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.1998年10月5日；143(1):207-15.
doi:10.1083/jcb.143.207。

BAX调节靶向线粒体

I S高平 1, A总量, J N Lavoie公司, M Nguyen女士, R杰默森, K Roth公司, S J Korsmeyer公司, G C肖氏
附属机构

BAX调节靶向线粒体

I S高平等。 J细胞生物学. .

摘要

促凋亡蛋白BAX在其COOH末端包含一个预测的跨膜结构域。在未受刺激的细胞中，BAX位于胞浆中，与包括线粒体在内的细胞膜外周联系，但在死亡信号后插入线粒体膜。这种在没有死亡信号的情况下插入线粒体膜的失败与NH2末端结构域对BAX跨膜信号锚定功能的抑制有关。可以通过删除结构域或用BCL-2的跨膜片段替换BAX跨膜片段来实现靶向性。在受刺激细胞中，BAX的NH2末端的作用与蛋白膜插入后该结构域的进一步暴露有关。肽基半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂zVAD-fmk部分阻断体内BAX的受刺激线粒体膜插入，这与凋亡细胞提取物支持体外BAX的线粒体靶向性的能力一致，依赖于半胱氨酸蛋白酶的激活。综上所述，我们的结果表明，BAX对线粒体的调节靶向是由BAX多肽中的离散结构域介导的，以响应死亡信号。一个或多个半胱天冬酶的作用可能反映了这种调节靶向的启动和/或放大。

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数字

图1
图1
BAX的亚细胞分布。BAX免疫反应定位于FL5.12细胞中的线粒体、核周膜和胞浆。使用兔抗BAX（P-19）抗体和山羊Cy3抗兔Ig抗体的FL5.12细胞的免疫荧光共聚焦显微镜显示点状和弥漫性细胞质免疫反应性(A类). MitoTracker绿色FM显示独家点状标记(B类). BAX和MitoTracker标记的双重暴露揭示了BAX与线粒体的共定位(黄色的)以及非线粒体BAX免疫反应(红色;C类). 常规荧光检测抗BAX（P-19）免疫反应性（Cy3）和Hoechst H33258核染色显示红色细胞质BAX免疫反应性、蓝色核Hoechst染色和两种反应重叠的粉红色核周信号(D类).
图2
图2
线粒体BAX在死亡刺激后改变其碱性和蛋白酶敏感性。(A类)BAX在死亡刺激后变得耐碱。从IL-3（lanes）培养的FL5.12细胞中制备富含线粒体的厚膜1–4)或剥夺IL-3 12小时（车道5–8)，在等渗缓冲区（通道1和2和车道5和6)，或0.1 M Na2一氧化碳三，pH 11.5（车道三和4和车道7和8)，并在200000下离心克45分钟以产生上清液(S公司)和颗粒(P（P）). 通过免疫印迹分析这些组分的BAX、BCL-2、细胞色素c氧化酶亚基iv和细胞色素c(B类)NH2-BAX末端在死亡刺激后进一步暴露。从IL-3（通道）中FL5.12细胞制备的线粒体部分1和2和车道6和7)或剥夺IL-3 12小时（车道3–5、和车道8–10)在等渗缓冲液中培养，并用胰蛋白酶（30μg/ml；lanes）处理2, 4,和5)或蛋白酶K（100μg/ml；保护.K（K），条车道7, 9,和10)，在4°C下保持20分钟。通过添加30倍重量的大豆胰蛋白酶抑制剂使胰蛋白酶失活，用苯甲基磺酰氟（1mM）使蛋白酶K失活。用抗BAX 651抗体（氨基酸43–61；lanes）进行免疫印迹分析1–4和车道6–9)或抗BAX N20抗体（氨基酸11–30；Santa Cruz Biotechnology；lanes5和10). (C类)zVAD-fmk降低了IL-3停药后BAX的线粒体膜整合。从维持在IL-3中的FL5.12细胞制备的线粒体部分（泳道1, 2, 5,和6)或剥夺IL-3 12小时（车道3, 4, 7,和8)不在（车道1, 3, 5,和7)或存在（车道2, 4, 6,和8)对50μM zVAD-fmk进行12小时的直接分析（车道1–4)或用0.1 M Na萃取后2一氧化碳三，pH 11.5（车道5–8)，如中所述A类.
图2
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线粒体BAX在死亡刺激后改变其碱性和蛋白酶敏感性。(A类)BAX在死亡刺激后变得耐碱。从IL-3（lanes）培养的FL5.12细胞中制备富含线粒体的厚膜1–4)或停用IL-3 12小时（泳道5–8)，在等渗缓冲区（通道1和2和车道5和6)，或0.1 M Na2一氧化碳三，pH 11.5（车道三和4和车道7和8)，并在200000下离心克45分钟以产生上清液(S公司)和颗粒(P（P）). 通过免疫印迹分析这些组分的BAX、BCL-2、细胞色素c氧化酶亚基iv和细胞色素c(B类)NH2-BAX末端在死亡刺激后进一步暴露。从IL-3（通道）中FL5.12细胞制备的线粒体部分1和2和车道6和7)或剥夺IL-3 12小时（车道3–5、和车道8–10)在等渗缓冲液中培养，并用胰蛋白酶（30μg/ml；lanes）处理2, 4,和5)或蛋白酶K（100μg/ml；突起.K（K），车道7, 9,和10)，在4°C下保持20分钟。通过添加30倍重量的大豆胰蛋白酶抑制剂使胰蛋白酶失活，用苯甲基磺酰氟（1mM）使蛋白酶K失活。用抗BAX 651抗体（氨基酸43–61；lanes）进行免疫印迹分析1–4和车道6–9)或抗BAX N20抗体（氨基酸11–30；Santa Cruz Biotechnology；lanes5和10). (C类)zVAD-fmk减少IL-3退出后BAX的线粒体膜整合。由IL-3（通道）中保存的FL5.12细胞制备的线粒体部分1, 2, 5,和6)或剥夺IL-3 12小时（车道3, 4, 7,和8)不在（车道1, 3, 5,和7)或存在（车道2, 4, 6,和8)对50μM zVAD-fmk进行12小时的直接分析（车道1–4)或用0.1M Na萃取后2一氧化碳三，pH 11.5（车道5–8)，如中所述A类.
图2
图2
线粒体BAX在死亡刺激后改变其碱性和蛋白酶敏感性。(A类)BAX在死亡刺激后变得耐碱。从IL-3（lanes）培养的FL5.12细胞中制备富含线粒体的厚膜1–4)或剥夺IL-3 12小时（车道5–8)，在等渗缓冲区（通道1和2和车道5和6)，或0.1 M Na2一氧化碳三，pH 11.5（车道三和4和车道7和8)，并在200000下离心克45分钟以产生上清液(S公司)和颗粒(P（P）). 通过免疫印迹分析这些组分的BAX、BCL-2、细胞色素c氧化酶亚基iv和细胞色素c(B类)NH2-BAX末端在死亡刺激后进一步暴露。从IL-3中的FL5.12细胞制备的线粒体部分（泳道1和2和车道6和7)或剥夺IL-3 12小时（车道3–5、和车道8–10)在等渗缓冲液中培养，并用胰蛋白酶（30μg/ml；lanes）处理2, 4,和5)或蛋白酶K（100μg/ml；保护.K（K），条车道7, 9,和10)，在4°C下保持20分钟。通过添加30倍重量的大豆胰蛋白酶抑制剂使胰蛋白酶失活，用苯甲基磺酰氟（1mM）使蛋白酶K失活。用抗BAX 651抗体（氨基酸43–61；lanes）进行免疫印迹分析1–4和车道6–9)或抗BAX N20抗体（氨基酸11–30；Santa Cruz Biotechnology；lanes5和10). (C类)zVAD-fmk减少IL-3退出后BAX的线粒体膜整合。由IL-3（通道）中保存的FL5.12细胞制备的线粒体部分1、2、5，和6)或剥夺IL-3 12小时（车道3, 4, 7,和8)不在（车道1, 3, 5,和7)或存在（车道2, 4, 6,和8)对50μM zVAD-fmk进行12小时的直接分析（车道1–4)或用0.1 M Na萃取后2一氧化碳三，pH 11.5（车道5–8)，如中所述A类.
图3
图3
BAX构建物及其体外线粒体靶向能力。ART域(灰色方框); TM（TM）(黑匣子); +, 目标能力；−，针对不称职的人。显示了所示物种的BAX的1-20个氨基酸。有关其他详细信息，请参阅文本。
图4
图4
凋亡细胞提取物支持BAX体外靶向线粒体。(A类)35S标记的转录翻译产物行李将兔网织红细胞裂解物（BAX和BAXΔART）中的cDNA与来自大鼠心脏的纯化完整线粒体进行孵育，在标准蛋白导入反应中添加1 mM dATP（lanes3, 4, 6,和7)或1 mM dATP和200μg凋亡胞浆蛋白(提取; 车道4和7)体积为50μl。反应结束时，通过离心法回收线粒体，直接或用0.1M Na萃取后，通过SDS-PAGE和荧光照相法分析颗粒2一氧化碳三，pH 11.5(碱性; 车道5–7). 车道1，输入翻译产品的10%。(B类)如中所示A类除了进口是用行李Δ1-19cDNA转录产物（lane2)如图所示，在4°C或30°C下，用0.1M Na提取线粒体后进行分析2一氧化碳三，pH 11.5（泳道4和5). (C类)35S标记的转录-翻译产物PARP项目网织红细胞裂解物（5%体积）中的cDNA与（lanes）孵育2和三)或不带（车道1)100μg凋亡细胞溶质蛋白，总体积为20μl，存在（lane三)或不在（车道1和2)对1 mM dATP和等效部分的PARP 24-kD裂解产物的外观进行分析(24K帕尔普)通过12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光成像。(D类)如中所示A、，除进口前外，线粒体均用0.4mg/ml胰蛋白酶和50倍重量的大豆胰蛋白酶抑制剂处理（−胰蛋白酶前体; 柱2和4)或者在最后(+胰蛋白酶前体; 柱1和三)反应的结果。通过离心收集线粒体，并在存在的情况下导入（柱三和4)或不存在（列1和2)凋亡细胞溶质(提取)，并测定了碱不溶性全长BAX的相对量（最大设置为100）。
图5
图5
BAX在体外靶向线粒体的失败取决于编码BAX的BAX TM cDNA（泳道2–5个)，细胞溶质二氢叶酸还原酶在其COOH末端与BAX的169–192氨基酸融合(DHFR-BAX公司™，车道7–10)和BAX，其中COOH末端24个氨基酸被BCL-2的相应结构域（氨基酸218-239）取代(BAX-BCL-2型™，车道12–15)在网织红细胞裂解物中转录和翻译35用SDS-PAGE和荧光法分析S-标记的碱不溶性线粒体输入产物。车道1, 6,和11如图所示，占输入翻译产品的10%。显示了BAX的COOH端24个氨基酸和BCL-2的22个氨基酸的序列（单字母代码）；粗体字母表示预测的TM。
图6
图6
凋亡高速胞质溶胶在体外支持BAX靶向线粒体的能力取决于细胞色素c，并被zVAD-fmk抑制。(A类)35BAX cDNA的S标记转录翻译产物在0（lanes）存在的情况下进行体外线粒体导入2和6)，13（车道三和7)，65（车道4和8)或260（车道5和9)μg凋亡高速cytrosolic蛋白(提取)带（车道6–9)或不带（车道2–5)添加细胞色素c(细胞色素C; 75μg/ml），并在SDS-PAGE和荧光成像后观察耐碱产品。车道1，输入翻译产品的10%。(B类;左边)通过免疫吸附从凋亡细胞提取物中去除细胞色素c(Cyt C减去提取物)使用小鼠单克隆2G8.B6抗体（Mueller和Jemmerson，1996）（Liu等人，1996）。车道前提取物的等效等分1)和之后（车道2)使用抗细胞色素c的小鼠单克隆7H8.2C12抗体通过Western免疫印迹分析免疫吸附（Liu等人，1996），并通过增强化学发光进行可视化。(中部)BAX翻译产物的膜插入是通过在pH 11.5下的抗萃取性来测定的，按照A类在存在或不存在凋亡胞质溶胶的情况下，如图所示，在添加dATP和在37°c下孵育之前，已经或没有用抗细胞色素c进行免疫吸附或补充了添加的细胞色素c。(赖特)如图4所示，在所示条件下测定了这种相同的凋亡胞质溶胶产生PARP的24kD凋亡切割产物的能力。(C类)凋亡的高速胞浆支持BAX膜插入的能力2–4;左边)和PARP裂解(正确的)按中的方法进行分析A类存在或不存在50μM四肽zVAD-fmk，在添加dATP并在37°C下孵育之前，从溶于二甲基亚砜的100倍浓缩储备液中输送。该溶剂的当量体积对BAX进口没有影响(左边，车道三).
图6
图6
凋亡的高速细胞液在体外支持BAX靶向线粒体的能力依赖于细胞色素c，并被zVAD-fmk抑制。(A类)35BAX cDNA的S标记转录翻译产物在0（lanes）存在的情况下进行体外线粒体导入2和6)，13（车道三和7)，65（车道4和8)或260（车道5和9)μg凋亡高速cytrosolic蛋白(提取)带（车道6–9)或不带（车道2–5个)添加细胞色素c(细胞色素C; 75μg/ml），并在SDS-PAGE和荧光成像后观察耐碱产品。车道1，输入翻译产品的10%。(B类;左边)通过免疫吸附从凋亡细胞提取物中去除细胞色素c(Cyt C减去提取物)使用小鼠单克隆2G8.B6抗体（Mueller和Jemmerson，1996）（Liu等人，1996）。车道前提取物的等效等分1)和之后（车道2)使用抗细胞色素c的小鼠单克隆7H8.2C12抗体通过Western免疫印迹分析免疫吸附（Liu等人，1996），并通过增强化学发光进行可视化。(中部)BAX翻译产物的膜插入是通过在pH 11.5下的抗萃取性来测定的，按照A类如图所示，在存在或不存在凋亡细胞液的情况下，细胞液在添加dATP和37°c孵育之前，已经或没有用抗细胞色素c进行免疫吸附或补充细胞色素c。(赖特)如图4所示，在所示的条件下，测定相同凋亡细胞液生成PARP 24-kD凋亡裂解产物的能力。(C类)凋亡的高速胞浆支持BAX膜插入的能力2–4;左边)和PARP裂解(正确的)按中的方法进行分析A类存在或不存在50μM四肽zVAD-fmk，在添加dATP并在37°C下孵育之前，从溶于二甲基亚砜的100倍浓缩储备液中输送。该溶剂的当量体积对BAX进口没有影响(左边，车道三).
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