色(图4)在导致caspase-8活性完全抑制的条件下。¹⁶在不影响外部HPA内化的情况下，z-VAD预处理减少了随后与内部HPA阳性元素的混合及其向外移动(图4a、b)，还减弱了Fas介导的GM130标记膜的扩散(图5a). 因此，z-VAD抑制了驱动分泌内膜向外运动的反应，类似于其对与巨噬细胞结合的糖蛋白瞬时暴露的影响。²²

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图5

半胱氨酸天冬氨酸酶调节线粒体和其他细胞器的亚细胞变化。(一)在FasL处理40分钟后进行GM130的单一染色，如图2c，也在与50预孵育后μM z-VAD，但使用红色荧光二级抗体图1b。获得了35个z截面的投影图像，如下所示图3b. (b条)FasL处理1小时后，以及与50μM z-VAD持续30分钟。底部面板显示线粒体外膜标记蛋白的重嵌。(c（c）)在无FasL和有FasL的情况下，用FasL（1 h）处理的细胞的三色免疫荧光图像μ我喜欢CHO。IVM数据采集如下图1b

接下来，我们研究了分泌膜的向外运动和表面暴露是如何促成Fas诱导高尔基体和线粒体细胞器的混合的，这是我们早先发现的(图1–三). 为了改进我们的生化方法，我们从等渗匀浆的核颗粒中分离出广泛纯化的线粒体（核周线粒体，见材料和方法）。与其他方法获得的线粒体相比，这些（主要是核周）线粒体在未经处理的细胞中受到其他细胞器的有限污染（参见。图2a和​和5b）。5亿). FasL处理1h后，GM130以及内胚体蛋白Rab-5和Lamp-1的水平增加(图5b). 然而，在存在z-VAD的情况下，同样的处理减弱了GM130的水平，同时增强了早期和晚期内体膜蛋白的结合(图5b). 因此，FasL处理刺激不同细胞器与线粒体的连续混合，其中caspase抑制影响与分泌膜的结合。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制还诱导了聚集在线粒体上的膜交通的转移，有利于与内溶酶体结合(图5b和数据未显示）。这样看来，内膜流出受阻(图4和​和5a）5a级)产生了最初由Fas信号改变的膜交通堵塞，这一解释得到了细胞水平的结果的证实。例如，我们观察到在苄氧羰基-Ile-Glu-Thr-Asp-氟甲基酮（IETD）存在的情况下，FasL处理的细胞的免疫荧光图像中Lamp-1和线粒体染色重叠增加，后者是一种对caspase-8最特异的抑制剂(图5c).

虽然我们没有发现与细胞器混合相关的结构高尔基体蛋白的任何显著裂解(图5b囊性纤维变性。¹¹)，我们观察到一些与线粒体相关的BAP31断裂（结果未显示）。BAP31是一种丰富的内质网和高尔基体膜蛋白²⁸促进蛋白质在早期分泌细胞器中的保留^29,30并且已经报道被胱天蛋白酶-8切割。¹³然而，BAP31的裂解是有限的，并没有延伸到所有的膜组分，因此减少了其直接参与此处观察到的交通变化的可能性。

细胞培养与凋亡刺激

人T淋巴瘤细胞CEM和Jurkat在含有10%胎牛血清（FCS）的RPMI培养基中培养。如前所述培养HeLa细胞。¹⁶在无血清的情况下用重组FasL处理细胞，并通过双参数流式细胞术分析评估细胞凋亡水平^17,37使用FACScan仪器（美国新泽西州富兰克林湖区Becton Dickinson）。

半胱氨酸天冬氨酸酶测量

通过使用CaspGLOW荧光素活性胱天蛋白酶染色（MBL，Woburn，MA，USA）的流式细胞术在活细胞中评估胱天蛋白酶的激活。该分析使用与FITC偶联的细胞可渗透性caspase抑制剂IETD-fmk和DEVD-fmk作为荧光标记物，它们分别与caspase-8和-3的活性形式不可逆地结合。使用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的荧光底物对亚细胞组分进行互补分析。^17,38

器官分离

基本上如所述进行了等渗亚细胞分离。²⁰细胞在含有蛋白酶抑制剂混合物（进一步补充50μM z-VAD以最大限度地减少半胱氨酸蛋白酶在分馏过程中诱导的蛋白质降解）。核后上清液以10000×克将颗粒作为P10组分保存10分钟（悬浮在分析缓冲液中：0.12 M甘露醇、0.08 M KCl、1 mM EDTA、20 mM K-HEPES，pH 7.4），或重新离心以获得线粒体及其洗涤液（组分S3）。上清液在22000×克将轻质膜（组分P20）与大部分胞浆（组分S20）分离50分钟。从核颗粒中获得广泛纯化的线粒体，该核颗粒在分析缓冲液中重新均质，并在600×克.然后将上清液（0.4 ml）分层到1 M甘露醇的缓冲液上（0.6 ml，在分析缓冲液中覆盖0.1 ml 2%BSA）。9000×离心后克在4°C下悬浮15分钟，将颗粒重新悬浮在分析缓冲液中，以10000×克10分钟，然后在25分钟内重新悬浮μl含蛋白酶抑制剂的分析缓冲液。采用类似的程序对小鼠肝脏进行分级。³⁸蛋白质浓度评估后，³⁸馏分储存在−80°C。

免疫印迹法

细胞裂解物和亚细胞样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并按照前面所述进行免疫印迹。^15,38

器官染色

线粒体和其他细胞器在溶液中被特异染色（用于增强视频显微镜（IVM）分析³⁷)或在附着于聚赖氨酸涂层盖玻片之后³⁵带有线粒体示踪物（MTR绿色或红色）和荧光凝集素。²¹培养10–60分钟后，用4%多聚甲醛（PBS中的w/v）固定细胞，用Triton-X100渗透，封闭，用单克隆抗体孵育1小时，再次清洗，然后用与Alexa Fluor 488或罗丹明X结合的抗小鼠二级抗体孵养45–60分钟。有关荧光显微镜成像的详细信息，请参见图图例。用蛋白酶底物EnzChek对晚期溶酶体进行染色^®（董事会TR-casein；³¹参见的图例图6).

基于荧光的分析

荧光HPA与T淋巴瘤细胞的表面糖结合物结合后，对内吞作用进行评估。²¹测量在带有适当过滤器的平板读取器中进行（Fluoroskan Ascent，Thermo，Basingstoke，UK）。在FM1-43的荧光变化后也测量了细胞内吞³⁵在平板阅读器中，使用5×10⁵改良Ringer缓冲液（RB，含有145 mM NaCl、4.5 mM KCl、2 mM MgCl）中的每毫升细胞数₂，1 mM氯化钙₂、5 mM K-HEPES、pH 7.4和10 mM葡萄糖）和2-4μM格式1-43。使用底物罗丹明110-FR-双酰胺测定组织蛋白酶L的活性。³²如前所述进行其他组织蛋白酶分析。³⁴

我们感谢曼彻斯特大学的整个生物成像设施提供的支持，感谢马丁·洛和萨斯卡·伊万诺娃的投入。RK承认NIH/NHLBI（HL080192）和WM从卫生部获得的拨款。MDE研究得到BBSRC Grant BB/C508469的支持。