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细胞生物学杂志。2007年4月23日；177(2): 343–354.
数字对象标识：10.1083/jcb.200609061
预防性维修识别码：PMC2064141型
PMID：17438076
第条

与动态F-肌动蛋白结构相关的早期内体是晚期贩运幽门螺杆菌VacA毒素

尼尔斯·C·高瑟,1 帕斯卡尔·蒙佐,2 特蕾莎·冈萨雷斯,2 安妮·多伊,1 阿曼达·奥达尼,三 皮埃尔·古农,5 维托里奥·里奇,三 米雷尔·科尔蒙特,2和帕特里斯·博奎特4
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补充资料

摘要

糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白（GPI-AP）通过一条不依赖于网格蛋白的途径被内吞到名为GPI-AP富集的早期内胚小室（GEEC）的囊泡中。我们最近发现幽门螺杆菌被内吞到GEEC中（Gauthier，N.C.，P.Monzo，V.Kaddai，A.Doye，V.Ricci和P.Boquet.2005）。分子生物学。细胞。16:4852–4866). 与大部分再循环回质膜的GPI-AP不同，VacA到达早期内体（EE），然后到达晚期内体（LE），在那里发生液泡化。

在本研究中，我们使用VacA研究GEEC和LE之间的贩运途径。我们发现，从GEEC到LEs的VacA路由需要聚合肌动蛋白。在贩运过程中，VacA从GEEC转移到与聚合肌动蛋白结构相关的EE。CD2-associated protein（CD2AP）是一种参与细胞内转运的对接蛋白，它与含有VacA的EEs桥接丝状肌动蛋白（F-actin）结构。CD2AP调节这些F-actin结构，并需要将VacA从GEEC转移到LEs。这些结果表明，从GEEC到LEs的排序需要EEs上的动态F-actin结构。

介绍

细菌蛋白毒素是研究内吞机制和细胞内转运途径的有用探针(Moya等人，1985年；Lord和Roberts，1998年；Falnes和Sandvig，2000年；Abrami等人，2005年)。这个幽门螺杆菌VacA毒素(M（M） 第页是该细菌的一个重要毒力因子，参与诱导胃溃疡和癌症(Blaser和Atherton，2004年)。VacA是一种A-B毒素，从细胞表面运输到晚期内体（LE），在那里诱导形成大液泡。毒素也从其内吞途径逃逸到靶向线粒体(Galmiche等人，2000年；Boquet等人，2003年；布兰克，2005年)，但这起事件的确切机制尚不清楚。

我们最近确定了导致HeLa和人胃腺癌细胞内吞和胞内转运VacA的事件顺序（参见图1 A用于序列的示意图表示；Gauthier等人，2005年)。毒素首先结合在脂筏上的细胞表面(Patel等人，2002年；Schraw等人，2002年；Gauthier等人，2004年)。VacA的结合优先发生在聚集在膜突起上的脂筏上，膜突起包含由Rac1 GTPase调节的丝状肌动蛋白（F-actin）结构(Gauthier等人，2005年)。毒素一旦结合到细胞表面，就会被一种涉及F-肌动蛋白但不依赖于网格蛋白、动力蛋白和ARF6 GTPase的胞饮机制迅速内化。这种皮诺细胞机制不需要细胞蛋白的酪氨酸磷酸化，也不是一个大皮诺细胞过程(Gauthier等人，2005年)。VacA胞饮作用受Cdc42 GTP酶活性的调节(Gauthier等人，2005年)如非交联糖基磷脂酰锚定蛋白（GPI-AP）的内化所示；Sabharanjak等人，2002年)。因此，VacA被内化到最近描述的富含GPI-AP的早期内吞小室（GEEC）中(Sabharanjak等人，2002年；Sharma等人，2004年; 有关审查，请参阅市长和里兹曼，2004年)。与GPI-AP相反，GPI-AP在胞饮作用进入GEEC后，通过再循环内体再循环到质膜(Sabharanjak等人，2002年)，VacA进入早期内体（EE；EE抗原1[EEA1]阳性；Birkeland和Stenmark，2004年)到达LEs之前(Gauthier等人，2005年).

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VacA的细胞内贩运依赖于F-actin。（A） 如前所示，胞饮作用和VacA胞内转运模型(Gauthier等人，2005年)。（B和C）HeLa细胞在4°C下用VacA浸泡1 h，清洗，并在37°C下孵育30或120 min。然后将细胞固定、渗透并处理，以通过间接免疫荧光检测VacA（绿色）、EEA1或LAMP1（蓝色）。通过共焦显微镜对细胞进行分析（有关3D重建，请参见视频1和视频2；网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1)。（D和E）细胞与B和C中的VacA孵育，但在37°C孵育30分钟后，添加CD（D）或latrunculin B（E）以破坏肌动蛋白细胞骨架。细胞进一步培养90分钟，然后处理以检测VacA（绿色）和EEA1或LAMP1（蓝色；有关3D重建，请参阅视频3）。（B–E）右侧的图像显示了相应左侧面板中方框区域的放大视图。所有图片均显示共聚焦切片的全细胞重建，并表示绿色（VacA）和蓝色（指示的内吞标记物）标记的合并图像。棒材，10μm。（F） HeLa细胞在4°C下用VacA孵育1 h，并在37°C下清洗和孵育120 min。立即添加CD或在温度变化后15、30、45、60、90或120 min添加CD。5毫米NH4将Cl添加到培养基中，并将细胞再培养2小时，以使其发生空泡化。真空化通过中性红摄取（NRU）定量。错误条代表SD.NCD，无CD。

迄今为止，VacA是GEEC–LE途径中唯一描述的特异性标记物。内皮细胞发生VacA诱导的细胞空泡化(Papini等人，1994年)微管解聚时只受到轻微影响(Papini等人，1994年；Li等人，2004年)。这表明VacA向LEs的细胞内转运可能是通过微管依赖性过程进行的，这与受体酪氨酸激酶降解为溶酶体的过程不同(Gruenberg和Stenmark，2004年)。事实上，内吞分子从分选EE到LE的转运通常是通过内吞小泡载体（也称为多泡体；格伦伯格和斯坦马克，2004年)利用分子马达在微管上运动(Bomsel等人，1990年)。考虑到VacA的特异性胞饮机制，我们探索了这种毒素可能通过微管以外的途径从GEEC传到LE的可能性。

在这项研究中，我们研究了VacA向LEs的细胞内转运是否是一个肌动蛋白依赖性过程，VacA通过与聚合肌动蛋白相关的内胚体隔室转运。然后我们测试了VacA细胞内转运是否需要适配器分子CD2-associated protein（CD2AP；Dustin等人，1998年；Kirsch等人，1999年)是调节肌动蛋白细胞骨架和向LEs转运的良好候选药物。

CD2AP与肌动蛋白的相互作用(Lehtonen等人，2002年)和几种肌动蛋白结合蛋白(Badour等人，2003年；Hutchings等人，2003年；Lynch等人，2003年)支持CD2AP在动态肌动蛋白重塑过程中发挥作用。这也得到了它与肌动蛋白成核Arp2/3复合物和肌动蛋白在富含肌动蛋白的动态结构中的同位化的支持（lamellipodia和彗尾的前缘；Schafer等人，2000年；Welsch等人，2001年,2005)。此外，当CD2AP在COS-7细胞中过度表达时，CD2AP包围的F-actin斑块增加，同时应力纤维减少(Kirsch等人，1999年；Badour等人，2003年).

一些证据支持CD2AP在管制向LEs贩运人口方面的作用。CD2AP与Rab4和c-Cbl的相互作用与EE和LE之间的贩运有关(Cormont等人，2003年)。根据这一观察，Lee等人（2003）表明从CD2AP中分离出的T细胞−/−小鼠未能下调T细胞受体（TCR），尽管受体内化没有受到影响(Lee等人，2003年)。最后，对CD2AP单倍体小鼠足细胞的电镜分析显示，多泡体的形成存在缺陷(Kim等人，2003年)。CD2AP与CAP-Z（Z线的封盖蛋白）和两种肌动蛋白结合蛋白皮质素的相互作用参与了激活的TCR和EGF受体的下调，表明受体降解与肌动蛋白聚合之间存在联系(Hutchings等人，2003年；Lynch等人，2003年)。在本研究中，我们探讨了CD2AP在从GEEC到LE的VacA排序中的作用。

结果

VacA需要完整的肌动蛋白细胞骨架才能从GEEC转移到LEs

我们之前已经揭示了内吞过程的四个步骤，这四个步骤将VacA从质膜驱动到HeLa细胞中的LEs，如图1 A(Gauthier等人，2005年)。在4°C下通过Rac-dependent过程（步骤1）与细胞结合1小时，并升温至37°C后，VacA在10分钟内通过Cdc42依赖的非巨噬细胞过程（步骤2）积累到GEEC中，在30分钟内在EE中富集（步骤3），并在120分钟内转移到LEs中（步骤4）。

本研究的目的是检查肌动蛋白细胞骨架的动力学是否是将VacA从GEEC（步骤2）转移到EE（步骤3）和LE（步骤4）所必需的。我们首先使用肌动蛋白毒素测试了HeLa细胞中VacA细胞内运输中聚合肌动蛋白的需求。在4°C下VacA结合后，将细胞加热30分钟，以使VacA内化到GEEC和EE中(图1 B)。如前所示，VacA分子与EE共定位，但相当大一部分VacA仍与GEEC相关(图1 B3D重建见视频1；可在获取http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1)。在随后的步骤中，将DMSO（用于对照）、细胞松弛素D（CD）或latrunculin B添加到培养基中，保持毒素在LEs中积累所需的剩余90分钟。在对照细胞中，VacA不再与GEEC或EE相关，而是与LEs共定位(图1 C有关3D重建，请参见视频2）。值得注意的是，VacA诱导了LEs的强烈聚集(图1 C)如前所示(Li等人，2004年)。相反，在用肌动蛋白毒药处理的细胞中，大部分胞吞的VacA分子没有到达LEs。大多数内化毒素分子是在GEEC中发现的，这是基于毒素标记小室的细胞外周定位以及与VacA相关的EEA1标记缺失(图1、D和E; 有关3D重建，请参见视频3）。然而，发现罕见的毒素分子与溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）共定位，这些毒素分子可能已经在VacA胞饮作用30分钟后进入LEs(图1、D和E).

接下来，我们通过功能性毒素测试确定VacA从GEEC向LEs的转运是否需要聚合肌动蛋白。VacA诱导的细胞空泡化发生于LEs，我们之前已经证明空泡化过程本身并不依赖于F-actin(Ricci等人，2000年)。因此，我们研究了在VacA内化过程中添加CD是否会损害VacA诱导的细胞空泡化(图1 F)。当在CD存在的情况下开始VacA内化时，细胞没有形成液泡(图1 F)。这证实了VacA的胞饮作用是一个严格依赖F-actin的过程(Ricci等人，2000年；Gauthier等人，2004年,2005；Li等人，2004年)。当在VacA内化开始后15或30分钟添加CD时，再次未观察到空泡化(图1 F)尽管VacA已经在GEEC和EE中(图1、A和B)。当在VacA胞饮开始后45分钟加入CD时，观察到一个小而明确的空泡化(图1 F)。后期添加CD对阻断VacA诱导的细胞空泡化的效果越来越差。总之，这些数据支持一个模型，其中VacA通过EE从GEEC传输到LEs依赖于聚合肌动蛋白。

VacA从GEEC转移到与F-actin结构相关的EE

因为VacA的转运似乎依赖于聚合肌动蛋白，我们寻找与细胞内VacA阳性囊泡相关的F-actin结构。内化30分钟的VacA分子持续存在于与F-actin结构相关的囊泡隔室中(图2 A，插图2-5）。然而，在仍然含有VacA的GEEC水平上没有检测到聚合的肌动蛋白结构(图2 A，插图1）。与VacA阳性囊泡相关的聚合肌动蛋白结构通常以极化的方式定位在囊泡表面(图2 B3D重建见视频4；可在获取http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1)，类似于在火箭内体上发现的动态F-肌动蛋白结构(Taunton等人，2000年)。为了确定在体内可以观察到含有VacA的内体顶端的F-actin结构，并诱导基于actin的囊泡运动，我们用荧光标记的VacA（Cy5-VacA[VacA毒素标记为Cy5染料]）对GFP-actin转染的HeLa细胞进行毒化。GFP-actin转染的HeLa细胞在4°C下与Cy5-VacA孵育1 h，洗涤，37°C孵育30 min，并通过共聚焦活细胞显微镜进行分析。在这些条件下，很容易观察到含有Cy5-VacA和含有F-actin结构的囊泡(图2 C和S1）。此外，这些结构是动态移动的（视频5和6）。为了确定含有VacA的囊泡是通过基于肌动蛋白的运动机制移动的，在内吞20分钟后将CD添加到Cy5-VacA中毒的HeLa细胞中。如图S2所示，与对照制剂相比，含有VacA的囊泡在CD存在下的运动性降低了三倍。这表明肌动蛋白聚合是有效推进含VacA的内体所必需的。

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VacA从GEEC转移到含有F-actin结构的囊泡隔室。（A） HeLa细胞在4°C下与VacA孵育1 h，并在37°C下清洗和孵育30 min。将细胞固定、渗透并处理，以通过间接免疫荧光法检测F-actin、FITC-柱状体蛋白（绿色）和VacA（红色）。通过共焦显微镜分析细胞。显示了与每个单独标签和合并图像相对应的一个共焦部分。编号的方框区域描绘了相应插图中显示的区域。箭头指向含有VacA的囊泡，箭头指示与该囊泡相关的F-actin结构。棒，10μm。（B） 含有与F-actin结构相关的VacA的囊泡在Y平面上的旋转（每帧之间30°）（3D重建见视频4）。（C） 表达GFP-actin的HeLa细胞在4°C下与Cy5-VacA孵育1h，清洗，在37°C孵育30min，并按照材料和方法中的描述，在1帧/5秒的实时共焦显微镜下进行记录。每个帧代表视频5的一个放大共焦部分（另请参见视频6和图S1；可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1).

接下来，我们使用EEs（EEA1）或LEs（LAMP1）的特定标记分析了含有VacA的囊泡类型，VacA包含F-actin结构。在VacA内化开始后30分钟，与F-actin结构相关并含有VacA的囊泡室均用EEA1标记(图3 A; 量化参见图S3 A，3D重建参见视频7；可在获取http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1)。在这些条件下，LEs显然与聚合肌动蛋白结构无关(图3 B定量见图S3 A）。然后我们研究了F-actin结构的形成是否需要VacA。如所示图3 C在内化30分钟后，VacA与EEs中的荧光右旋糖酐（液相摄取的标志物）相关，表明GEEC与液相摄取有关，如前所示(Sabharanjak等人，2002年)。此外，最近有研究表明，右旋糖酐通过Cdc42依赖性机制（如VacA）被特异性吸收(Cheng等人，2006年)。在用荧光右旋糖酐但不含VacA孵育的细胞中，含有右旋糖酐的EEA1阳性囊泡在其尖端仍表现出聚合的肌动蛋白结构(图3 D).

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含有VacA或右旋糖酐并含有肌动蛋白尾部的囊泡是EEs。（A和B）HeLa细胞在4°C下与VacA孵育1 h，清洗，并在37°C下孵育30 min。细胞被固定、渗透，并进行标记处理。A显示肌动蛋白（红色）、EEA1（绿色）和VacA（蓝色）；有关3D重建，请参阅视频7；网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1)。B显示肌动蛋白（绿色）、LAMP1（蓝色）和VacA（红色）。（C） HeLa细胞在4°C下与VacA孵育1 h，并在37°C下在FITC-右旋糖酐（FITC-Dex）存在下清洗和孵育30 min。然后处理细胞以检测肌动蛋白（红色）、FITC-右旋糖酐（绿色）和VacA（蓝色）。（D） HeLa细胞与得克萨斯红-右旋糖酐（Txrd-Dex）孵育，并进行处理以检测肌动蛋白（绿色）、得克萨斯红色-右旋糖酐（红色）和EEA1（蓝色）。（A–D）然后通过共焦显微镜分析细胞。每个单独标签对应的一个共焦部分以黑白显示。方框区域描绘了放大的合并区域。棒材，10μm。

CD2AP与含有VacA的EEs上的F-actin结构相关

CD2AP是一种膜相关的衔接蛋白(Dustin等人，1998年；Kirsch等人，1999年)这与控制配体向降解途径的胞内转运有关(Cormont等人，2003年；Kim等人，2003年；小林等，2004年；Welsch等人，2005年)。重要的是，CD2AP结合F-actin(Lehtonen等人，2002年)和Arp2/3激活剂皮质素(Lynch等人，2003年)。因此，我们研究了CD2AP是否参与VacA细胞内转运。我们首先研究了CD2AP和VacA之间可能的共定位。在VacA内吞30分钟后，过度表达和内源性CD2AP均与含VacA的囊泡相关(图4，A和B)。有趣的是，CD2AP似乎在含VacA的囊泡表面和F-actin结构之间架起了一座桥梁(图4 A)。另一方面，在仍含有VacA分子的GEEC中未检测到CD2AP(图4 A)。重要的是，内源性CD2AP和皮质素共定位(图4C)这表明这两个分子可能在这些细胞内小泡的水平上参与F-actin结构的形成。

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CD2AP位于含有VacA的EEs和肌动蛋白尾部之间。（A） 表达GFP-CD2AP（绿色）的HeLa细胞在4°C下与VacA孵育1 h，并在37°C下清洗和孵育30 min。将细胞固定、透化并处理以检测肌动蛋白（红色）和VacA（蓝色）。然后用共焦显微镜分析细胞。显示了与每个单独标签和合并图像相对应的一个共焦部分。方框区域描绘了相应插图中显示的区域。该方案说明了VacA、CD2AP和肌动蛋白的各自定位，这些定位是通过对合并图像的分析推导出来的。如图所示，CD2AP定位于含有VacA和F-actin尾部（黄色和白色）的囊泡的界面。（B） HeLa细胞在4°C下与VacA孵育1 h，并在37°C下清洗和孵育30 min。然后处理细胞以检测内源性CD2AP（绿色）和VacA（红色）。（C） 对未经处理的HeLa细胞进行处理，以检测内源性CD2AP（绿色）和皮质素（红色）。所有图片均来自同一个共焦截面。棒材，10μm。

CD2AP调节EEs尖端F-actin结构的动力学

根据我们的结果，我们接下来研究CD2AP是否与胞浆中的动态F-actin结构有关。用活细胞荧光显微镜对GFP-actin和DsRed-CD2AP共转染但未经VacA处理的HeLa细胞进行分析。如所示图5 A和视频8中的http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1)，CD2AP与在胞浆中随机移动的F-actin结构尖端相关。

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CD2AP调节F-actin结构的形成。（A） 如材料和方法中所述，在1帧/10秒时记录表达DsRed-CD2AP和GFP-actin的HeLa细胞（参见视频8；网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1)。方框中的区域表示在四个底部面板中放大的视频场，显示了荧光CD2AP（红色）标记的囊泡在四个不同时间的位移及其相关的荧光F-actin结构（绿色）。箭头指向CD2AP标记的囊泡。（B） 所用GFP融合蛋白的结构：全长CD2AP、包含CD2AP前两个SH3结构域的CD2AP N末端部分（1-175）、包含CD2AP第三个SH3域的CD2AP C末端部分、富含脯氨酸的区域和线圈结构域（194-639），以及交切蛋白的五个串联SH3结构区（Inter-SH3）。表达不同结构（B）的（C–F）HeLa细胞在4°C下与VacA孵育1 h，并在37°C下清洗和孵育30 min。细胞被固定、渗透并处理以检测肌动蛋白（红色）和GFP融合结构（绿色）。通过共焦显微镜分析细胞。显示了与每个单独标签和合并图像相对应的一个共焦部分。方框中的区域指向具有不同GFP-CD2AP结构的转染细胞（显示在每个面板的左侧），这些结构被放大以显示是否存在与含有VacA的小泡相关的F-actin结构（用箭头表示）。插图中的箭头显示了F-actin结构的存在或不存在（1–175）（有关3D重建，请参阅视频9）。棒材，10μm；（A，插图），2μm。

为了研究CD2AP在动态肌动蛋白结构形成中的可能作用，我们通过表达CD2AP的不同结构域来寻找显性负效应(Monzo等人，2005年)。从N到C末端，CD2AP包含三个SH3结构域、一个富含脯氨酸的区域和一个卷曲线圈结构域(图5 B；Dustin等人，1998年)。全长CD2AP在HeLa细胞中的表达不影响F-肌动蛋白结构的形成(图5，A和C)。相反，与周围未转染的细胞相比，CD2AP的前两个SH3结构域（CD2AP-175）的表达完全阻断了F-肌动蛋白结构的形成，并且转染细胞中皮层F-肌动蛋白的水平更高(图5D)。CD2AP C末端部分（CD2AP-194-639）的表达不影响F-actin结构的形成(图5 E; 关于三种构造的效果的3D重建，参见视频9，关于量化，参见图S3 B；可在获取http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1)。作为CD2AP N末端结构域特异性的对照，我们表达了交叉蛋白（Inter-SH3；Simpson等人，1999年)。如所示图5 F，Inter-SH3的表达并不阻止F-actin结构的形成。

接下来，我们使用我们之前验证过的siRNA策略，研究了CD2AP在EEs尖端F-actin结构形成中的作用(Monzo等人，2005年)。如所示图6 A在CD2AP-siRNA处理的HeLa细胞中，CD2AP的表达降低了近90%。如中所述图6 B和图S4（可从http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1)CD2AP耗竭导致大量肌动蛋白细胞骨架重构，大量应激纤维和皮质肌动蛋白标记减少。在转染对照siRNA的细胞中未观察到这些效应(图6 B和S4）。重要的是，在CD2AP缺失的细胞中，没有观察到F-actin结构与仍存在于胞浆中的EEA1阳性细胞室相关(图6 B和S4）。总之，这些结果表明，EEA1-阳性EEs上F-actin结构的存在依赖于CD2AP。

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siRNA敲低CD2AP导致与EEs相关的F-actin结构丢失，并导致应激纤维增加。（A） 用CD2AP siRNA或对照siRNA转染48 h后制备的细胞提取物通过Western blotting检测CD2AP的表达。（B） 在转染CD2AP siRNA（底部）或对照siRNA（顶部）48小时后，固定HeLa细胞，使其渗透，并处理以检测肌动蛋白（绿色）和EEA1（蓝色）。然后用共焦显微镜分析细胞。图中显示了对应于每个单独标签的一个共焦截面和一个合并图像（有关分析细胞的全场和B中细胞的共焦z堆栈，请参见图S4；网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1)。箭头表示控件中存在肌动蛋白尾部。棒材，10μm。

CD2AP调节的F-actin结构需要将VacA从GEEC转移到LE

接下来，我们研究了CD2AP调节的F-actin结构在从GEEC向LEs转运VacA中的作用。为此，我们研究了不同CD2AP结构过度表达对GEEC向EE（吞噬30分钟后）和LE（吞噬120分钟后）转移毒素的影响。在GFP-CD2AP转染细胞中，VacA胞饮作用30分钟后，在GEEC和F-actin结构相关EEs中发现毒素(图7 A)。相反，CD2AP的前两个SH3结构域（CD2AP-1-175）的过度表达导致GEEC中VacA的标记增加(图7，A[插图2]和B）。在这些细胞中，与同一视野中的未转染细胞或过表达Inter-SH3的细胞相比，VacA没有到达EEs(图7 B)。此外，在CD2AP-1-175转染细胞中，与未转染细胞或GFP-CD2AP转染细胞相比，未观察到与F-actin结构相关的小泡(图7 A)。CD2AP C末端部分（CD2AP-194-639）的过度表达并没有导致VacA在GEEC中的标记增加，所有含有VacA的EEs的末端都含有F-actin结构(图7 A)。在胞饮作用120分钟后，GFP-CD2AP的表达并不影响VacA进入LEs(图7 C)。相反，CD2AP的前两个SH3结构域（CD2AP-1-175）的表达阻止了VacA进入LEs，VacA仍然与GEEC相关(图7 C)。CD2AP或Inter-SH3的C末端部分的表达并不影响VacA进入LEs(图7 C).

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CD2AP前两个SH3结构域的表达阻断了VacA从GEEC向LEs的转移。（A） 转染CD2AP、CD2AP-1-175和CD2AP-194-639的HeLa细胞在4°C下与VacA孵育1 h，并在37°C下清洗和孵育30 min。细胞被固定、渗透并处理以检测肌动蛋白、VacA和不同结构。通过共焦显微镜分析细胞。每个单独标签对应的一个共焦部分以黑白显示。在未转染（1）或CD2AP-1-175转染细胞（2）中，插入物表示VacA标记（蓝色）和肌动蛋白标记（红色）之间的融合。箭头指向与F-actin结构相关的含VacA的囊泡。（B） 条件与A中相同，但HeLa细胞转染CD2AP-1-175或Inter-SH3，并用EEA1抗体检测EEs。插入物表示VacA标记（红色）和EEA1标记（蓝色）在非转染细胞（3）、CD2AP-1-175转染细胞中的融合，其中VacA存在于GEEC（2）中且在EEs（1）中无法检测到，以及在Inter-SH3转染细胞内的融合。（A和B）方框中的区域描绘了放大的区域。（C） 与A或B中的条件相同，但HeLa细胞在37°C下培养120分钟，用LAMP1抗体检测LEs。在合并图像中，VacA显示为红色，LAMP1显示为蓝色。在CD2AP-1–175转染细胞中，VacA在GEEC中富集（箭头所示），与相邻的非转染细胞或转染其他结构的细胞相比，在LEs中未发现VacA。棒材，10μm。

为了进一步探讨CD2AP在从GEEC到LEs的VacA转运中的作用，我们研究了过度表达CD2AP或该蛋白截短形式的细胞中VacA诱导的细胞空泡化是否受到影响。通过视频显微镜观察过度表达不同CD2AP结构的细胞的毒物诱导的空泡化(图8和视频10；可在获取http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1)，并量化空泡化细胞的数量(图8 B)。只有CD2AP-1–175的表达能够显著减少毒素诱导的细胞大液泡的形成(图8和视频10）。

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CD2AP前两个SH3结构域的表达抑制了VacA诱导的LEs空泡化。（A） 用CD2AP、CD2AP-1–175和CD2AP-194–639转染的HeLa细胞与VacA在4°C下孵育1小时，并在含有5mM NH的DME培养基中在37°C下洗涤和通过视频显微镜分析120分钟4在转染细胞中进行Cl.真空化。（B） 对产生液泡的转染细胞进行定量。对每种情况下至少50个转染细胞进行分析（视频10，网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1)。棒材，10μm。

为了明确CD2AP在VacA向LEs的细胞内运输中的作用，我们使用siRNA去除了HeLa细胞的CD2AP。在CD2AP去除的细胞中，在VacA内吞120分钟后，毒素没有像在用对照siRNA处理的细胞中那样到达LEs。相反，VacA保留在GEEC内(图9 A)。此外，CD2AP缺失细胞中50%的毒素诱导的大液泡的形成受到抑制(图9、B和C).

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CD2AP表达下调抑制了VacA从GEEC向LEs的转移以及VacA诱导的空泡化。（A） 用对照siRNA（左）或CD2AP siRNA（右）转染后36 h，HeLa细胞在4°C下与VacA孵育1 h，清洗，并在37°C下孵育120 min。细胞固定、渗透并处理以检测VacA和LAMP1。然后用共焦显微镜分析细胞。图片和插图代表了VacA标签（红色）和LAMP1标签（蓝色）从单个共焦截面的合并。方框区域描绘了相应插图中放大的区域。箭头显示，CD2AP耗尽后，VacA仍留在GEEC中。（B） 用对照siRNA或CD2AP siRNA转染细胞。36 h后，用VacA在4℃孵育1 h，洗涤，并用含有5 mM NH的DME在37℃孵养4 h4Cl.细胞通过视频显微镜进行分析。（C） 真空细胞在胶片开始时（0）和4小时后进行评分。结果表示为整个细胞群中空泡细胞的百分比，并表示三个独立视频的平均值±SEM（误差条）。（D） 在表达或不表达CD2AP的细胞中，细胞内（蛋白酶K抗性）VacA的量是相同的。用材料和方法中描述的对照siRNA或CD2AP siRNA转染HeLa细胞。3d后，在4°C下用VacA处理细胞1h（t=0），并在37°C下内化VacA 2h（t=2h）。然后用蛋白酶K处理细胞，如材料和方法中所述，以降解细胞外VacA。在表达或不表达CD2AP的细胞中，细胞内VacA（即蛋白酶K抗性）的量是相同的，表明VacA内化独立于CD2AP发生。针对微管蛋白的Western blotting用作2小时时间点的负荷控制。（E） 作为对照，如前所述，用CD预处理细胞以阻断VacA胞饮作用(Gauthier等人，2005年)。HeLa细胞在VacA结合前用CD预处理或不预处理20分钟，并在10μm的D.Bars中进行处理。

我们用生化分析证实CD2AP缺失不会影响VacA的胞饮作用(图9、D和E)。用蛋白酶K处理细胞以降解细胞外VacA。通过Western blotting测定与内化毒素相对应的剩余VacA量。作为对照，如前所述，用CD处理细胞以阻断VacA胞饮作用(Gauthier等人，2005年)。虽然CD完全阻断了VacA的胞饮作用(图9 E)，在siRNA对照细胞和siRNA CD2AP处理的细胞之间，未观察到胞浆化VacA的量存在差异(图9 D)。总之，这些结果表明，CD2AP通过调节EEs尖端F-肌动蛋白结构的形成，参与了VacA从GEECs到LEs的分选和运输。

讨论

GPI-AP通过一条氯菊酯非依赖性途径被内吞，并积聚到名为GEEC的早期内吞小室中（有关综述，请参阅市长和里兹曼，2004年)。我们最近发现，空泡化的VacA毒素与脂筏结合，并被皮诺细胞化为GEEC(Gauthier等人，2005年)。随后，与回收回质膜的GPI-AP不同，VacA被分类为EE。然而，最近有证据表明，GPI-AP与VacA一样，是从GEEC转移到EE的(Kalia等人，2006年)。VacA随后从EE运输至LE。在那里，VacA诱导了聚集(Li等人，2004年)和LEs肿胀，导致大液泡的形成(Papini等人，1994年)。迄今为止，VacA是GEEC–LE途径中唯一描述的特异性标记物。因此，我们使用VacA作为研究这一贩运途径的工具。重要的是，我们表明这种贩运依赖于聚合肌动蛋白。事实上，通过特定药物破坏肌动蛋白细胞骨架导致VacA积聚到GEEC中，并抑制毒素诱导的空泡化。我们发现，F-肌动蛋白结构在EE上形成，是从GEEC向LE运输VacA所必需的。肌动蛋白调节因子CD2AP控制EEs上的肌动蛋白结构。事实上，通过过度表达截断的CD2AP或使用siRNA特异性缺失来破坏CD2AP功能，导致EEs上的F-actin结构丢失，导致GEEC中的VacA积累。GEEC中VacA的积累表明GEEC与EEs相关，EEs上的动态F-actin结构有助于对分子进行分类以到达LEs。

含VacA的EEA1囊泡上F-actin结构的存在

动态F-actin结构最初被描述为与细菌病原体有关，例如单核细胞增生李斯特菌或福氏志贺氏菌内化入细胞后，诱导宿主肌动蛋白在其表面聚合(韦尔奇和马林斯，2002年)。自那时以来，一些研究发现哺乳动物细胞在质膜水平上的内源性F-actin结构有助于囊泡从质膜内陷和脱离(Engqvist-Goldstein和Drubin，2003年；Kaksonen等人，2005年)。例如，在巨噬细胞中，研究表明，含有右旋糖酐的小泡与肌动蛋白尾部相关，肌动蛋白尾巴在内化过程中将小泡从质膜上带走(Merrifield等人，1999年)。在贩运内体水平上内源性F-actin尾部的例子很少。证实了高尔基体小泡水平存在F-actin尾，这是高尔基体向LE转运或将筏相关蛋白从高尔基体输送到极化细胞顶膜所必需的(Carreno等人，2004年；Guerrero等人，2006年)。此外，Morel等人（Morel，E.、N.Mayran和J.Gruenberg，2004）。2004年欧洲实验室科学组织会议记录。文章摘要。E124.）表明HeLa细胞中的EEs上存在聚合肌动蛋白。在体外系统中，首次在纯化的HeLa细胞内涵体上描述了与细胞内区室相关的F-肌动蛋白结构的出现非洲爪蟾卵母细胞提取物(Taunton等人，2000年)。在这个系统中，EEs和LEs分别由转铁蛋白和LAMP1的存在定义，它们具有高度的运动性，并由动态的F-actin尾巴推动(Taunton等人，2000年)。在本研究中，我们已经能够检测到细胞中的F-肌动蛋白结构，主要是在含有VacA或右旋糖酐的EEA1内体上，而不是在LEs上。LEs上缺乏F-actin结构符合Carreno等人（2004年）.我们的结果与使用爪蟾卵母细胞提取物(Taunton等人，2000年)可能是由于存在抑制细胞内LEs上F-actin结构形成的调节物。另一方面，LEs上的F-actin结构可能存在于我们的系统中，但过于短暂，无法轻易检测到。

VacA通过靶向线粒体并诱导细胞色素释放而导致细胞凋亡c（c）(Galmiche等人，2000年)。以前的研究表明，含铁EE和线粒体之间的细胞器间接触可能通过直接转运补充线粒体铁(Zhang等人，2005年)。据观察单核细胞增生李斯特菌以F-actin为基础的运动在细胞内移动经常与线粒体发生碰撞(Lacayo和Theriot，2004年)。我们认为，VacA可以利用表现出动态F-actin运动的EEs作为直接转移到线粒体的途径。

CD2AP调节EEs上的F-actin结构

我们观察到含VacA的EE与F-actin结构有关，这促使我们寻找已知参与这一过程的分子。CD2AP已被证明参与胞内降解途径和肌动蛋白重塑过程，因此是一个主要候选因子(迪基克，2002年)。从我们目前的结果来看，CD2AP似乎在含VacA的囊泡表面和F-actin结构之间架起了桥梁。这与Schafer等人（2000年）他在过度表达Arf6的Ptk1细胞中观察到F-actin尾部头部的CD2AP。

CD2AP过度表达后，一些组观察到CD2AP包围的F-actin斑块增加，同时压力纤维减少(Kirsch等人，1999年；Badour等人，2003年)。这些F-actin斑块可能与我们观察到的与EEs相关的F-actin结构相对应。因此，在高度过度表达全长CD2AP的转染细胞中，我们观察到围绕含VacA的EEA1囊泡的聚合肌动蛋白增加，并重叠CD2AP标记（未公布的数据）。我们还发现，CD2AP缺失导致肌动蛋白应激纤维增加，并导致EEs上F-肌动蛋白结构的缺失，这些仍在胞浆中观察到。

CD2AP在F-肌动蛋白结构调控中的作用可能与它与肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白的相互作用有关。事实上，CD2AP直接与肌动蛋白结合(Lehtonen等人，2002年)并通过PSTPIP1作用于三种肌动蛋白调节因子CAP-Z、皮质素和WASP（Wiscott-Aldrich综合征蛋白）(Badour等人，2003年；Hutchings等人，2003年；Lynch等人，2003年)。CAP-Z和cortactin也参与了类似的过程（例如，F-肌动蛋白尾部的形成；韦尔奇和马林斯，2002年)。因此，我们发现内源性CD2AP与皮质素相关。这与Welsch等人（2001）显示CD2AP与足细胞中的皮质素和Arp2/3共同定位在F-actin斑块上。此外，CD2AP可以与另一种称为Alix/AIP1的衔接蛋白结合(Chen等人，2000年；Kurakin等人，2003年)，一种最近被证明是EEs肌动蛋白调节器的蛋白质(Cabezas等人，2005年)。使用siRNA去除Alix导致EEs周围肌动蛋白网状结构增加(Cabezas等人，2005年)。这些结果表明，CD2AP和Alix可以分别作为EEs上肌动蛋白募集的正调节器和负调节器。

CD2AP调节GEEC和LE之间的VacA流量

在本研究中，我们发现CD2AP参与了VacA从GEEC向LE的转运，这与CD2AP在足细胞降解途径中的作用一致(Kim等人，2003年)以及TCR细胞内贩运(Lee等人，2003年)。当CD2AP缺失或显性阴性突变体过度表达时，VacA仅限于GEEC，未发现其他细胞溶质室含有VacA。这表明，含有VacA的EE是一种内吞结构，可能通过涉及EE运动的过程将GEEC连接到LE。有几种可能解释了含有F-actin结构的EE在配体从GEEC向LE的转运中的作用。

我们的模型是，含有CD2AP-的F-actin结构的EEs代表从GEEC中产生的特定EEs群体，这些EEs成熟并直接连接到LEs的松果体隔室。为了支持这个模型，Kim等人（2003）表明CD2AP中多泡体的形成失败+/−足细胞，损害胞饮配体向溶酶体的转运。最近，研究表明，在足细胞中，CD2AP与标记有Rab4的右旋糖酐囊泡相关，并具有动态的F-actin结构。这些隔室在胞浆中具有高度的运动性(Welsch等人，2005年)。CD2AP基因敲除动物的溶酶体通路中的配体被阻断已在T细胞中得到证实，其中TCR激活后的信号持续性是由TCR降解减少引起的。事实上，在CD2AP敲除细胞的溶酶体中未发现TCR(Lee等人，2003年)。显然，这不是由于抑制TCR内化而引起的，而是由于抑制了向溶酶体的贩运(Lee等人，2003年)。此外，我们之前已经证明CD2AP参与了EE和LE之间的细胞内运输(Cormont等人，2003年)。我们已经发现，CD2AP与Rab4的共表达导致含有EE标记物（如EEA1）和LE标记物（如Rab7）的内体扩增(Cormont等人，2003年).

我们不能排除的另一种可能性是，具有CD2AP调节的F-肌动蛋白依赖性运动性的特定EEA1区室中的VacA可能会迅速与Rab5分选内体混合，这些内体主要从网格蛋白途径接收其内容。这将允许其配体通过胞内载体囊泡/多囊泡体转移到LEs(格伦伯格和斯坦马克，2004年)或通过成熟过程(Rink等人，2005年).

从我们的观察结果来看，VacA和CD2AP可能描绘了一条细胞内途径，用于降解筏相关成分，如TCR(Miceli等人，2001年)。有趣的是，研究表明，在细胞分裂期间，中体包含筏状成分(Ng等人，2005年)。我们之前已经证明CD2AP参与了中体断裂(Monzo等人，2005年)。在胞质分裂后期，筏状组分的内吞/胞饮作用可以通过在中体膜下形成F-actin结构来实现。

我们没有发现CD2AP siRNA处理细胞中的VacA内化有任何改变，正如CD2AP敲除细胞中的TCR所观察到的那样(Lee等人，2003年)。突变型CD2AP的过度表达暗示CD2AP参与了几个生长因子受体的内化。特别是，含有SH3结构域的CD2AP N末端的过度表达导致生长因子受体内化的抑制(小林等，2004年)。这种效应可能与我们实验中观察到的肌动蛋白表型有关。事实上，在CD2AP的前两个SH3结构域过度表达后，我们观察到皮质肌动蛋白增加，同时F-肌动蛋白结构丢失。皮质肌动蛋白的增加可能是生长因子受体信号增加的结果，因为受体可能仍与质膜相关。令人惊讶的是，我们没有观察到CD2AP缺失对EGF受体内吞作用的任何影响（未公布的数据）。这表明SH3结构域过度表达的影响可能是另一种含有SH3的蛋白质被抑制的结果，或者另一种蛋白质在其受体内化功能中拯救CD2AP。CD2AP与适配器分子CIN85属于同一家族(迪基克，2002年)也参与受体内化(Petrelli等人，2002年；Soubeyran等人，2002年)。两个衔接蛋白之间的同源性在N末端区域最大，这表明前两个CD2AP SH3结构域的过度表达也会干扰CIN85的功能。由于CD2AP在F-actin结构上的功能没有被挽救，因此这两种蛋白质在哺乳动物细胞中似乎并不共享其所有功能。

材料和方法

细胞系、细菌株、质粒、毒素和抗体

HeLa细胞（取自人类宫颈癌；T.L.Cover的礼物，田纳西州纳什维尔范德比尔特大学）如前所述进行培养和转染(Ricci等人，2000年；Monzo等人，2005年)。全长CD2AP cDNA(Cormont等人，2003年)以及CD2AP截断形式的编码序列通过PCR扩增，并在编码GFP或DsRed序列的框架中亚克隆到pEGFP-C1或pDsRed-C1表达质粒（BD Biosciences和CLONTECH Laboratories，Inc.）。如前所述，通过定点突变获得pEGFP–CD2AP-1–175(Monzo等人，2005年)。用GFP标记的交叉蛋白的五个串联SH3结构域(Simpson等人，1999年)由P.S.McPherson（加拿大蒙特利尔麦吉尔大学）提供。VacA是从幽门螺杆菌60190株（49503；美国型培养物收藏），根据Cover和Blaser（1992）在细胞上使用之前，纯化的VacA（在所有实验中为2μg/ml）按照前面所述进行酸活化(de Bernard等人，1995年)。兔多克隆IgG 958抗VacA和-VacA单克隆抗体是T.L.Cover赠送的礼物(Garner and Cover，1996年)。多克隆抗CD2AP抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.。抗角蛋白单克隆抗体购自Upstate Biotechnology。抗微管蛋白单克隆抗体来自Sigma-Aldrich。抗-EEA1和-LAMP1单克隆抗体购自BD Biosciences。德克萨斯州红色和Cy5标记的兔IgG二级抗体购自Invitrogen，FITC或Cy5标签的抗鼠二级抗体取自DakoCytomation。Phalloidin-FITC和-TRITC购自Sigma-Aldrich，Texas红色偶联的Phalloidian和Texas红标记或FITC-标记的70-kD右旋糖酐购自Invitrogen。纯化的VacA毒素在pH 8.5的硼酸盐缓冲液中孵育，用Cy5染料标记，并通过凝胶过滤从未结合的染料中分离出标记的VacA(Yahiro等人，1999年)在使用前立即滴加0.4 N NaOH。为了排除标记程序可能改变毒素生物学行为的可能性，将Cy5-VacA的空泡化活性和细胞内转运与天然毒素进行了比较（图S5，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.2006090651/DC1).

固定、免疫荧光和显微镜检查

如前所述，通过共焦显微镜进行免疫荧光研究和分析(Ricci等人，2000年；Gauthier等人，2004年)使用PL APO 63×NA 1.40油物镜（TCS SP；徕卡）。使用Photoshop软件（Adobe）合并图像。对于内源性CD2AP标记，如前所述，用甲醇而不是PFA固定细胞(Monzo等人，2005年)。对于LAMP1检测，渗透缓冲液中的0.1%Triton X-100被0.1%皂苷取代。对于2D反褶积或3D重建，使用配有快门控制照明系统（带Fluo Arc的HB0100；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）和冷却数字CCD相机（CoolSnap HQ；Roper Scientific）的显微镜（Axiover 200；卡尔蔡司微成像公司）记录荧光信号。使用MetaMorph 2.0图像分析软件（Universal Imaging Corp.）和QuickTime Pro 5（Apple）重建图像。对于使用共焦切片的3D重建，使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院；网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/）。VacA内吞作用的研究如前所述进行(Gauthier等人，2005年)。简而言之，VacA首先与细胞在4°C下孵育1小时。在冷DME中清洗三次后，将细胞转移到DMSO-DME、细胞松弛素-DME或latrunculin B-DME中，预热至37°C，并在37°C下孵育，孵育时间如图图例所示，然后进行免疫荧光分析。CD（Sigma-Aldrich）和latrunculin B（Sigma-Aldrich）在20μM下使用。如前所述，使用液相标记物德克萨斯红-标记70-kD右旋糖酐(Gauthier等人，2005年)。使用ImageJ中的细胞计数器插件对共定位进行量化。

细胞空泡化实验

如前所述进行VacA诱导的细胞空泡化和通过中性红色染料摄取测定法定量细胞空泡化程度(Ricci等人，2000年).

通过RNA干扰（siRNA）耗尽CD2AP

如前所述，在含有10%FCS的DME中培养的HeLa细胞（40–50%融合）在35-mm直径的培养皿中转染针对CD2AP（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）的siRNA或使用寡效胺（Invitrogen）的干扰siRNA（Eurogentec）(Monzo等人，2005年)。通过Western blotting检测CD2AP表达缺失。

时间推移成像

在恒定条件下（5%CO）对细胞进行成膜2使用电动显微镜（Axiover 200；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）和冷却的数字CCD相机（CoolSnap HQ；Roper Scientific），并通过荧光或相位控制光学（LP Achroplan phase 2 20×NA 0.40和plan-NEOFLUAR 40×NA 1.3物镜）进行观察。使用MetaMorph 2.0和QuickTime Pro5记录和处理图像。

蛋白酶K处理

用CD预处理或siRNA转染的HeLa细胞在4℃下与活化的VacA孵育1h，洗涤，并在37℃孵育2h，以诱导VacA内化（t=2h）。在培养结束时，用1μg/ml蛋白酶K（Sigma-Aldrich）在4°C下处理或不处理细胞30分钟，以降解细胞外VacA。然后用含有2 mM PMSF、20%BSA和20%FCS的培养基对细胞进行广泛清洗，以阻断蛋白酶K的活性，然后用含有2mM PMSF.的培养基清洗细胞。细胞在Laemmli缓冲液中被刮除，细胞内VacA（即蛋白酶K抗性）的量通过特定抗体的Western blotting测定。

在线补充材料

图S1显示了视频5中两个放大区域所在的两个单元格。图S2显示CD对细胞的处理抑制了含VacA的小泡的运动。图S3显示了F-actin结构的一些量化。图S4显示了图6 B中所选细胞的完整区域和从底部到顶部的一些连续共聚焦截面。图S5显示Cy5-VacA毒素具有与天然细胞毒素相同的细胞内运输和空泡化活性。视频1、2和3分别是图1B、图1C和图1E中所示的三维重建HeLa细胞的360°旋转。视频4是如图2所示处理的HeLa细胞三维重建部分的360°旋转。视频5显示，含有VacA的囊泡显示出F-actin结构，并在胞浆中快速移动。视频6显示了视频5的一个特定领域，重点关注与F-actin结构相关的含VacA的囊泡的运动。视频7是三维重建HeLa细胞的360°旋转，如图3 a所示。视频8显示CD2AP与动态F-actin结构相关。视频9是按照图5（C–E）所述处理的三维重建HeLa细胞的360°旋转。视频10显示CD2AP的前两个SH3结构域的表达抑制了VacA诱导的LEs空泡化。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200609061/DC1.

补充材料

【补充材料索引】

致谢

我们感谢P.McPherson博士赠送GFP–Inter-SH3，感谢K.Bremner博士和Y.Le Marchand-Brustel博士批判性阅读手稿。

这项工作得到了国家圣母医学研究所、尼科-索菲亚-安蒂波利斯大学、癌症研究协会（3484、3240、5634和7823）、普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸地区和阿尔卑斯海岸咨询委员会的支持。感谢贝当古-舒勒基金会的支持。N.Gauthier得到了法国教育部的支持。P.Monzo先后获得了La Legue contre le Cancer、The Association pour La Recherche contre ler Cancer和Fondation Bettencourt-Schueller的奖学金。V.Ricci实验室的工作得到了意大利大学和研究部的支持（PRIN赠款2004065448_002）。

笔记

N.C.Gauthier和P.Monzo对本文的贡献相同。

N.C.Gauthier目前的地址是纽约哥伦比亚大学细胞生物学系，邮编10027。

P.Monzo现在的地址是纽约哥伦比亚大学病理学系，邮编10032。

本文中使用的缩写：CD，细胞松弛素D；CD2AP、CD2-相关蛋白；EE，早期内体；EEA1、EE抗原1；F-肌动蛋白，丝状肌动蛋白；GEEC、GPI-AP–富集的早期内体室；GPI-AP，糖基磷脂酰锚定蛋白；溶酶体相关膜蛋白1；LE，晚期内体；TCR，T细胞受体。

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社