跳到主页面内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.1997年12月1日；139(5):1281-92.
doi:10.1083/jcb.139.5.1281。

凋亡过程中Bax从胞浆向线粒体的移动

K G Wolter公司 1, Y T Hsu先生, C L史密斯, 一只Nechushtan, X G Xi公司, R J Youle先生
附属公司

凋亡过程中Bax从胞浆向线粒体的移动

K G Wolter公司等。 J细胞生物学. .

摘要

Bax是Bcl-2蛋白家族的一员，通过一种未知机制加速细胞凋亡。最近有报道称Bax是一种与细胞器相关的完整膜蛋白，或通过Bcl-2或胞浆中的可溶性蛋白与细胞器结合。为了探索Bcl-2家族成员在活细胞中的定位，将绿色荧光蛋白（GFP）融合到Bax、Bcl-2和Bcl-XL的NH2末端。对活的Cos-7肾上皮细胞和L929成纤维细胞进行的共焦显微镜检查显示，GFP-Bcl-2和GFP-Bcl-XL呈点状分布，并与线粒体标记物共定位，而GFP-Bax在细胞液中广泛存在。光漂白分析证实GFP-Bax是一种可溶性蛋白，而不是细胞器结合的GFP-Bcl-2。GFP-Bax的弥散定位不随高水平Bcl-2或Bcl-XL的共表达而改变。然而，在诱导凋亡后，GFP-Bax在细胞内移动到点状分布，部分与线粒体共定位。一旦启动，Bax运动在30分钟内，即细胞收缩或核凝结之前完成。从GFP-Bax中去除COOH末端疏水结构域抑制了细胞凋亡过程中的重新分布，并抑制了Bax和GFP-Bax的促死亡活性。这些结果表明，在发生凋亡的细胞中，Bax的细胞内定位发生了早期的剧烈变化，可溶性Bax重新分布到细胞器对Bax促进细胞死亡似乎很重要。

PubMed免责声明

数字

图7
图7
GFP–Bax在Cos-7细胞中的分布不受Bcl-2共表达的影响。将含有Bcl-2和GFP–Bax的质粒以3:1的比例瞬时转染细胞，48小时后通过共焦显微镜检查。(A类)在与Bcl-2和GFP–Bax共同转染的Cos-7细胞中，GFP–Bax以与单独表达GFP–Bax的细胞无法区分的模式分布在整个细胞中。(B类)用α-人Bax 2D2和α-人Bcl-2 8C8单克隆抗体通过蛋白质印迹监测GFP–Bax和人Bcl-2在Cos-7细胞中的共表达。车道a是仅用pcDNA 3载体转染的Cos-7细胞裂解物。车道b是来自pcDNA 3–Bcl-2转染的细胞裂解物，以及车道c来自C3–EGFP-Bax和pcDNA 3–Bcl-2的共转染。箭头a,b条，以及c（c）代表GFP–Bax，其NH2-终端翻译变体和内源性猿猴Bax。棒材，20μm。
图7
图7
GFP–Bax在Cos-7细胞中的分布不受Bcl-2共表达的影响。将含有Bcl-2和GFP–Bax的质粒以3:1的比例瞬时转染细胞，48小时后通过共焦显微镜检查。(A类)在与Bcl-2和GFP–Bax共同转染的Cos-7细胞中，GFP–Bax以与单独表达GFP–Bax的细胞无法区分的模式分布在整个细胞中。(B类)用α-人Bax 2D2和α-人Bcl-2 8C8单克隆抗体通过蛋白质印迹监测GFP–Bax和人Bcl-2在Cos-7细胞中的共表达。车道a是仅用pcDNA 3载体转染的Cos-7细胞裂解物。车道b是来自pcDNA 3–Bcl-2转染的细胞裂解物，以及车道c来自C3–EGFP-Bax和pcDNA 3–Bcl-2的共转染。箭头a,b条，以及c（c）代表GFP–Bax，其NH2-终端翻译变体和内源性猿猴Bax。棒材，20μm。
图1
图1
STS治疗前后活Cos-7细胞中表达的GFP融合蛋白的分布。转染后48小时，用共焦显微镜检查细胞。每个区域通过激光荧光进行可视化，以检测GFP(一,c（c）,e（电子）,克,我,k个,米，以及o个)，并通过DIC说明细胞形态(b条,d日,（f）,小时,j个,我,n个，以及第页). 本地GFP(一和b条)分布在未经处理的细胞中，显示出健康的形态。相反，GFP–Bcl-2(e（电子）和（f）)显示点状分布，主要为核周。GFP–Bcl-X公司L（左）(我和j个)似乎以类似于GFP–Bcl-2的主要点状模式分布，但也有微弱的弥漫荧光延伸至整个细胞。GFP-Bax公司(米和n个)在整个细胞中自由分布，其模式与GFP无法区分。用1μM STS处理6小时后，Cos-7细胞呈现凋亡的形态，包括细胞体积损失、突起收缩和细胞膜起泡。尽管有这些变化，天然GFP(c（c）和d日)仍然分布在整个细胞中。GFP–Bcl-2(克和小时)STS治疗后保留点状分布。GFP–Bcl-X公司L（左）(k个和我)STS处理也没有改变分布，主要以点状为主，背景为弥漫荧光。然而，GFP–Bax(o个和第页)在STS治疗后，分布发生显著变化，变得完全点状。棒材，20μm。
图2
图2
STS治疗前后活L929细胞中表达的GFP融合蛋白的分布。转染后48小时，用共焦显微镜检查细胞。每个区域通过激光荧光进行可视化，以检测GFP(一,c（c）,e（电子）,克,我,k个,米，以及o个)，并通过DIC说明细胞形态(b条,d日,（f）,小时,j个,我,n个，以及第页). 本地GFP(一和b条)分布在健康细胞中。GFP–Bcl-2(e（电子）和（f）)显示点状核周分布。GFP–Bcl-X公司L（左）(我和j个)似乎既有点状部分又有弥散部分。GFP–Bax公司(米和n个)在细胞中自由分布。在用1μM STS处理6小时后，L929细胞会出现细胞体积损失、收缩和长时间起泡。本地GFP(c（c）和d日)STS治疗后发现遍及细胞，包括水泡。GFP–Bcl-2(克和小时)STS治疗后保留点状分布。STS治疗后，GFP–Bcl-XL（左）(k个和我)显示了以漫反射荧光为背景的点状分布。与Cos-7细胞一样，GFP–Bax(o个和第页)经过STS处理后，分布发生变化，变成点状。棒材，30μm。
图3
图3
截短和全长GFP–Bax、GFP–Bcl-2和GFP–B cl-X的表达L（左）COS细胞中的融合蛋白。Bax（车道）的COOH终端截断和全长GFP融合构造一和b条)，Bcl-2（车道c（c）和d日)和Bcl-XL（左）（车道e（电子）和（f）)转染COS细胞。融合产物的表达通过用α人Bax 2D2、α人Bcl-2 8C8和α通用Bcl-X细胞裂解物的Western blotting进行监测L（左）检测Bax、Bcl-2和Bcl-X的2H12单克隆抗体L（左）分别是。箭头a是表达的融合产物。箭头b很可能是框架内NH2-终端翻译变体。箭头c代表内源性猴Bax、Bcl-2或Bcl-XL（左）与上述特定抗体发生交叉反应。
图4
图4
野生型和COOH末端截短型Bcl-2家族成员瞬时表达对细胞活性的影响，有无GFP在NH融合2-终点站。细胞要么单独转染GFP融合构建物，要么与GFP和各种Bcl-2家族成员共同转染。转染后48小时，用STS处理细胞。从添加STS时开始，每隔一段时间对给定区域内的GFP阳性细胞数进行计数（每个实验通常在时间零点处有~500个GFP阳性的细胞）。细胞活力的变化显示为一个区域内发光细胞的数量，并表示为该区域时间零值的百分比。(A类)Bcl-2结构在L929细胞中表达。(n个=4）。pcDNA3矢量控制（⋄），Bcl-2(○), GFP–Bcl-2（•），Bcl-2ΔCT(□），GFP–Bcl-2ΔCT(▪), 和Bax(▵) (B类)Bcl-X公司L（左）在L929细胞中表达的结构。(n个=4）。pcDNA3矢量控制（⋄），Bcl-XL（左）(○), GFP–Bcl-X公司L（左）（•），Bcl-XL（左）ΔCT(□），GFP–Bcl-X公司L（左）ΔCT(▪), 和Bax(▵) (n个=4）。(C)Bax结构在Cos-7细胞中表达。(n个= 3). pcDNA3矢量控制（⋄），Bax(○), GFP–Bax（•），BaxΔCT(▵), GFP–BaxΔCT(（）。
图5
图5
GFP–Bcl-2和GFP–B cl-X的点状部分L（左）在Cos-7细胞中与线粒体共定位。用20 ng/ml Mitotracker Red CMXRos处理瞬时转染的Cos-7细胞，对线粒体进行染色，然后用激光荧光共聚焦显微镜进行检测。每个字段都用GFP的适当波长进行独立可视化(一,d日，以及克)和Mitotracker Red CMXRos(b条,e（电子），以及小时)然后将两幅图像叠加(c（c）,（f），以及我). GFP–Bcl-2主要定位于线粒体(a–c). 大多数GFP–Bcl-XL（左）也定位于线粒体，尽管有一个不点状的模糊弥散背景(d–f日). GFP–Bax在健康细胞中不定位于线粒体(g–i类). 棒材，20μm。
图6
图6
健康人和STS治疗细胞中GFP、GFP–Bax和GFP–Bcl-2的FRAP分析。(A类)在单个处理细胞中显示荧光恢复。在表达GFP–Bax的健康Cos-7细胞中(a–d)，荧光在光漂白区迅速恢复。STS治疗后，Cos-7细胞带有点状GFP–Bax(e–h)光漂白后不再恢复。在表达GFP–Bcl-2的健康Cos-7细胞中(i–l)，在光漂白区域不会发生恢复。(B类)定量FRAP分析，以确定仅表达GFP、GFP–Bax和GFP–Bcl-2的细胞中的蛋白质流动性。绘制了光漂白后恢复期间的荧光强度随时间的变化曲线。恢复期间每隔0.46秒收集数据。GFP和GFP–Bax迅速恢复，时间进程与扩散一致。GFP–Bcl-2显示出最小的恢复，表明它在很大程度上是不动的。所有强度值均归一化为预漂白强度（I=100）和光漂白后立即的强度（I=0）。棒材，20μm。
图6
图6
健康人和STS治疗细胞中GFP、GFP–Bax和GFP–Bcl-2的FRAP分析。(A类)在单个处理细胞中显示荧光恢复。在表达GFP–Bax的健康Cos-7细胞中(a–d)，荧光在光漂白区迅速恢复。STS治疗后，Cos-7细胞带有点状GFP–Bax(e–h)光漂白后不再恢复。在表达GFP–Bcl-2的健康Cos-7细胞中(i–l)，在光漂白区域不会发生恢复。(B类)定量FRAP分析，以确定仅表达GFP、GFP–Bax和GFP–Bcl-2的细胞中的蛋白质流动性。绘制了光漂白后恢复期间的荧光强度随时间的变化曲线。恢复期间每隔0.46秒收集数据。GFP和GFP–Bax迅速恢复，时间进程与扩散一致。GFP–Bcl-2显示出最小的恢复，表明它在很大程度上是不动的。所有强度值均归一化为预漂白强度（I=100）和光漂白后立即的强度（I=0）。棒材，20μm。
图8
图8
STS处理后，GFP–Bax与Cos-7细胞线粒体共定位。瞬时表达GFP–Bax的Cos-7细胞用1μM STS诱导凋亡，用20 ng/ml Mitotracker Red CMXRos染色线粒体，4h后用激光荧光共聚焦显微镜检查。在GFP的适当波长下，通过激光荧光共焦显微镜独立显示显示的场(一)和Mitotracker Red CMXRos(b条)，然后将两幅图像叠加(c（c）). 虽然大多数点状GFP–Bax似乎定位于线粒体，但也有GFP–Bax点状但不标记线粒体染料的区域(c（c）,箭头). 棒材，20μm。
图9
图9
GFP–Bax重新分布发生在与凋亡相关的细胞收缩之前。在添加1μM STS后，随时间观察含有三个表达GFP–Bax的活Cos-7细胞的区域。在每个时间点，通过激光荧光对该区域进行可视化，以检测GFP–Bax(a–e和k–o（k–o）)，并通过DIC说明细胞形态(f–j和p–t型). 添加STS后经过的时间显示在每个激光荧光板的角落。在添加STS后1 h，24 min，首次检测到GFP–Bax的重新分布，这两个细胞朝向视野顶部(c（c）). 细胞形状的变化在12–24分钟后第一次变得明显，细胞轮廓的收缩证明了这一点(箭头,我和j个). 请注意，在这些时间点，最底层的细胞尚未启动GFP–Bax重新分布或细胞收缩。GFP–在2小时36分钟时，最下面的细胞首次检测到Bax重新分布(n个). 棒材，20μm。
图10
图10
GFP–Bax再分布先于核碎裂。在添加1μM STS和100 ng/ml双苯甲酰胺核染色剂后，随时间观察含有三个表达GFP–Bax的活Cos-7细胞的区域(a–e). 在每个面板中，使用适当波长的激光荧光共聚焦显微镜来观察GFP(绿色)和双苯甲酰胺(蓝色). STS添加后经过的时间显示在每个面板中。15小时后(（f）)细胞显示与凋亡相关的细胞核碎片。棒材，20μm。
图11
图11
STS处理前后缺乏COOH末端疏水结构域的GFP融合蛋白的分布。用合适的构建物瞬时转染Cos-7和L929细胞，48小时后用共焦显微镜检查。每个区域通过激光荧光显示以检测GFP。在两个健康的Cos-7细胞中(一)和L929电池(c（c）)，ΔCT GFP–Bcl-2弥散分布于整个细胞液中。同样，在健康的Cos-7细胞中(e（电子）)和L929电池(克)，ΔCT GFP–Bcl-XL（左）弥散分布于整个细胞液中。最后，在两个健康的Cos-7细胞中(我)和L929电池(k个)，ΔCT GFP–Bax弥散分布于整个细胞液中。用1μM STS处理表达截短GFP融合蛋白的细胞，6小时后在两个Cos-7细胞中进行检测(b条,（f），以及j个)和L929电池(d日,小时，以及我)STS处理后，截短的蛋白质没有重新分布。棒材，20μm。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Alnemri ES、Robertson NM、Fernandes TF、Croce CM、Litwack G.人BCL-2全长过度表达延长了杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞的存活时间。美国国家科学院院刊1992；89:7295–7299.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Borner C、Martinou I、Mattmann C、Irmler M、Scharer E、Martinoo J-C、Tschopp J。bcl-2a蛋白不需要膜附着，但需要两个保守结构域来抑制凋亡。细胞生物学杂志。1994;126:1059–1068.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Chen-Levy Z，Nourse J，Cleary ML。bcl-2候选原癌基因产物是一种24-千道尔顿整合膜蛋白，在淋巴细胞系和携带t（14；18）易位的淋巴瘤中高度表达。分子细胞生物学。1989;9:701–710.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Cole NB，Smith CL，Sciaky N，Terasaki M，Edidin M，Lippincott-Schwartz J.高尔基蛋白在活细胞膜中的扩散流动性。科学。1996;273:797–801.-公共医学
    1. Cormack BP、Valdivia RH、Falkow S.绿色荧光蛋白（GFP）基因（Amst）的FACS优化突变体1996；173:33–38.-公共医学

出版物类型

MeSH术语