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发展。2012年1月15日；139(2): 411–422.
数字对象标识：10.1242/dev.075366
PMCID公司：PMC3243099项目
PMID：22186730

ROCK1定向基底膜定位协调上皮组织极性

威廉·戴利,1,2,* Elise M.Gervais公司,1,2 塞缪尔·森坦尼,2,‡ 凯瑟琳·古尔福（Kathryn M.Gulfo）,2,§ 迪尔德雷·纳尔逊,2和梅琳达·拉森2,†
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摘要

基底膜对上皮组织的组织和功能至关重要。然而，基底膜局限于上皮组织基底边缘的机制以及调节协调组织组织的基底膜介导信号尚不明确。在这里，我们报道了Rho激酶（ROCK）通过限制基底膜到发育小鼠颌下腺的上皮基底外周来控制协调组织组织，并且ROCK抑制导致异位基底膜在整个上皮室中积聚。外基底上皮细胞层PAR-1b（MARK2）定位的ROCK调节限制是组织外围基底膜定位所必需的。PAR-1b是基底膜沉积的特殊需要物，因为抑制PAR-1b激酶活性可阻止基底膜沉积并破坏整个组织组织，抑制PAR-2b和ROCK抑制可防止基底膜内部积聚。相反，野生型PAR-1b的异位过度表达导致异位内基底膜沉积。值得注意的是，在存在ROCK1或PAR-1b抑制的情况下，在外源性基底膜上培养唾液上皮细胞可以拯救上皮组织，而这种基底膜介导的拯救需要功能性整合素β1来维持上皮细胞间的粘附。综上所述，这些研究表明，需要依赖ROCK1/PAR-1b调节基底膜的放置，以协调组织极性和细化正在发育的颌下腺中的组织结构。

关键词：PAR-1b（MARK2），ROCK，基底膜，形态发生，极性，唾液腺，小鼠

简介

组织功能来源于组织结构，并取决于其特殊细胞类型的精确组织。正常组织组织的丧失是许多疾病的一个决定性特征，也是疾病发展的先决条件(Bissell等人，2003年;查宾和卡普兰，2010年;柯林斯和邦尼曼，2010年). 当细胞获得根尖极性时，上皮组织在发育过程中建立(布莱恩特和莫斯托夫，2008年;纳尔逊，2003年). 单个细胞的极性还必须在组织水平上进行协调，但控制组织水平极性协调的分子机制尚不清楚。

上皮细胞的组织和功能需要来自周围微环境的位置信息(布莱恩特和莫斯托夫，2008年;Kass等人，2007年); 这些线索包括与相邻细胞和基底膜的接触。细胞-细胞连接在建立顶鼻极性中的重要作用已被确定(Vega-Salas等人，1987a;Vega-Salas等人，1987年b;惠洛克和约翰逊，2003a;惠洛克和约翰逊，2003b)在许多发育和基于3D细胞的模型系统中，基底膜介导的信号传导是顶端结构域建立和细胞间连接形成的先决条件(Li等人，2003年;Miner和Yurcenco，2004年;Plachot等人，2009年;Weir等人，2006年). 基底膜位于上皮细胞基底表面的下方；它提供结构支撑，形成细胞粘附的支架(Sequeira等人，2010年;尤尔琴科和沃兹沃思，2004年)将上皮细胞与周围基质分离并调节细胞行为(Kalluri，2003年;Yurcenco等人，2004年). 基底膜主动重塑介导上皮形态发生过程中组织形态的改变(伯恩菲尔德和班纳吉，1982年;Bernfield等人，1984年;Nakanishi和Ishii，1989年)对组织稳态至关重要(Larsen等人，2006a;Xu等人，2009年). 因此，确定基底膜定位和影响上皮组织组织的分子机制对于理解上皮器官的发育和疾病至关重要。

使用哺乳动物细胞系的研究揭示了细胞极性的复杂调节(Goldstein和Macara，2007年;铃木和大野，2006年). 顶端PAR复合体和基底外侧PAR-1b（也称为MARK2和EMK1）激酶是建立上皮极性所必需的(Etemad-Moghadam等人，1995年;Guo和Kemphues，1995年;洪堡和坎普斯，1999年;铃木和大野，2006年;Tabuse等人，1998年)它们的互补定位部分是通过互斥过程来控制的(本顿和圣约翰斯顿，2003年;铃木等人，2004年). 虽然顶端PAR复合体是建立上皮细胞-细胞连接所必需的(Hirose等人，2002年;Suzuki等人，2001年)，PAR-1b定义基底外侧结构域的机制尚不清楚。然而，最近的一项研究表明，PAR-1b通过限制层粘连蛋白受体的定位，促进了培养细胞基底膜内层粘连素的沉积(Masuda-Hirata等人，2009年).

为了确定基底膜和细胞极性如何控制上皮组织结构，我们利用小鼠胚胎颌下腺的离体器官培养(格罗布斯坦，1953年;Patel等人，2006年)其发展需要与基底膜相互作用(伯恩菲尔德和班纳吉，1982年;Larsen等人，2006b;Rebustini等人，2009年;Sakai等人，2003年). Rho相关的线圈内含激酶（ROCK）调节肺上皮形态发生(Moore等人，2005年)，肾脏(Meyer等人，2006年;Michael等人，2005年)和唾液腺(Daley等人，2009年). 在唾液腺和肺的发育过程中，ROCK促进基底膜重塑，通过需要细胞收缩力的肌球蛋白II依赖途径调节组织形状的变化(Daley等人，2009年;Moore等人，2005年). 最近的研究也表明ROCK通过与顶端PAR复合体的相互作用控制细胞极性(石内和武一，2011年;Nakayama等人，2008年;Simoes Sde等人，2010年). 在此，我们确定了ROCK1在调节PAR-1b功能和由此产生的基底膜定位中的一种新功能，以控制唾液腺发育过程中的组织极性，这一作用在生化上与先前报道的肌球蛋白依赖性途径不同，ROCK通过该途径调节上皮形态发生。我们证明，ROCK通过限制基底膜与上皮外围的结合，使细胞极性对齐，从而形成有序的组织结构。我们还证明，需要功能性整合素β1的ROCK和PAR-1b下游的基底膜介导的外源性信号可促进上皮细胞形态和细胞间粘附的维持。这些研究为基底膜控制上皮完整性和组织的机制提供了新的见解。

材料和方法

离体器官培养

按照奥尔巴尼大学IACUC委员会批准的方案，在胚胎第13天（E）13天（塞子定义为E0天），从定时怀孕雌性小鼠（CD-1株，Charles River Laboratories）上解剖小鼠颌下腺，并按照之前所述进行培养(Daley等人，2009年;Rebustini和Hoffman，2009年;Sakai和Onodera，2008年). 按照说明进行重新聚集分析(Wei等人，2007年). 对于病毒感染，用1:100稀释的激酶脱敏PAR-1b或1:20稀释的野生型PAR-1b腺病毒感染上皮雏形1小时(Bohm等人，1997年;Cohen等人，2004年)并与四种E13间充质重组或在Matrigel中培养（BD Biosciences；用培养基1:1稀释）。如前所述，使用了药理抑制剂Y27632和（-）-布利司他丁（钙生物化学）以及ROCK1和ROCK2 siRNA(Daley等人，2009年). PAR-1b siRNA的使用类似（s65472和s65473，应用生物系统）。按说明进行形态分析(Daley等人，2009年).

免疫细胞化学和免疫印迹

基本上按照所述进行免疫染色和共焦显微镜检查(Daley等人，2009年;Larsen等人，2003年)所有抗体孵育在4°C下过夜。按照说明进行蛋白质分析和免疫印迹(Daley等人，2009年;Larsen等人，2003年). 有关抗体和稀释液，请参见表1.

细胞培养分析

成年颌下腺导管上皮细胞系小鼠SIMS细胞(Laoide等人，1996年;Laoide等人，1999年)，在含有10%FBS和抗生素（Invitrogen）的DMEM中培养。用20μM Y27632处理SIMS细胞长达18小时，或用1μg PAR-1b siRNA转染48小时（s65472和s65473）。在一些实验中，用Y27632或PAR-1b siRNA在玻璃上处理细胞18小时，胰酶化，转移到涂有薄层（20μl）Matrigel的微孔培养皿中，用DMEM/F12培养基稀释1:1，并在抑制剂的持续存在下再培养18小时。

用于悬滴培养(Foty，2011年;Foty和Steinberg，2005年), 2×10三将SIMS细胞重新悬浮在组织培养皿盖上的20μl滴液中，倒置在PBS上，并培养48小时。对于siRNA治疗，将细胞转染到玻璃上18小时，转移到悬挂液中，再培养18小时。如前所述，固定细胞并进行免疫细胞化学处理(Cukierman等人，2001年;Daley等人，2009年)并用蔡司细胞观测器Z1拍摄。请参见表1抗体和稀释液。

对于细胞迁移分析，SIMS细胞与载体对照或20μM Y27632在玻璃或1:1 Matrigel上培养。使用蔡司细胞观察仪Z1进行时间推移显微镜检查(Daley等人，2009年)并按照描述进行量化(Larsen等人，2006b)使用Volocity（即兴）。显示图形，并使用GraphPad Prism通过Bonferroni后验进行双向方差分析（ANOVA）。

结果

ROCK1将基底膜限制在正在发育的唾液腺上皮的基底边缘

小鼠E13颌下腺上皮由上皮芽组成，上皮芽上有一层有组织的外柱状细胞（OCCs），围绕着不太有组织的中央或内部多形细胞簇（IPCs）(2010年，Kadoya和Yamashina;Walker等人，2008年). 当与ROCK抑制剂Y27632一起培养时，OCC的柱状形态消失，呈现出较不规则的外观(图1A). 由于OCC直接接触基底膜，我们质疑这种ROCK抑制剂诱导的细胞组织丢失是否与基底膜调控不当有关。在对照培养物中，基底膜蛋白纤维连接蛋白、珍珠糖、IV型胶原和层粘连蛋白111（α1、β1、γ1(图1B，补充材料图S1A）。x轴共焦叠加投影显示，这种积聚发生在整个上皮细胞中(图1B)，主要是共定位的（补充材料图S1A，B）和细胞外的（补充物质图S1C，D）。肌球蛋白轻链2是ROCK的下游效应器(Totsukawa等人，2000年)这是在发育中的唾液腺中纤维结合蛋白的组装和随后的分支形态发生所必需的(Daley等人，2009年); 然而，经肌球蛋白抑制剂布利司他丁治疗的腺体几乎没有异常的基底膜内积聚(图1C). 因此，基膜定位不需要非肌肉肌球蛋白II型活性，这表明该功能需要ROCK下游的另一条通路。

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ROCK1限制了颌下腺发育过程中基底膜的位置。(A类)如图所示，小鼠E13唾液腺由围绕内部多态性细胞（IPC）的外柱状细胞（OCCs）组成，核染料SYBR Green（绿色）和Na的膜染色+/K（K）+-ATP酶（红色）。使用岩石抑制剂Y27632时，OCC形态消失（箭头所示）。虚线表示芽的基部外围。(B类)用Y27632或ROCK1 siRNA培养的E13腺体在上皮内显示纤维连接蛋白（绿色）和珍珠糖（青色）（E-cadherin，红色），而载体控制和ROCK2 siRNA转染的腺体仅将这些蛋白质定位在基底膜中（箭头）。单个中央共焦切片和x轴投影如图所示。(C类)用抑制素抑制E13腺体中的肌球蛋白II不会改变OCC形态（箭头所示），也不会诱导内部基底膜（IV型胶原，青色）。E、 上皮；M、 间充质。比例尺：10μm。

由于OCC直接接触基底膜，我们推断这些细胞可能负责其生成。为了验证这一假设，我们使用了一种原代细胞聚集试验，将唾液腺解离成单细胞悬浮液，该悬浮液可以重新聚集并进行分支形态发生(Wei等人，2007年). 在Y27632存在的情况下，组织聚集体的组织结构不如对照组，这表明尽管ROCK抑制不能阻止原代细胞的重新结合，但它确实会影响其组织结构(图2A). 在分离8小时后的对照聚集物中，基底边缘的细胞亚群显示IV型胶原的细胞质和基底定位，72小时后，IV型胶原在每个聚集物中显示出连续的周边基底定位，表明基底膜已经重新组装(图2B). 在Y27632处理的聚集物分离8小时后，在聚集物中检测到细胞IV型胶原，72小时后，聚集的IV型胶原遍布上皮芽(图2B). 纤维结合蛋白和珍珠岩聚糖也证明在岩石抑制骨料内部沉积不当（数据未显示）。这些结果表明，在缺乏ROCK活性的情况下，基底膜是由整个上皮细胞室的细胞合成、分泌和组装的，而不是像对照腺体那样仅由组织基底周的细胞合成。

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唾液腺内细胞在没有ROCK信号的情况下分泌和组装基底膜。(A类)细胞聚集分析示意图。分离成单个细胞的小鼠E13唾液腺进行重新聚集。Y27632存在时会形成骨料，但与车内控制相比，骨料分支较少，且更无组织。(B类)8小时后，基底膜（IV型胶原，青色）仅由载体对照组的外围细胞合成和组装，而Y27632处理的培养物中的整个上皮细胞（E-cadherin，红色）合成和组装（箭头所示）。72小时后，IV型胶原在溶媒对照组中已组装成基底膜，但在ROCK抑制聚集物的上皮芽内积聚。(C类)在Y27632存在下，SIMS细胞在玻璃上培养时，其速度、位移和总移动距离均降低，而在Matrigel（Mat）上培养时则没有降低。误差条表示s.e.m.方差分析，*P（P）<0.05, **P（P）<0.01; ns，不显著。比例尺：250μm in A；B中为10μm。

由于唾液上皮细胞在胚胎发育期间动态移动(Larsen等人，2006年b)ROCK抑制后，组织聚集体内部的上皮细胞合成并分泌基底膜，我们质疑当ROCK信号受到干扰时，正常合成基底膜的外细胞是否会迁移到芽内部。我们分析了SIMS唾液腺上皮细胞在玻璃或基底膜替代物Matrigel上的迁移。ROCK抑制的SIMS细胞迁移速度比车辆控制处理的细胞慢，在玻璃上移动的距离更短(图2C，补充材料图S2）。生长在Matrigel上模拟唾液OCCs的SIMS细胞迁移速度明显慢于玻璃上的细胞，并且移动距离更短；然而，在这种情况下，ROCK抑制对细胞迁移没有影响(图2C，补充材料图S2）。这些结果表明，基底膜调节ROCK抑制对细胞运动的影响，并表明，在Y27632处理的完整组织中，OCC向芽内迁移的增强不太可能是导致内部基底膜积聚的主要细胞反应。相反，ROCK的作用可能是限制上皮外周基底膜的生成。

ROCK1通过调节基底膜的放置来协调上皮组织组织

我们的结果表明，当ROCK被抑制时，通常不产生基底膜的IPC可以产生基底膜，我们假设这些内部细胞可能经历顶叶极化。腺体上皮组织具有特殊的顶端膜域，在成人组织中与管腔接触，并被细胞内紧密连接所包围。在E13唾液腺中，β-肌动蛋白和紧密连接蛋白ZO-1（TJP1–小鼠基因组信息学）积聚在细胞化导管和芽的中心，管腔随后将在此形成。在对对照腺体的时间进程分析中，ZO-1和肌动蛋白逐渐定位于上皮芽的中心，因此，到96小时时，每个芽都有一个明确的顶端定位管腔(图3A). 相反，在Y27632处理的腺体中，我们观察到细胞簇围绕着贯穿芽的肌动蛋白和ZO-1的中央定位积聚，异位基底膜位于顶端积聚的对面，这一点通过线剖面图得到了证实(图3A、B). 这与静止在连续基底膜上的对照芽的基底周边的单一排列OCC层形成对比，并表明在缺乏ROCK信号的情况下，内部细胞经历异常极化，尽管相对于整个组织是以不协调的方式。

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ROCK在全球组织水平上协调单个细胞的极性。(A类)培养96小时后，对照小鼠唾液腺在上皮芽内集中积聚β-肌动蛋白（红色）和ZO-1（绿色）。相比之下，在使用Y27632治疗的腺体中，这些蛋白质在整个扩张的上皮芽的多个位置上存在。(B类)ROCK抑制的上皮芽的荧光强度线轮廓（在A中所示的位置）显示，肌动蛋白（红色箭头）和ZO-1（绿色箭头）出现在细胞基底膜的对面，如IV型胶原（青色箭头）所示。(C类)在玻璃上培养的SIMS细胞沿细胞边界定位ZO-1（绿色）(xy公司投影），但在Matrigel培养的细胞顶部（IV型胶原，青色）(x轴预测）持续48小时。用整合素β1功能阻断抗体Ha2/5培养在Matrigel上的SIMS细胞，但没有用对照IgG培养，在细胞内出现弥漫性ZO-1z（z）尺寸。Ap，顶端；低音，基音。比例尺：A右侧5μm；A左和C中为20μm。

鉴于先前确定的基底膜在确定上皮顶端极性方向中的作用(O'Brien等人，2001年;Yu等人，2005年)，我们推测异位基底膜可能直接诱导内细胞极化。为了测试基底膜是否能诱导唾液腺上皮细胞的顶端极性，我们比较了玻璃和基质培养的SIMS细胞中ZO-1的定位。虽然ZO-1存在于玻璃上细胞的整个侧膜上，但它更局限于基质细胞的顶部(图3C). 由于整合素β1是基底膜介导的极性信号的主要传感器(Yu等人，2005年)，我们测试了整合素β1介导的极性信号的功能。当Matrigel上的SIMS细胞用Ha2/5处理时，ZO-1在细胞-细胞边界的定位类似于SIMS细胞在玻璃上的定位，Ha2/5是一种特异性干扰整合素β1功能的功能阻断抗体，但不是用同种型匹配的对照IgG(图3C). 皮质肌动蛋白网也位于Matrigel上的细胞顶部，并被Ha2/5破坏（数据未显示）。因此，通过整合素β1介导的基底膜介导的外源性信号引导唾液上皮细胞的顶端极性，并可能在缺乏ROCK的情况下驱动上皮细胞的不协调排列。

ROCK1调节PAR-1b

极性蛋白PAR-1b定位于极化上皮细胞的基底外侧结构域，通过限制层粘连蛋白受体的定位，部分促进层粘连素在基底膜内的积累(Masuda-Hirata等人，2009年;Yamashita等人，2010年). 因此，ROCK可能会调节PAR-1b，从而影响发育中唾液腺的基底膜定位。ROCK抑制增加PAR-1b总蛋白水平(图4A). 此外，在对照腺体中，PAR-1b优先定位于OCC的基底外侧皮质，并在IPC中广泛定位(图4B)而在岩石抑制腺体中，OCC中PAR-1b的协调基底外侧定位丢失，而在IPC中检测到皮质PAR-1a增加(图4B). 值得注意的是，ROCK抑制的IPCs中的皮质PAR-1b与整个上皮的基底膜积聚密切相关(图4C). 与OCC形态与非肌肉肌球蛋白II型功能的独立性一致(图1C)，抑泡剂处理的唾液腺中的PAR-1b定位与对照组无明显区别(图4B). 这些数据表明，ROCK独立于肌球蛋白II，促进PAR-1b蛋白定位到基底膜附近上皮细胞的基底外侧皮质。

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ROCK独立于肌球蛋白，调节发育中唾液腺中PAR-1b的定位。(A类)免疫印迹显示，与Y27632培养24小时的小鼠E13唾液腺中PAR-1b蛋白水平升高。量化是相对于GAPDH显示的。(B类)免疫细胞化学显示，PAR-1b（青色）优先定位于E13唾液腺OCC的基底外侧区，并在IPC中扩散。虽然PAR-1b定位与阻隔剂处理的E13腺体中的载体控制无明显区别，但Y27632对ROCK的抑制导致PAR-1bOCC基底外侧区限制的坐标丢失，并导致其在IPC的皮层积聚（箭头所示）。上皮细胞用E-cadherin（红色）标记，细胞核用SYBR绿色（蓝色）标记。(C类)ROCK抑制的上皮芽的线剖面显示，IPC皮层PAR-1b（青色）定位错误与ROCK抑制剂诱导的基底膜（珍珠糖，红色）积聚密切相关（箭头）。比例尺：B中为5μm；10μm（单位：C）。

PAR-1b对于促进异位基底膜沉积是必要且充分的

为了确定PAR-1b是否调节基底膜沉积，用PAR-1b-特异性siRNAs处理E13唾液腺，并检测其对基底膜的影响。这些实验表明胶原蛋白IV的生成减少(图5A)和本地化(图5B)与对照组相比，PAR-1b siRNA-处理的腺体中。为了确定ROCK抑制剂诱导的上皮内基底膜异位积聚是否需要PAR-1b，我们用Y27632和PAR-1b-siRNA处理腺体。PAR-1b可显著减少上皮芽内胶原IV的积聚，但不能控制siRNA(图5B). 此外，在PAR-1b siRNA处理的腺体上皮外周和整个上皮细胞隔室中，PAR-1b-siRNA和Y27632处理的其他几种基底膜蛋白均减少（补充材料图S3），这表明PAR-1a是全球基底膜沉积所必需的。

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PAR-1b对于唾液腺上皮芽中的基膜蛋白沉积是必要的和充分的。(A类)免疫印迹显示，相对于GAPDH，PAR-1b和IV型胶原α1和α2链蛋白水平在48小时后降低，但非靶向阴性对照（NS）siRNA没有降低。(B类)IV型胶原（青色）的免疫细胞化学研究表明，PAR-1b降低后，完整小鼠E13唾液腺基底膜定位降低。当用Y27632（Y）和PAR-1b siRNA处理时，岩石抑制剂诱导的内部基底膜减少。图像覆盖在DIC图像上，白色虚线表示芽的基底边缘。(C类)用PAR-1b siRNA转染或用Myc-PAR1b-KD转染的重组培养物显示，上皮芽基底周边IV型胶原沉积（红色）减少，E-cadherin（青色）去标记上皮。(D类,E类)感染Myc-PAR1b-WT的重组培养物显示，48（D）和96（E）小时后，上皮芽内IV型胶原（青色）异位表达，与PAR-1b（红色）和Myc（绿色）一致。箭头，IV型胶原积聚与myc一致。比例尺：10μm。

为了确定基底膜沉积是否需要PAR-1b激酶活性，腺病毒表达缺乏其激酶结构域的显性阴性PAR-1b-KD(Bohm等人，1997年;Cohen等人，2004年)用于感染腺体，并将其对基底膜的影响与PAR-1b siRNA进行了比较。由于腺病毒感染唾液腺上皮需要去除间质(Larsen等人，2006b)我们用Myc-PAR1b-KD或对照GFP腺病毒感染上皮雏形，并重组上皮和间充质，以重演腺体结构（补充材料图S4）。值得注意的是，PAR-1b siRNA或Myc-PAR1b-KD降低了IV型胶原在上皮芽基底周的定位(图5C)，证明基底膜沉积需要PAR-1b激酶活性。

由于在ROCK抑制的条件下，PAR-1b在IPC皮层定位错误，而在IPC皮质中，ROCK抑制剂诱导的基底膜积聚需要PAR-1b，因此我们质疑野生型PAR-1a在整个上皮芽中的异位过度表达是否足以重现这种效应。如完整的E13器官外植体所示(图4B)在用ROCK抑制剂处理的重组培养物中，PAR-1b也在IPC皮层定位错误(图5D). 类似地，当我们用野生型PAR-1b腺病毒（Myc-PAR1b-WT）感染重组培养物时，我们观察到PAR-1a在整个上皮细胞中的高水平表达与Myc标签相关，甚至在IPC中，它通常是弥漫性定位的(图5D，补充材料图S4D）。值得注意的是，感染Myc-PAR1b-WT的重组培养物在48小时后显示整个上皮细胞IV型胶原表达增加，这与表达Myc-和PAR-1b的IPCs密切相关(图5D，补充材料图S4D），96小时时，IV型胶原似乎是细胞外的(图5E). 综上所述，这些数据表明异位PAR-1b定位错误对于上皮细胞室中的基底膜沉积是必要的，也是充分的。

PAR-1b功能是唾液腺上皮协调极化所必需的

基底膜重构在涎腺分支形态发生过程中调节组织形态(伯恩菲尔德和班纳吉，1982年;Kadoya等人，2003年;Rebustini等人，2009年;Rebustini等人，2007年;Sakai等人，2003年). 与基底膜沉积中对PAR-1b的需求一致，在完整的E13唾液腺或分别用PAR-1b-siRNA或Myc-PAR1b-KD处理的重组培养物中，分支形态发生减少。有趣的是，Myc-PAR1b-WT的过度表达也抑制了重组培养物中的分支形态发生，表明唾液腺发育需要适当水平的PAR-1b（补充材料图S5A，B）。

为了研究PAR-1b在获得协调上皮结构中的作用，我们检查了缺乏PAR-1a功能的E13腺体的OCC形态。如所示图6A当PAR-1b特异性siRNAs降低PAR-1a蛋白水平时，与阴性对照组相比，OCC形态受到了严重破坏(图6A). 在Myc-PAR1b-KD感染的重组培养物中，OCC组织也被破坏(图5C)表明PAR-1b激酶活性是维持OCC柱状形态所必需的。为了确定当PAR-1b功能受到抑制时，OCC组织的这种丧失是否是由基底膜沉积减少引起的，我们用PAR-1b-siRNA或Myc-PAR1b-KD处理E13腺上皮雏形，并将其培养在Matrigel上。尽管在PAR-1b siRNA或Myc-PAR1b-KD存在的情况下，上皮原质基底周的基底膜沉积减少，但与PAR-1b功能受到干扰的完整或重组培养物相比，在外源性基底膜存在的情况下，外部细胞似乎更具组织性和柱状(图6B)尽管内源性基膜沉积存在缺陷。为了直接测试外源性基底膜是否可以挽救缺乏PAR-1b细胞的细胞结构丢失，用PAR-1b-siRNA处理玻璃培养的SIMS细胞，观察到细胞扩散增加和上皮组织丢失。相比之下，在Matrigel薄层上培养可以挽救细胞形态的这些变化（补充材料图S6A、B）。由于PAR-1b介导的基底膜调节影响唾液腺组织组织，因此它也可能通过抑制ROCK来调节IPC中的顶膜积聚。如所示图6C用Y27632和PAR-1b siRNA处理E13唾液腺，与用Y27232和对照siRNA处理的腺体相比，基底膜的积累和相反的顶端蛋白的积累都减少了(图6C). 这些结果表明，PAR-1b激酶活性是唾液腺上皮细胞细胞构筑的关键决定因素，并表明PAR-1a通过调节基底膜沉积调节这一功能。

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PAR-1b介导的基底膜定位调节是唾液腺上皮在组织水平上协调极化所必需的。(A类)小鼠E13唾液腺OCC柱状形态（白色轮廓）被PAR-1b破坏，但非NS siRNAs破坏。PAR-1b siRNA也降低了外周基底膜（珍珠糖、青色）；E-cadherin标记上皮膜。(B类)当在Matrigel中培养时，通过PAR-1b siRNA转染或感染Myc-PAR1b-KD可挽救OCC组织。当PAR-1b功能受到干扰时，IV型胶原（青色）的免疫细胞化学显示基底膜破坏，但OCC形态（E-钙粘蛋白，红色；SYBR绿色，蓝色）与基质胶保持柱状。(C类)当E13腺体与Y27632和PAR-1b siRNA一起培养，但与Y27632和NS siRNA不一起培养时，顶端肌动蛋白（红色）和ZO-1（绿色）以及整个上皮室的基底膜（IV型胶原，青色）都会减少（箭头）。比例尺：A、B中为10μm；左C为20μm；C右侧5μm。

ROCK1和PAR-1b下游的基底膜介导的外源性信号维持上皮细胞-细胞粘附

我们的数据表明，ROCK1通过调节PAR-1b在唾液腺发育中的定位来控制基底膜的定位。然而，ROCK也可能是维持上皮细胞间粘附所必需的，基底膜沉积可能通过细胞间相互作用间接控制。事实上，以前的研究表明PAR-1b是细胞间粘附的正调节因子(Bohm等人，1997年;Cohen等人，2011年)我们发现OCC形态受到ROCK或PAR-1b抑制的破坏，这表明在这些条件下细胞间粘附可能受到负面影响。当在玻璃上培养的SIMS细胞单层用Y27632处理18小时时，细胞间的粘附被严重破坏，导致单层内的细胞散射。E-钙粘蛋白(图7A)和ZO-1（补充材料图S8B）在细胞边界处减少，表明对于玻璃上培养的SIMS细胞，ROCK抑制会破坏细胞-细胞粘附，包括粘附和紧密连接。同样，经PAR-1b siRNA处理48小时的玻璃上SIMS单层中的E-钙粘蛋白也减少(图7A). 与上皮单层完整性丧失一致z（z）在存在ROCK或PAR-1b抑制时尺寸减小(图7A). 这些数据支持ROCK和PAR-1b在维持玻璃培养的唾液上皮细胞的细胞间粘附中的需求。

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在缺乏ROCK和PAR-1b的情况下，基底膜介导的外源性信号促进唾液腺上皮细胞维持细胞-细胞粘附。(A类)E-cadherin的免疫细胞化学（红色），如xy公司和x轴尺寸，揭示了对于在Y27632（Y）存在下在玻璃上培养或用PAR-1b siRNA转染的SIMS细胞，E-钙粘蛋白定位丢失，但通过在Matrigel（Mat）上培养来挽救。细胞高度是通过共焦焦平面上单层膜顶部和底部之间的距离来测量的z（z）-堆栈。(B类)与Y27632悬浮培养的SIMS细胞未能在细胞接触处定位E-cadherin（红色）(xy公司和x轴投影）。(C类)用Ha2/5处理Matrigel上的ROCK抑制SIMS细胞会导致E-cadherin（红色）定位丢失。Ha2/5还干扰SIMS细胞在基底表面重塑基质（IV型胶原，绿色）的能力（箭头所示）。误差条表示s.e.m.方差分析*P（P）<0.05,**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001. 比例尺：A、C中20μm；B中为10μm。

为了测试ROCK和PAR-1b信号传导对3D中细胞-细胞粘附维持的贡献，我们在两种3D环境中培养细胞。我们使用悬滴培养物（补充材料图S7A）在没有基底膜的3D中生长细胞。尽管基底膜是由细胞随时间产生的，但在18小时后检测到的很少（补充材料图S7B）。悬滴培养过夜的SIMS细胞在细胞-细胞边界处E-cadherin定位降低，用Y27632、ROCK1 siRNA或PAR-1b siRNA处理后，它们之间的粘附更加松散(图7B，补充材料图S7C），类似于玻璃上培养的细胞。我们将其与培养在Matrigel薄层上的细胞进行了比较。E-cadherin显示，Matrigel上的对照SIMS单层显示出比玻璃上的细胞更有组织性的细胞间粘附(图7A)和ZO-1(图3C)染色。当用Y27632或PAR-1b siRNA处理Matrigel培养的SIMS细胞时，大多数细胞保留E-cadherin，ZO-1位于顶部，细胞不会像在玻璃上或悬挂液中那样分离。此外，SIMS高度的降低(z（z）在含有ROCK和PAR-1b抑制的玻璃上观察到的尺寸），部分被Matrigel培养物所挽救(图7A). 这些数据表明，尽管ROCK和PAR-1b是维持玻璃培养细胞中唾液腺上皮细胞间粘附所必需的，但基底膜对外源性基底膜上的细胞间粘附具有主导作用，因此，ROCK或PAR-1a的丢失在这种情况下对细胞粘附几乎没有影响。同样，在ROCK抑制的唾液腺培养中，我们没有检测到粘附连接蛋白表达或分布的任何变化（数据未显示）。因此，在整个组织3D环境的背景下，ROCK抑制的唾液腺中的基底膜定位错误不太可能是由于细胞间粘连中断导致上皮组织完整性丧失所致。相反，基底膜介导的外源性信号调节ROCK抑制的作用，以维持唾液腺上皮细胞间的粘附。

基底膜介导的细胞粘附维持依赖整合素β1

由于在Matrigel上培养SIMS细胞单层可以调节ROCK和PAR-1b对粘附分子和紧密连接的维持作用，因此我们质疑这种作用是否需要整合素信号。因为整合素β1与基底膜介导的极性信号传导有关(Weir等人，2006年;Yu等人，2005年)我们用Ha2/5功能阻断抗体处理Matrigel上的SIMS细胞。重要的是，在基质胶上培养可以防止ROCK抑制的SIMS单层中细胞散射和细胞边界的连接蛋白损失，而用Ha2/5处理可以防止基底膜诱导的挽救(图7C，补充材料图S8B）。我们的结论是，在缺乏ROCK信号的情况下，基底膜介导的需要整合素β1的外源性信号促进细胞间粘附。有趣的是，我们还观察到Matrigel上SIMS单层基底表面基底膜蛋白的明显重塑（补充材料图S8C）。Ha2/5对整合素β1功能的抑制阻止了对照组和Y27632处理的单层中外源性基底膜的重塑(图3C,图7C). 因此，整合素β1介导的内-外信号也似乎是基底膜重构所必需的，然后可能前馈调节细胞间粘附和细胞极性信号。

讨论

在这里，我们报道了ROCK1活性通过基底膜定位的基础限制来协调全球组织极性的机制。我们证明，在胚胎小鼠唾液腺培养物中抑制ROCK1可以防止基底膜限制到上皮芽的基底边缘，反而会在整个上皮室中触发不适当的基底膜沉积。ROCK介导的PAR-1b活性控制是基底膜定位的分子机制。我们的结果表明，ROCK维持了PAR-1b在正常产生基底膜的外上皮细胞中的定位，并阻止了PAR-2b在不产生基底膜细胞的内细胞中的功能(图8). 我们不仅证明了PAR-1b是基底膜沉积所必需的，并且它通过其激酶活性介导这一功能，而且PAR-1b的过表达足以驱动异位基底膜的产生。我们的数据表明，PAR-1b是发育中唾液腺基底膜沉积的主要调节因子，ROCK对PAR-1b功能的控制对正常上皮完整性和器官发育至关重要。

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通过基底膜定位实现组织极性的ROCK1协调模型。在组织水平上，ROCK1限制基底膜的定位，以保持上皮细胞的极化，使细胞顶端表面朝向组织中心。由于ROCK抑制，基底膜在上皮内部的位置不正确，导致细胞极化不协调，整个组织极性丧失。在细胞水平上，ROCK1分别促进和抑制唾液腺OCC和IPC中的PAR-1b活性，PAR-1b对于基底膜沉积是必要的和充分的。基底膜介导的信号促进唾液上皮细胞中细胞间粘附的维持。

利用器官和3D细胞培养方法，我们证明了基底膜起着极性提示的作用，指导着发育中腺体内细胞的协调排列，而ROCK活性丧失后基底膜的不协调产生导致了组织内细胞的不协调排列，导致组织结构破坏(图8). 由于外源性基底膜可以挽救协调的细胞排列，因此我们认为，当ROCK和PAR-1b功能受到干扰时，外层细胞失去组织是由于基底膜在组织基底边缘的定位丢失。基于这些结果，以及我们的发现，外源性基底膜指导唾液腺上皮细胞系的顶端极性，我们认为基底膜在上皮芽内的不当定位导致了在ROCK抑制条件下IPC的不协调极化。事实上，这些发现与MDCK细胞的研究一致，该研究报告称基底膜组件将顶端定向到细胞的另一侧(Chambard等人，1981年;O'Brien等人，2001年;Yu等人，2005年). 然而，据我们所知，我们的研究是第一次在完整哺乳动物上皮组织的背景下证明这一原理，其中我们证明了分子机制包括ROCK介导的PAR-1b活性调节，以通过基底膜限制来协调根尖极性的方向。我们的研究结果表明，在单个细胞中建立极性本身并不足以形成有组织的多细胞组织，并强调了在单个细胞内建立极性的明显独立性，以及以协调的方式形成顶基轴的方向通过基底膜定位实现高阶组织结构。

我们的研究结果表明，ROCK介导的PAR-1b活性对唾液腺OCC基底外侧区的限制是基底膜定位和随后组织极性协调的关键下游介质。其他研究揭示了PAR-1b调节基底膜沉积的可能机制。PAR-1b调节微管动力学(Drewes等人，1997年)通过磷酸化微管相关蛋白（MAP）和获得极化微管阵列(Cohen等人，2004年;Cox等人，2001年;Doerflinger等人，2003年). 在鸡上皮细胞中，需要极化微管阵列来维持基底膜的稳定性，可能是通过稳定基底膜受体来实现的(Nakaya等人，2011年;Nakaya等人，2008年). 或者，基底膜成分的极化分泌可能需要极化微管阵列(Gilbert等人，1991年;Grindstaff等人，1998年)，这也可以解释在唾液腺器官培养物中PAR-1b siRNA敲除后观察到的基底膜沉积的普遍缺陷。我们的数据表明，PAR-1b也调节基底膜蛋白的表达。由于发育中的唾液腺中的多种基膜蛋白可以在细胞表面结合时刺激其自身表达(Rebustini等人，2009年;Rebustini等人，2007年)，PAR-1b对基底膜蛋白表达的调节可能是间接的。结合我们的观察结果，即当ROCK被抑制时，PAR-1b自身的表达增加，很有意思的推测是，基底膜介导的前馈信号可能起到促进PAR-1b活性和持续维持基底膜蛋白表达和定位的作用。

一个重要的悬而未决的问题是ROCK如何调节PAR-1b在唾液腺发育中的定位？虽然我们不能排除ROCK直接调节PAR-1b定位的可能性，但我们无法通过培养的唾液上皮细胞或器官培养物的联合免疫沉淀检测到ROCK1和PAR-1a之间的直接相互作用（W.P.D.、D.Trufanoff和M.L.，未发表）。另外，ROCK可能通过与其他极性蛋白的相互作用间接调节PAR-1b。在哺乳动物细胞中，PAR-3（PARD3）的ROCK磷酸化阻止其与PAR-6（PARD6）和aPKC的关联(Nakayama等人，2008年)中的、和果蝇属PAR-3（Bazooka–FlyBase）的ROCK磷酸化阻止其皮层结合(Simoes Sde等人，2010年). aPKC可以相互调节ROCK定位(石内和武一，2011年). 因此，鉴于根尖PAR复合体和PAR-1b之间已建立的互斥机制(Goldstein和Macara，2007年;铃木和大野，2006年)，ROCK对PAR-1b活性的调节可能通过顶端PAR复合体介导。极性蛋白质不对称性也依赖于细胞骨架重排(哈里斯和佩弗，2005年;Munro等人，2004年). 虽然肌球蛋白II不需要限制PAR-1b对唾液腺OCC的作用，但ROCK可以通过LIM激酶调节肌动蛋白聚合和微管稳定性(Narumiya等人，2009年)可能影响PAR极性蛋白的定位(Chen和Macara，2006年).

这项研究提出的另一个有趣的问题涉及唾液腺发育过程中顶端极性建立和管腔形成的机制。我们的结果表明，PAR-1b可以调节心尖膜的取向，这与MDCK细胞的结果一致(Cohen等人，2004年;Cohen等人，2011年;科恩和缪施，2003年)它是通过调节基底膜沉积间接做到这一点的。虽然在唾液腺中形成顶膜的机制尚不完全清楚，但它首先发生在发育中的导管中(Patel等人，2011年;Walker等人，2008年)并且可能独立于基底膜，因为顶端蛋白首先出现在不接触基底膜的细胞中，这与数据一致，数据表明极性轴的建立可能是一个细胞自主过程(Baas等人，2004年). 然而，我们的结果表明，基底膜可以促进唾液腺上皮细胞顶端膜的形成。

我们的数据还表明，ROCK和PAR-1b下游的基底膜介导的外源性信号促进上皮细胞-细胞粘附的维持和/或增强。虽然我们的数据表明，这种基底膜介导的效应需要整合素β1，但其他基底膜受体也可能参与。我们也不能排除顶端PAR复合体的作用，但我们的结果与研究一致，研究表明基底外侧极性是顶端极性的先决条件，基底膜介导的信号是细胞间黏附成熟所必需的(Li等人，2003年;Miner和Yurchenco，2004年;Plachot等人，2009年;Weir等人，2006年). 此外，我们的数据有助于解释为什么某些细胞连接分子在直接接触基底膜的上皮细胞中的皮质定位比在不接触基底膜细胞的内部细胞中的更高(Menko等人，2002年;Walker等人，2008年).

ROCK通过肌球蛋白对组织极性的依赖性作用以及我们之前报道的肌球蛋白依赖性对细胞收缩性和基底膜重塑的作用来控制组织结构(Daley等人，2009年)它们都是正确的分枝形态发生所必需的。因此，描述控制ROCK亚细胞定位和激活的分子机制将为控制组织完整性的分子机制提供关键见解。这些信号通路和基底膜对细胞分化的影响也很有趣。此外，由于ROCK活性的抑制与胚胎干细胞存活和分化的调节有关，并且ROCK表达和活性的提高与癌症相关(Ohgushi等人，2010年;奥尔森，2008)确定ROCK的时空调节和/或激活功能如何通过下游效应器维持组织组织，对于改进治疗学和再生医学策略的发展至关重要。

补充材料

补充材料：

致谢

我们感谢Ann Müsch博士提供PAR-1b抗体和腺病毒；Kenneth Yamada博士和Hynda Kleinmann博士分别提供抗纤维连接蛋白和抗层粘连蛋白抗体；和Dustin Trufanoff寻求技术援助。

脚注

基金

由纽约州立大学奥尔巴尼分校和美国国立卫生研究院资助[R01数据元素019244；和RC1DE020402型]存放在PMC中，12个月后发布。

竞争利益声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

补充材料

补充材料可在线获取，网址：http://dev.biologists.org/lookup/supl/doi:10.1242/dev.075366/-/数据中心1

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文章来自发展（英国剑桥）由以下人员提供生物学家公司