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.2011年2月7日；192(3):525-40.
doi:10.1083/jcb.201007002。 Epub 2011年1月31日。

丝氨酸/苏氨酸激酶Par1b通过IRSp53介导的细胞-ECM信号调节上皮管腔极性

科恩 1, 道恩·费尔南德斯, 弗朗西斯科·拉扎罗·迪盖兹, 安妮·穆施
附属公司

丝氨酸/苏氨酸激酶Par1b通过IRSp53介导的细胞-ECM信号调节上皮管腔极性

科恩等。 J细胞生物学. .

摘要

丝氨酸/苏氨酸激酶Par1b促进细胞间粘附并决定上皮细胞管腔结构域的极性。在本研究中，我们证明了Par1b还调节了来自肾脏的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞的细胞外基质（ECM）信号，并确定了rho-鸟苷三磷酸酶适配器和支架蛋白IRSp53是参与此途径的Par1b底物。Par1b过度表达抑制基底层形成、细胞扩散、局部粘附、应力纤维形成和压实，而Par1b缺失则有相反的作用。IRSp53缺失模拟了Par1b在细胞ECM信号和管腔极性上的过度表达，但对粘附连接的形成没有影响。Par1b直接磷酸化S366细胞内裂解物上的IRSp53，并通过间接机制刺激S453/3/5上的磷酸化。Par1b磷酸化缺陷的IRSp53突变体而非野生型蛋白有效地挽救了Par1b MDCK细胞中的细胞扩散和管腔极性缺陷。我们的数据表明，Par1b磷酸化通过促进该结构域附近的14-3-3结合，阻止IRSp53效应蛋白募集到其Src同源结构域3。

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数字

图1。
图1。
Par1b抑制细胞扩散和应力纤维形成，并促进细胞压实。（A） 细胞岛在组织培养塑料上培养24小时的相控图像（左）或延时的亮场图像(视频6)在I型胶原蛋白上进行细胞电镀后（右）。24小时Par1b（−dox）培养物中的半透明孔代表外侧管腔。（B） 在胶原蛋白I上扩散，±dox之间的差异P<0.001。误差条显示SEM。（C、D和F）在胶原蛋白上电镀后30（C和F）或45分钟（D）的延时视频中的静态图像。（C） Brightfield和mRFP荧光(视频1和2)如图所示。箭头指向应力纤维。（D） 注意Par1b细胞和Paxillin-mCherry中的dox-dependent大小差异(视频3). 箭头指向FA。（F） GFP或Par1b-GFP和mRFP肌动蛋白(视频5)如图所示。请注意应力纤维的差异（箭头），Par1b-GFP而非GFP定位于板层中肌动蛋白束的尖端（箭头）。（E） Ca后24小时极化Par1b培养2+开关。磷灰石标记基底区域（底部）和最大（最大）投影中微绒毛丰富的外侧管腔和顶端区域的应力纤维（顶部；视频6）。（G） 通过Par1b-MDCK细胞胶原囊肿的共焦切片（±dox；参见视频4对于满栈）。箭头指向层粘连蛋白的缝隙。还应注意，Par1b囊肿小于WT囊肿（平均值：23个细胞/囊肿vs.30个细胞/囊；n个=13/17）。棒材：（A–F）10µm；（G） 25微米。
图2。
图2。
Par1b促进IRSp53磷酸化和14-3-3结合。（A） 来自Par1b和Par1b-KD细胞（1/10输入）以及吸附在固定化14-3-3τ上并竞争性洗脱的裂解物部分的总裂解物中的IRSp53。箭头显示Par1b裂解物中IRSp53的流动性降低。（B） 用Par1b-WT或Par1b-KA对重组IRSp53进行体外激酶分析，然后进行λ-磷酸酶（+）或模拟（m）处理，然后与固定化14-3-3τ结合。（顶部）显示IRSp53输入的1/10。显示（中间）IB，IRSp53从14-3-3树脂中竞争性洗脱。（底部）显示Autorad，带有[32P] γATP-Par1b–磷酸化IRSp53。（C） 用对照、Par1b-WT或Par1b-KA腺病毒转导的IRSp53-HA或IRSp53ΔSH3-HA细胞。图中显示了1/10 Par1b的IB、HA输入的IB和HA IP后的磷胺。（D） IRSp53-HA免疫沉淀自[32P] 正磷酸盐标记（autorad）和未标记（IB，IRSp53-HA）Par1b-KD细胞。Par1b IB显示两个Par1b剪接变异体的dox-dependent缺失。
图3。
图3。
S366上的Par1磷酸化和依赖于Par1b的S453/4/5磷酸化促进IRSp53的14-3-3结合。（A） IRSp53中Par1b依赖性磷酸化位点图。（B） 使用WT和Par1b-KA进行体外激酶分析[32P] γATP和IRSp53-CT（WT和点突变体）作为底物。（C） 用对照（C）或Par1b病毒转导IRSp53-HA转染细胞（WT、A4和S453-5A），并检测HA IP中的P-丝氨酸，随后检测HA。（D） 使用WT和Par1b-ATP*进行体外激酶分析[35S] 苄基-ATPγS和全长IRSp53 WT和突变体作为底物。IRSp53的放射自显影/考马斯染色。（E） 将共表达Par1b-WT或Par1b-ATP*和WT IRSp53-Myc或IRSp53突变体的细胞的Triton X-100裂解物与[35S] 苄基-ATPγS。IRSp53-Myc和Par1b的放射自显影和IB。（F） 用Par1b-WT或Par1b-KA进行体外激酶分析的重组WT IRSp53和突变蛋白在14-3-3珠上亲和分离并竞争洗脱（顶部）。还显示了IRSp53输入（中间）和Par1b水平（底部）。（G） 来自细胞裂解物的IRSp53蛋白的14-3-3结合。注意，S117A样本的较低表达解释了束缚分数中较弱的信号。该图显示了六个实验（S117A/S148A的三个实验）的SEM。（H） 14-3-3-HA与来自细胞裂解物的IRSp53-Myc蛋白的Co-IP。
图4。
图4。
IRSp53缺失模拟了Par1b过度表达表型的各个方面。（A） 显示了Dox-inducible IRSp53缺失。（B） I型胶原上IRSp53KD细胞岛的Brightfield时间推移(视频10). （C） Ca后24小时极化培养2+开关。磷灰石标记基底区（底部）的应力纤维，以及最大（最大）投影中微绒毛丰富的外侧管腔和顶端区域（顶部；参见视频7). （D和F）胶原蛋白电镀后30分钟拍摄的延时视频中的静态图像。（D） Brightfield和mRFP荧光(视频8). （F） 帕西林-樱桃(视频9，顶部）。箭头指向FA。（E） 两个IRSp53-KD克隆在DME和SMEM中I型胶原上的扩散；±dox之间的所有差异均显著，P<0.001。误差条显示SEM。（G）通过胶原蛋白囊肿的共焦切片（参见视频4如图1 G所示，IRSp53KD囊肿比对照囊肿小（14vs.25个细胞/囊肿；n个= 31). 棒材：（B–D和F）10µm；（G） 25微米。
图5。
图5。
一个非磷酸化IRSp53突变体拯救了Par1b表型。（A） 用模拟或IRSp53shmir cDNA瞬时转染亲代MDCK细胞和表达抗RNAi IRSp53-A4的5个克隆以及IRSp53-WT细胞的4个克隆，并在电镀后2 h分析细胞扩散情况。（B） 在用对照或Par1b腺病毒转导的亲本细胞、八个IRSp53AA和五个IRSp53 WT克隆中传播2小时。（C） WT克隆#1和A4克隆#5中表达Par1b-GFP的Paxillin-mCherry在I型胶原上沉积30分钟后。箭头指向FAs(视频9，底部）。（D） 如材料和方法所述，定量分析转染模拟或IRSp53 cDNA（WT、A4、DD和ΔSH3）的Par1b-MDCK细胞的管腔极性，P<0.0001，与亲代或模拟转染细胞的差异。误差条表示SEM。条：（A和B）30µm；（C和D）10µm。
图6。
图6。
IRSp53降低和Par1b水平升高对侧腔形成具有协同作用。（A） IRSp53在亲代细胞中的表达，以及在±dox中和腺病毒转导后的IRSp53KD克隆。（B） 侧腔极性分析如材料和方法所述。误差条表示SEM。
图7。
图7。
IRSp53和肌球蛋白II协同调节上皮管腔极性。受Ca影响的IRSp53KD（−dox）和对照（+dox）2+在存在或不存在50µM BB的情况下进行24和48小时的切换分析。按照材料和方法中的描述量化流明极性。统计学上有显著差异，P<0.0001（*）。图像表示24小时的时间点。误差线表示SEM。误差线为10µm。
图8。
图8。
Par1b磷酸化抑制WAVE2和其他IRSp53结合蛋白向其C末端SH3结构域的募集。（A和B）在表达WAVE2-GFP、Myc-tagged IRSp53结构（WT、A4或IRSp53Δ317–521；ΔCT）和Par1b的293个细胞中，WAVE2与IRSp53协同作用。对1/10的裂解产物进行WAVE和Par1b表达分析。（B） 数据来自三个使用和不使用重组Par1b的实验，以及三个仅不使用重组Par1b的试验。误差条表示SEM。（C）Cdc42Q61L co-IP与293个细胞的IRSp53-Myc构建物。箭头表示Cdc42，星号表示IgG H和L链。数据代表了三个实验。（D–F）GST-IRSp53CT进行Par1b磷酸化，用谷胱甘肽固定，并用14-3-3τ孵育，如图所示。（D） 给出了实验示意图。（E） 蛋白质的结合[35S] 用考马斯和放射自显影术分析固定化IRSp53CT的Met/Cys标记293裂解物。箭头表示Par1b样本中减少的特定频带。星号表示细胞14-3-3，代表两个相同结果中的一个。（F） IB分析14-3-3与IRSp53CT的结合，Ponceau红染色显示IRSp53-CT水平。
图9。
图9。
上皮管腔形成中IRSp53的Par1b调节模型。激活的Rac1或Cdc42将参与微丝组织的Rho-GTPase效应蛋白如Mena、WAVE、mDia和Eps8招募到IRSp53 SH3结构域。通过Par1b对S366进行磷酸化，并通过未知激酶对S434-5磷酸化进行Par1b刺激，招募14-3-3蛋白质，这些蛋白质干扰WAVE2结合以及与IRSp53 C末端结构域相互作用的其他蛋白质的招募。Par1b过度表达抑制IRSp53依赖的肌动蛋白动力学，调节细胞–ECM信号传导并导致MDCK细胞内腔极性改变。在其他细胞类型中，如Cos7，未识别的激酶通过在T340/T360上创建14-3-3结合位点来抑制IRSp53功能。
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