空泡毒素（VacA）是幽门螺杆菌-介导性胃病(1,2,4,5,14,15,17,18,20,22,24,25)。口服纯化的VacA可保护小鼠免受毒素诱导菌株的感染幽门螺杆菌(17)。然而，野生型VacA并不是合适的疫苗候选，因为该毒素会导致急性胃上皮糜烂和溃疡(21)。为了避免VacA的细胞毒性，Manetti等人通过甲醛处理使毒素失活(16)。甲醛处理的VacA保留了诱导家兔中和抗体滴度的能力，并保护小鼠免受小鼠适应的幽门螺杆菌(16)。总的来说，这些结果表明脱毒VacA可能是用于预防幽门螺杆菌感染和疾病。
虽然用于人类疫苗的蛋白质的化学灭活在历史上是有效的，但最近的努力集中在基因解毒蛋白质上(7,11,19)。基因解毒的策略包括鉴定可通过分子生物学程序改变的必需氨基酸，以消除毒素活性。与用修饰性化学物质处理毒素相比，基因操作更有可能保持被修饰蛋白质的抗原性。此外，基因解毒为生产具有相同保护特性的一致类毒素制剂提供了必要的质量控制。最后，重组类毒素有可能被纳入减毒活细菌或病毒疫苗。
尽管VacA是基因解毒的最佳候选药物，但将毒素细胞活性消融到可检测水平以下的点突变尚未被发现。而VacA的性质类似于细胞内作用的AB毒素(三,9,13)，既没有确定离散的生化活性，也没有确定细胞内的靶点。在缺乏明确的检测方法的情况下，我们在哺乳动物细胞中使用了一个瞬时转染系统来识别和表征VacA的最小细胞内活性片段（图。)导致退行性空泡化(9,26)。利用这个系统，我们启动了突变分析，以确定对毒素功能重要的离散域和残基。我们早期的研究表明，只有17个残基的截短使VacA失活(26)与一份独立报告一致，该报告指出缺乏前10个残基的VacA突变体在宿主细胞胞浆中不活跃(10)。此外，对氨基末端具有大缺失（>20个残基）的突变体的分析表明，残基6至26的内部缺失完全消融了毒素活性，并且在存在野生型毒素时表现出显性阴性表型(23)。由于这些数据表明VacA氨基末端对毒素活性很重要，我们对该区域进行了更详细的突变分析（图。).
成熟VacA的结构域。VacA由一个离散的氨基-末端结构域（p37）（白色条）和一个羧基-末端结构区（p58）（黑色条）组成。当在哺乳动物细胞内直接表达时，诱导细胞空泡化的最小VacA片段包括残基1至422。推测的VacA受体结合域定位于p58的中心区域（阴影区）。突出显示了VacA氨基末端区（残基1-17）的氨基酸序列，分析其对细胞内VacA介导的空泡化的重要性（灰色条）。
用pET-20b转染HeLa细胞，pET-20含有编码完全活性VacA多肽（残基1至741）的基因，该多肽是从60190毒株克隆的幽门螺杆菌或与绿色荧光蛋白（GFP）融合的VacA突变片段。本研究中使用的所有VacA突变形式都是通过使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）构建的，并通过在开放阅读框（Thermo sequence；Amersham Life Science）中对整个DNA序列进行测序进行确认。所有质粒在大肠杆菌并在转染实验前进行纯化。HeLa细胞首先被携带噬菌体T7 RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒（vT7）感染(9,12)。转染后20小时，通过量化细胞对中性红的摄取来分析HeLa细胞的空泡化(25)。使用该系统，50-80%的细胞清楚地显示出GFP荧光。在转染VacA-GFP的HeLa细胞中，仅在显示GFP荧光的细胞中观察到空泡化。
为了确定VacA氨基末端的哪些残基是必需的，构建了表达氨基末端截断为4、6、7、8、9和17个氨基酸的VacA片段的质粒。对转染这些质粒的HeLa细胞的分析表明，将氨基末端截短七个或更少的残基不会降低VacA从宿主细胞胞浆内介导空泡化的能力（图。A） ●●●●。与此形成鲜明对比的是，从VacA氨基末端删除八个或更多的残基导致蛋白质片段无法诱导可检测的空泡化（图。A） ●●●●。总之，这些结果表明，几乎整个VacA氨基末端都是毒素介导细胞内空泡化所必需的。
VacA氨基末端的突变分析。用表达VacA突变体的pET20b质粒转染HeLa细胞。20小时后，检测细胞对中性红的摄取。数据表示为转染了表达全长VacA-GFP质粒的HeLa细胞的中性红摄取百分比。这些实验中的阴性对照仅为GFP。对至少三次进行的三个单独实验的数据进行平均。（A） 截短分析：转染表达VacA片段的质粒的HeLa细胞的中性红摄取，该片段包含残基1-741、5-741、7-741、8-741、9-741、10-741或18-741，每个残基融合到GFP或单独的GFP。（B） 内部缺失分析：转染表达VacA片段的质粒的HeLa细胞的中性红摄取，该质粒包含残基1至741，其中残基2和3、5至8、7和8、10至13或14至17的内部缺失，分别与GFP或GFP融合。（C） VacA氨基末端的丙氨酸扫描诱变：转染表达VacA片段的质粒的HeLa细胞的中性红摄取，VacA碎片包含残基1至741，融合到GFP，每个具有以下替换之一：V6A、I7A、I8A、P9A、I11A、V12A、G13A、G14A、I15A和T17A。误差线表示标准偏差。
接下来，我们通过设计一系列内部缺失突变体-GFP融合构建物，验证了残基7下游的氨基酸对活性至关重要的假设。这些VacA突变体具有残基2和3、5到8、7和8、10到13或14到17的小缺失。对转染细胞的分析表明，缺失残基5至8、7和8、10至13或14至17的VacA突变体无法诱导细胞内空泡化（图。B） 而缺失残基2和3对VacA活性没有检测到影响，证实了截断结果。总的来说，截断和缺失分析的结果表明，VacA诱导的细胞空泡化对毒素氨基末端的小扰动很敏感。
VacA氨基末端的丙氨酸扫描。
为了鉴定对活性重要的VacA氨基末端的氨基酸，我们通过丙氨酸扫描诱变特异性地探测了残基6至17（图。)。每一个选定的残基都被单独改变为丙氨酸，从而消除了所有涉及β-碳以外原子的氨基酸侧链相互作用(8)。这是筛选大量氨基酸的一种特别有效的方法，因为丙氨酸的替代被认为是20种天然氨基酸中干扰最小的替代。对用编码每个点突变体的质粒转染的HeLa细胞的分析显示，丙氨酸取代Pro-9或Gly-14导致不能诱导细胞内空泡化的VacA的突变形式（图。C） ●●●●。值得注意的是，这些是已确定的第一个VacA点突变，可基本消除哺乳动物细胞中毒素诱导的空泡化。在缺乏已知的VacA的细胞内生物化学活性的情况下，目前还不能确定为什么残基9或14处的丙氨酸取代消除了毒素活性。尽管Western blot分析显示这两种突变形式在HeLa细胞中均表达为全长蛋白（数据未显示），但仍需进一步研究以确定VacA是否因残基9或14的取代而不稳定。
早期的研究表明，VacA氨基末端和羧基末端结构域，分别称为p37和p58，在HeLa细胞中以离散片段的形式共存时，表现出功能互补性(26)。为了测试残基9或14处的替换是否会破坏功能互补，我们用丙氨酸替换单独由p37组成的VacA片段中的脯氨酸9或甘氨酸14。当与转染HeLa细胞中的p58共表达时，p37（P9A）和p37（G14A）都没有对p58进行功能补充（图。)，进一步证实了残基9和14对VacA细胞内活性的重要性。V6A和V12A是对VacA介导的细胞内空泡化没有明显影响的两点突变（图。C） 也仅在p37片段中构建。与p37（P9A）和p37（G14A）相比，在转染HeLa细胞中与p58共表达时，这两种突变形式的p37在功能上补充了p58（图。).
p37点突变对p37-p58功能互补的影响。用表达VacA片段的单独质粒转染HeLa细胞，VacA碎片包含残基1至311（p37）或312至741（p58），或单独转染GFP。此外，还显示了与编码野生型p37、p37（V6A）、p27（P9A）、p37（V12A）或p37（G14A）的质粒以及编码p58与GFP融合的单独质粒共同转染的HeLa细胞的数据。20小时后，检测细胞对中性红的摄取。数据表示为转染了表达全长VacA-GFP质粒的HeLa细胞的中性红摄取百分比。对至少三次进行的三个单独实验的数据进行平均。误差线表示标准偏差。
虽然p37-p58互补的机制尚未阐明，但一个模型表明这两个片段在反式调节空泡化活性(26)。为了开始测试这个模型，我们研究了p37（P9A）或p37（G14A）是否可以阻断野生型p37和p58的功能互补。在这些竞争研究中，我们用编码p37和p58以及p37（P9A）、p37（G14A）或GFP的质粒三重转染HeLa细胞。当用编码p37、p58或GFP的三种质粒转染细胞时，我们通过计算荧光细胞（表示GFP的表达）和空泡细胞（表示p37和p58的表达）来评估转染效率。值得注意的是，在这些实验中，转染效率在40%到80%之间，这与用一个或两个质粒转染细胞的转染效率相似。而GFP的表达对p37-p58的互补性无明显影响（表)HeLa细胞转染过量表达p37（P9A）或p37（G14A）的质粒后，细胞空泡化明显减少。在转染了编码突变p37（P9A）的六倍摩尔过量质粒的细胞中，空泡化水平降低到只表达p37和p58的细胞的27%。突变型p37（G14A）在阻断p37-p58互补方面更加有效；在转染有编码p37（G14A）的六倍摩尔过量质粒的细胞中，空泡化水平降低到仅表达p37和p58的HeLa细胞的10%以下。突变型p37部分阻断p37-p58功能互补的发现支持了一个涉及两个域之间直接相互作用的模型。此外，这些结果表明，残基9或14的突变显然不能完全消除p37和p58在靶细胞内相互作用的能力。
表1
表达质粒的相对摩尔数一:
| 中性红摄取（平均OD530–410±标准偏差）b条 | 归一化空泡活性（%）c（c） |
|---|
| 第37页 | 第58页 | GFP公司 | 第37页（第9A页） | 第37页（G14A） |
|---|
| 1 | 1 | 0.17 | | | 0.92 ± 0.042 | 100 |
| 1 | 1 | 1 | | | 0.91 ± 0.055 | 98 |
| 1 | 1 | 6 | | | 0.93 ± 0.029 | 102 |
| 1 | 1 | | 0.17 | | 0.90 ± 0.091 | 96 |
| 1 | 1 | | 1 | | 0.86 ± 0.078 | 88 |
| 1 | 1 | | 6 | | 0.57 ± 0.044 | 27 |
| 1 | 1 | | | 0.17 | 0.88 ± 0.004 | 92 |
| 1 | 1 | | | 1 | 0.82 ± 0.072 | 79 |
| 1 | 1 | | | 6 | 0.48 ± 0.030 | 8 |
| 1 | 1 | | | | 0.92 ± 0.045 | 100 |
| | 1 | | | 0.46 ± 0.035 | 4 |
| | | | | 0.44 ± 0.017 | 0 |
总之，我们提供了证据支持VacA氨基末端的残基对毒物介导的细胞内活动很重要的假设。总的来说，我们的结果表明，几乎整个氨基末端对VacA活性至关重要(10,26)。此外，这些研究还发现了第一个完全消除毒素细胞内活性的VacA点突变。对这些非活性突变体的进一步研究可能会产生稳定、无毒的免疫原，用于疫苗中，这些疫苗可以有效预防胃溃疡和癌株幽门螺杆菌.
