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开发动态。作者手稿；PMC 2009年11月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
开发动态。2008年11月；237(11): 3128–3141.
数字对象标识：10.1002/dvdy.21717
预防性维修识别码：项目经理2771181
尼姆斯：NIHMS105612美国国家卫生研究院
PMID：18816447

E-Cadherin在颌下腺形态发生中的不同作用：对Acinar和导管结构形成的见解

贾妮斯·沃克，1 A.苏·门科，1 希德·哈利勒，2 伊万·雷布斯蒂尼，三 马修·霍夫曼，三 乔丹·A·克雷德伯格，4和玛丽亚·库库鲁津斯卡2,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

上皮组织分支形态发生过程中腺泡和导管结构的形成尚不清楚。我们报告，在小鼠颌下腺（SMG）中，腺泡和导管细胞的命运在胚胎形态发生早期就已确定，而E-cadherin在发育中起着关键作用。我们在单芽期鉴定了两个形态不同的细胞群体，目的地不同。具有组织化E-cadherin连接的柱状细胞外层通过E13.5表达新生儿腺泡标记物B1，表明其腺泡命运。内部细胞最初缺乏明显的E-cadherin连接，但随着形态发生，形成了细胞角蛋白7（K7）阳性的导管结构，其中有组织的E-cadtherin连接和F-actin丝。用siRNA或功能阻断抗体抑制E-cadherin功能导致导管细胞广泛凋亡和异常扩张的管腔，首次证明E-cadherin在唾液腺分支形态发生过程中调节导管管腔的形成。

关键词：E-cadherin、颌下腺、分支形态发生、腺泡前体、推测导管、细胞分化、连环蛋白、粘附连接

简介

相邻细胞之间的相互作用是指导真核生物组织重塑和分化的形态发生变化的核心(Jamora和Fuchs，2002年;Gumbiner，2005年). 在上皮组织中，这些相互作用在很大程度上由E-钙粘蛋白介导，它是I型经典钙粘蛋白家族的成员。E-钙粘蛋白是一种单跨跨膜蛋白，由5个细胞外钙粘蛋白重复序列（EC结构域）和一个与连环蛋白家族成员相关的短细胞质结构域组成。E-钙粘蛋白形成钙依赖的同型细胞-细胞粘附结构，称为粘附连接（AJ），通过与肌动蛋白细胞骨架的动态相互作用介导细胞间粘附(Hirano等人，1987年). 除了提供细胞间粘附，AJ还调节细胞极性、细胞间通讯、细胞存活、细胞分化和组织发育(格伦沃尔德，1993年;Marrs和Nelson，1996年;惠洛克和约翰逊，2003年;Halbleib和Nelson，2006年). AJ在上皮片形成特殊三维结构的形态发生过程中提供指导性信号(武一，1991;中川和武一，1995年;Jamora和Fuchs，2002年;Gumbiner，2005年;Halbleib和Nelson，2006年). 此外，AJ在建立和维持差异化组织结构中发挥作用(甘比纳，1996年，2005;惠洛克和约翰逊，2003年;Halbleib和Nelson，2006年).

颌下腺（SMG）属于一组上皮组织，它们通过一系列形态发生变化而发育，统称为分支形态发生(Bernfield等人，1984年; Hieda和Nakanishi，1997年；Fernandes等人，1999年;Jaskoll和Melnick，1999年;Patel等人，2006年). SMG长期以来被视为分支形态发生的模型，近年来，它已成为鉴定该发育过程中关键调控因子和分子机制的宝贵工具。特别是，在器官培养中生长早期胚胎SMG的能力，这是一种密切复制体内分支形态发生的离体系统，已被证明有助于揭示这一过程的某些方面(鹿岛等人，2000年;Sakai等人，2003年). 在小鼠中，SMG的发育始于胚胎第11天（E11），作为上皮增厚，在E12.5时产生初始芽结构。最初的芽随后生长，经历了几轮裂开和新芽形成，导致广泛分支进入周围的下颌间质。随着形态发生的进行，分支上皮的区域发生细胞分化，最终形成由分化的末端分泌单位、腺泡和一系列次级导管组成的树状结构，次级导管流入主要排泄管，最终流入口腔(Denny等人，1997年;Jaskoll和Melnick，1999年;Patel等人，2006年).

迄今为止，一些研究表明E-cadherin在唾液腺形态发生中起着关键作用。通过调节果蝇Rac功能破坏E-cadherin细胞-细胞粘附，干扰唾液腺正常发育(Pirraglia等人，2006年). 最近从分离的SMG细胞重建SMG芽的研究提供了证据，证明E-cadherin连接有助于腺体的结构组织及其进行分支形态发生的能力(Wei等人，2007年). 因此，深入了解E-钙粘蛋白介导的粘附如何影响SMG的发育，对于通过分支形态发生对上皮组织发育的一般理解具有重要意义。

我们利用高分辨率共焦显微成像技术对E-cadherin及其结合蛋白的定位和肌动蛋白细胞骨架的关联性进行了详细分析，从最初的芽期到胚胎细胞分化。此外，我们还利用E-cadherin功能阻断抗体和siRNA部分沉默E-cadherin表达，研究了E-cadherins在早期形态发生中的功能意义，E12.5 SMG包含两个形态不同的细胞群体，具有不同的E-cadherin连接组织和发育功能结果。与基底膜接触的外层细胞由紧密堆积的上皮细胞组成，这些上皮细胞围绕着位于内芽区的多形性细胞。根据电子显微镜研究，这种细胞组织仅在SMG形态发生的后期才被报道(Kadoya和Yamashina，1989年，1993;Kadoya等人，1995年). 我们提供的证据表明，在最初的萌芽阶段，外周细胞就有组织良好的E-cadherin连接。通过E13.5，这些细胞表达了新生儿腺泡细胞分化的生化标记，表明腺泡细胞在SMG发育的早期就已确定。我们的发现是，柱状腺泡细胞形态的细胞构筑和细胞间连接特征在初芽期的外围层建立，这表明对腺泡谱系的承诺可能发生在SMG发育的早期阶段或之前。相反，内芽区的细胞具有不太明确的E-cadherin连接，并表达导管特异性标记，表明它们注定要形成导管结构。重要的是，我们的研究表明E-cadherin在管腔形成期间向导管细胞提供生存信号。此外，E-cadherin是发育中SMG分支形态发生和生长所必需的。总之，我们的研究明确了E-cadherin在SMG分支形态发生期间腺泡和导管结构形成中的不同发育作用。

结果

SMG器官培养

SMG是通过从上皮芽分化为一系列导管的分支形态发生发展而成，导管终止于分泌腺泡(Denny等人，1997年;Jaskoll和Melnick，1999年;Patel等人，2006年). SMG在器官培养中进行分支形态发生和细胞分化的能力促进了SMG胚胎发育的研究。在体外条件下，SMG形态发生的时间和空间方面与体内事件相似(Patel等人，2006年). 在本研究中，我们选择使用SMG器官培养，从E12.5的初芽开始培养，直到E18.5的胚胎细胞分化完成(图1).

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SMG器官培养的形态发生。SMG上皮芽(e（电子）)，以及周围的间充质(米)从胚胎第E12.5天到第E18.5天分离的细胞进行培养，并通过相位显微镜进行观察。比例尺=100μm。

Acinar和导管细胞前体的鉴定

经历形态发生的SMG中的不同细胞群

关于上皮组织分支形态发生的机制以及胚胎SMG中腺泡和导管结构的形成，尤其是其机制知之甚少。为了深入了解这些功能单位是如何形成的，我们通过染色丝状肌动蛋白（F-actin）来检测发育中SMG中的细胞，以描绘该组织内细胞的细胞结构。早在SMG芽的初始阶段（E12.5），F-actin的定位就揭示了一个独特的细胞群体，其柱状形态排列在芽的外围(图2A，实心框，B，方框箭头）并与基底膜接触(图2J). 这种具有柱状形态的外围细胞群包围着芽内部的一组圆形细胞(图2B，打开箭头）。先前的研究表明，在单芽期，除了位于SMG柄最近端区域的细胞（补充图1A，可在线获取）外，大多数细胞都高度增殖，成为腺体的主要导管(Melnick和Jaskoll，2000年). 这是首次证明在单芽期存在两个不同的细胞群体。重要的是，在胚胎发育过程中，具有柱状形态的外细胞层保持不变（E13.5，图2D，实心方框，E，方框箭头），尽管随着SMG的发展，这些细胞的形状和包装发生了明显的变化。

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外细胞层在SMG芽发育早期表达腺泡标记B1。用抗B1抗体（绿色）对代表E12.5、E13.5、E15.5和E18.5胚胎发育阶段的SMG进行免疫染色，用罗丹明-球蛋白（红色）进行复染，并用共焦显微镜进行检查。A–C：E12.5 SMG中的细胞对B1抗体没有反应。D–F：E13.5 SMG中B1的免疫定位仅限于外周细胞层（D，块箭头)而茎部区域为负值（D，白色虚线框；F，虚线内的区域).德国：B1在E15.5 SMG中的免疫定位保持在发育芽的外层（方框箭头；插图：63×）。高：在E18.5，腺泡细胞有显著的B1表达（方框箭头；插图：63×），而导管保持阴性（未填充箭头）。我：在形态发生早期检测到B1的表达，并在细胞分化SMG中增加。用Triton提取缓冲液提取腺体，并使用抗B1和抗β-肌动蛋白抗体进行Western blot（WB）分析。条形图表示归一化为β-actin的B1；所示为两个独立实验之一。记者：早期SMG基底膜的Perlecan染色。对E12.5和E13.5 SMG进行了珠光体聚糖（蓝色）和E-cadherin（绿色）或F-actin（绿色）的免疫染色。Perlecan（蓝色）染色基底膜，基底膜与SMG上皮细胞的外层直接接触。所示为中间1μm光学截面。比例尺=10μm。克：显示外层腺泡细胞前体（白细胞）如何在SMG胚胎形态发生完成时发育为腺泡的模型。比例尺=10μm。

接下来，我们试图确定外层细胞的命运。尽管迄今为止还没有描述腺泡细胞祖细胞的标记物，但B1-免疫活性蛋白（B1）的表达与大鼠和小鼠SMG中新生腺泡细胞有关(Mirels等人，1998年;Ball等人，2003年). 为了确定外周层细胞是否在SMG发育的早期就致力于腺泡谱系，我们检测了单芽期的SMG中B1的表达。E12.5时未检测到B1-特异性免疫染色(图2A-C)，高水平的B1被E13.5表达并限制在外柱状细胞层(图2D，白色实心框；E、 块箭头）。在SMG形态发生过程中，外围层B1的这种表达模式一直保持不变（E15.5；图2G)在细胞分化的SMG中，B1仅由腺泡细胞表达（E18.5；图2H). Ki67是一种染色细胞核的增殖标记物，免疫染色显示，这些外周柱状细胞在致力于腺泡谱系后仍保持增殖状态（补充图1B）。SMG蛋白提取物的Western blot分析显示，早在E13.5时，B1-免疫活性蛋白（25kDa）的可检测水平在细胞分化的E18.5 SMG中显著增加(图2I). 总之，我们的结果表明，腺泡细胞前体已经存在于单芽期的外层。此外，这些研究强烈支持一种模型，即早期SMG的外层是细胞分化腺体中腺泡结构的来源(图2K，型号）。

我们的B1免疫定位结果首次证明了腺泡细胞标记物在外细胞层的早期表达，我们现在知道它注定会发展成腺泡。我们还检测了水通道蛋白5（AQ5）在早期发育的SMG中的分布，SMG是一种由插入导管和腺泡表达的水通道蛋白。该功能标记的转录本在E15表达(Wei等人，2007年). 在新生导管的E15.5处观察到AQ5的低水平免疫染色，但在外细胞层没有观察到（补充图2）。在胚胎发育后期（E18.5），AQ5明显定位于腺泡结构和夹层导管的顶膜（补充图2）。这些结果强调了B1蛋白作为注定成为腺泡的细胞的最早标记物的重要性。

与腺泡祖细胞层中与基底膜接触的柱状细胞相反，F-actin染色显示，在单芽期，内部细胞呈圆形(图2B，打开箭头）。到E13.5时，顶芽近端区域的细胞经历了显著的形态发生变化，形成早期导管结构(图2D，F). 这些细胞用荧光结合的指骨样蛋白进行了显著染色，这揭示了皮质肌动蛋白结构的早期组织，我们之前发现这是成熟SMG导管的特征(Menko等人，2002年). 在发育的早期阶段，F-actin染色显示新形成的导管向内芽区显著延伸(图2D，详见补充图3A），与导管特异性标记细胞角蛋白7（K7）的染色重叠(山口等，2006年)甚至在导管管腔出现之前(图3，补充图3B）。这些结果提供了证据，表明顶芽的近端区域是推测导管形成的部位。在E18.5的细胞分化SMG中，F-actin描绘了与导管结构直接相连的腺泡腔（补充图3C）。因此，虽然外周细胞是腺泡细胞前体，但SMG上皮芽的内细胞形成导管结构。这些数据为SMG分支形态发生过程中导管结构的延伸提供了新的范例。

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正在发育的SMG中的导管形成。E13.5腺体用针对导管特异性标记物细胞角蛋白7（K7）的抗体进行免疫染色，并用罗丹明-球蛋白（红色）对F-actin进行复染。F-actin定位的强烈区域与K7染色重叠（填充箭头），确认这些富含actin的区域为导管结构。比例尺=10μm。

不同细胞群中E-钙粘蛋白连接的组织

通过对E-cadherin及其相关连接蛋白α-、β-和γ-连环蛋白的免疫定位分析，研究了SMG形态发生过程中E-cadherin连接的组织。从最初的芽期开始，E12.5、E-cadherin和β-catenin（一种主要的钙粘蛋白结合伙伴）定位于构成外层的柱状细胞的外侧表面(图4B、C块箭头）。在发育的早期阶段，内部细胞中E-cadherin和β-catenin的染色呈弥漫性(图4B、C开放箭头），表明它们的E-cadherin连接结构组织较少。随着腺泡祖细胞层继续扩张（E13.5）并经历细胞分化（E18.5），E-cadherin和β-catenin的紧密聚焦染色得以维持(图4G、H、L、M). 为了确定细胞分化SMG中的腺泡结构，E18.5的腺体被双重标记为F-actin，在发育的这个阶段，它描绘了细胞面对腺泡腔的顶端膜(图4L–O，区域染成红色）。

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SMG形态发生过程中E-cadherin连接的组织。用E-cadherin抗体对SMG芽进行免疫染色(A、 B、F、G、K、L)，β-连环蛋白(C、 高、中)，γ-连环蛋白(D、 I、N)和α-catenin(E、 J、O)并用共焦显微镜检查。E12.5（A）、E13.5（F）和E18.5（K）SMG中E-cadherin的低功率共焦成像。通过E12.5芽中心的高分辨率共焦成像显示，E-cadherin和β-catenin紧密聚焦于芽外围细胞的外表面（B，C，方块箭头），而内部细胞呈弥散染色（B，C，开放箭头）。γ-catenin染色在外周细胞和芽内细胞中均呈弥漫性（D，箭头所示）。α-catenin在外周细胞的顶端区域更为强烈（E，断裂箭头）。比例尺=10μm。通过E13.5芽中心的共焦成像显示，外层细胞呈柱状形态（G–J，方框箭头），E-cadherin和β-catenin紧密聚焦于侧面界面（G和H，方框箭头所示）。内部区域E-cadherin和β-catenin（G和H，开放箭头)而不是在外周细胞中。γ-catenin定位于外周层的侧边界（I，方框箭头）。α-catenin在外周层细胞的外侧表面检测到，并在其顶膜上显著检测到（J，折断箭头）。比例尺=10μm。L–O:E18.5 SMG对E-钙粘蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白和α-连环蛋白进行免疫染色，用罗丹明phaloidin（红色）对F-肌动蛋白进行复染，并通过共聚焦显微镜进行检查。在腺泡（方框箭头）和导管（开放箭头）中，E-钙粘蛋白、β-连环蛋白和γ-连环素定位于细胞-细胞界面（分别为L–N），而α-连环肽在顶端区域（O）与F-actin显着共定位。比例尺=10μm。

与E-cadherin和β-catenin在单芽期的定位相反，γ-catenin在外周层的染色是弥散的，这表明在发育的这个阶段γ-catentin不是E-cadherin连接的主要成分(图4D). 虽然γ-catenin染色在E13.5处主要呈弥漫性，但可以检测到外层的一些细胞-细胞边界定位(图4I). 另一方面，在E18.5的细胞分化腺泡细胞中，γ-连环蛋白染色很好地集中在细胞-细胞边界(图4N). α-catenin是钙粘蛋白结合成分和肌动蛋白交联剂，在SMG发育过程中定位于腺泡层的细胞-细胞界面(图4E、J、O)在这些细胞的顶端区域有特别高的浓度(图4E、J，折断箭头）。α-catenin的顶端分布与F-actin在外周层的定位非常相似（参见图2). 由于E-cadherin连接甚至在检测到分化标记B1之前就存在于外周细胞层，因此其主要功能可能是建立腺泡前体细胞的极性。

管腔化导管的形成与最初柄远端排列导管管腔的细胞顶端外侧边缘E-cadherin连接的组装一致(图5A). 检测到β-catenin的类似定位模式（数据未显示）。如前所述(Heida和Nakanishi，1997年)，我们在新形成的导管内腔区附近的细胞顶端区域观察到ZO-1(图5B)类似于F-actin在这些发育结构中的顶端定位（补充图3A）。ZO-1的顶端定位表明存在紧密连接，其组装之前已形成稳定的E-cadherin连接（Hartsock和Nelson，2007）。因此，ZO-1在新生导管中具有组织良好的E-cadherin连接的细胞中的存在强烈表明E-cadherin在这些导管细胞的成熟中起作用。总之，我们的数据显示，在发育中的腺泡和导管结构中，E-钙粘蛋白连接的不同组织可能在其形态发生中发挥重要作用。

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假定导管细胞在其顶端区域有明显的E-cadherin和ZO-1染色。A、 B类：E13.5腺体的共焦成像显示，初始柄的远端有多层立方细胞，最内层细胞层（A，方框箭头）的顶端和外侧细胞边界处有聚焦的E-cadherin，朝向中央管腔。B： ZO-1在假定导管（B，方框箭头）面向中央管腔的顶端细胞-细胞边界处检测到。比例尺=10μm。

E-cadherin连接的稳定伴随SMG细胞分化

为了检测E-钙粘蛋白结合复合体成分的细胞分化特异性变化，在早期形态发生（E13.5）和晚期细胞分化（E18.5）阶段，从SMG中免疫沉淀E-钙黏蛋白，并通过免疫印迹分析其与粘附连接的主要组分连环蛋白的相关性(图6A). 注意，β-、γ-和α-连环蛋白以互斥的方式与E-cadherin相关(Cowin等人，1986年). 在评估E13.5处的连环蛋白/E-cadherin比率并将其表达为与E18.5处的值相关后，将E13.5处与E-cadherin复合体中连环蛋白的丰度与E18.5.进行比较。虽然在早期形态发生和晚期细胞分化期间，β-连环蛋白与E-钙粘蛋白的结合几乎没有变化，但随着腺体成熟，γ-和α-连环素与E-钙粘蛋白复合物的结合增加(图6A). α-连环蛋白与E-钙粘蛋白复合物的结合被证明参与了这些连接与肌动蛋白细胞骨架的连接。有趣的是，在发育过程中，γ-连环蛋白与经典钙粘蛋白的结合可以通过将这些连接连接到中间丝细胞骨架来调节这些连接的稳定性(Leonard等人，2008年). 这些结果表明，随着成熟腺泡和导管的形成，E-钙粘蛋白复合物的稳定性增加，细胞分化腺体中E-钙黏蛋白连接类型的多样性比早期形态发生时更大。

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SMG的发展伴随着E-钙粘蛋白连接的分子组成和Triton溶解度的变化。答：将E13.5和E18.5 SMG的总组织提取物与E-cadherin抗体免疫沉淀（IP），并通过Western blot分析β-、γ-和α-连环蛋白的相关性。虽然随着SMG的发展，β-连环蛋白与E-钙粘蛋白的结合几乎没有变化，但γ-和α-连环素从E13.5到E18.5的相互作用都增加。条形图反映了E13.5值标准化为E18.5，用于确定E-cadherin复合体中每个连环蛋白的比率，并表示三个实验的平均值。数据归一化为E18.5值，并绘制±SEM图。（*，无显著差异**P（P）< 0.05).B类：E-钙粘蛋白和连环蛋白的Triton溶解度降低与SMG的发展有关。SMG用Triton缓冲液提取，Triton可溶性（S）和不溶性（I）组分用E-钙粘蛋白、β-连环蛋白、γ-连环素和α-连环肽抗体进行Western blot分析。显示了描述免疫印迹定量的条形图（填充条，Triton-soluble；未填充条，Triton-in-soluble）。与早期形态发生相比，E18.5 SMG中E-钙粘蛋白、β-连环蛋白和γ-连环素与Triton不可溶部分的相关性增加。α-catenin几乎没有变化。条形图表示三个独立实验的平均值，但γ-catenin数据除外，该数据基于两个独立的研究。数值绘制为±SEM。

钙粘蛋白连接与Triton不溶性细胞骨架的联系被用作钙粘蛋白复合物稳定性的标志(Cowin和Burke，1996年). 在之前的一项研究中，我们证明在SMG细胞分化的晚期，总E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的高百分比是Triton不溶性的(Menko等人，2002年). 在这里，我们将这些研究扩展到包括SMG开发的早期阶段。对E-钙粘蛋白Triton-solubility的免疫印迹分析表明，从E13.5到细胞分化SMG，与Triton-in-soluble细胞组分相关的E-钙黏蛋白的数量显著增加(图6B). 这与在发育后期α-和γ-连环蛋白与E-钙粘蛋白连接的增加相一致。这一趋势与β-catenin类似(图6B). α-catenin的Triton溶解度在SMG胚胎发育期间没有改变(图6B)，很可能反映了α-连环蛋白在细胞中的多重作用，包括作为肌动蛋白丝的交联剂之一(Kobielak和Fuchs，2004年;本杰明和纳尔逊，2008年). E-cadherin的Triton不溶性增加可能与它与γ-连环蛋白的结合有关，γ-连环素在E18.5也变得高度不溶。这与发育后期γ-catenin在细胞-细胞界面的定位一致(图4N)并增加E-cadherin连接的招募。事实上，细胞分化腺体中E-钙粘蛋白连接的稳定可能是通过γ-连环蛋白的募集来实现的，并且可能涉及这种连环蛋白将钙粘蛋白结合到中间丝细胞骨架的能力(Leonard等人，2008年).

E-cadherin在SMG分支形态发生中的作用

用siRNA部分沉默E-cadherin可抑制分支形态发生并导致管腔异常扩张

为了确定E-cadherin在SMG形态发生过程中的功能，我们使用siRNA策略部分抑制E-cadherin的表达。与非沉默对照siRNA相比，用E-cadherin siRNA转染E12.5 SMG导致E-cadherin转录水平降低30%(图7A). 这对应于E-钙粘蛋白丰度减少20%（数据未显示）。非silencing对照siRNA对E-cadherin表达或SMG形态发生均无影响。E-cadherin siRNA通过影响芽形成、腺体大小和导管发育抑制分支形态发生(图7B). E-cadherin的部分敲除使外周SMG细胞层不受影响（数据未显示），而发育中的导管显示出明显的F-actin染色所描绘的扩张区域(图7Cd). 这些管腔结构中的一些被发现含有致密核囊(图7Ce). 因此，E-cadherin表达减少30%就足以导致SMG形态发生的可检测缺陷。这些结果表明，E-cadherin是SMG发育过程中适当管腔形成和分支形态发生所必需的。

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siRNA对E-钙粘蛋白表达的部分抑制干扰SMG分支形态发生和正常导管发育。用E-cadherin siRNA或非沉默对照转染E12.5 SMG，并在培养基中培养22–48小时。答：通过实时PCR分析从用E-cadherin siRNA或非沉默对照处理的SMG中分离的总RNA，并将其归一化为29S。值表示为与控制相比的相对折叠变化。与对照组相比，经E-cadherin siRNA治疗后，E-cadherinmRNA水平降低了30%。P（P）值未成对t吨-与29S对照组相比的试验**P（P）< 0.05.B类：转染非沉默（NS）和E-cadherin siRNAs（S）的SMG的相位显微镜(a、 b条). 与非沉默对照组相比，E-cadherin siRNA处理的腺体中的芽数减少了55%(c（c）)（方差分析**P（P）< 0.05).抄送：非沉默对照转染E12 SMG的F-actin和细胞核的共焦成像(a–c)或E-cadherin siRNA(d–f日)22小时后，E-cadherin siRNA处理的腺体中的导管扩张（d）。导管内腔的宽度用a和d）中的括号表示。比例尺=10μm。

功能阻断抗体对E-钙粘蛋白的抑制作用揭示了其在导管细胞存活中的作用

由于siRNA在转录水平上影响E-cadherin的表达，因此检测其对E-cadherin蛋白丰度的影响取决于从头合成的E-cadherine到达细胞表面的时间及其周转时间。因此，我们试图用E-cadherin功能阻断抗体以更直接的方式干扰E-cadherin功能。参与细胞-细胞粘附的E-cadherin的结构单元由五个串联排列的外结构域1至5（EC1–EC5）组成(图8A)，在钙的存在下23以抗蛋白酶的细长杆状结构存在，并形成平行结构顺式二聚体。我们首先使用靶向EC5外结构域的功能阻断抗体测试是否抑制E-cadherin功能(小泽等人，1991年)影响分枝形态发生。将功能阻断抗体以实验选定的浓度添加到E13.5 SMG体外培养物中（参见实验程序部分）。将E13.5 SMG与包含非免疫大鼠IgG和E-cadherin胞质域抗体的对照抗体孵育，不会影响分支形态发生或腺体结构形态(图8B、a、b). 将SMG与EC5功能阻断抗体孵育后，芽形成减少65%(图8B，d). 此外，EC5抗体对腺体的大小有明显的抑制作用(图8B，c). 这些数据证实了E-钙粘蛋白在SMG分支形态发生中发挥作用的siRNA结果。

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E-cadherin连接是分枝形态发生所必需的。答：E-cadherin与五个胞外结构域（EC1-EC5）、一个跨膜区域（T）和一个胞内细胞质结构域（Cyto）的示意图。B类：对照组（a、b）和EC5功能阻断抗体处理组（c）SMG器官培养物的代表性相显微镜检查。在用功能阻断抗体或大鼠IgG治疗后计数芽，并将其标准化为时间零点。EC5功能阻断抗体处理的SMG中芽数显著减少（65%）(c、 d日)与对照大鼠IgG相比(a、 d日)检测到（方差分析**P（P）< 0.05). 条形图表示三个独立实验之一，n=36。抄送：用大鼠IgG或EC5功能阻断抗体孵育器官培养物，用FITC-衍生的次级大鼠抗体染色，并用共焦显微镜分析。尺寸棒=10μm。医生：EC5和大鼠IgG处理的腺体用Triton缓冲液提取，Triton可溶性（S）和不溶性（I）组分用Western blot分析E-cadherin。条形图描述了四个独立的实验（填充条，大鼠IgG处理；未填充条，EC5处理），其值绘制为±SEM。电子：在Triton提取缓冲液中提取SMG，并进行免疫印迹以检测E-cadherin和β-actin的表达。条形图描述了E-cadherin与β-actin表达的比率，数据标准化为大鼠IgG，并绘制了±SEM。

为了确保功能阻断抗体靶向整个腺体的E-cadherin连接，将在EC5抗体存在下生长的E13.5 SMG固定，然后用FITC-结合二级抗体标记。如所示图8CEC5抗体均匀分布于芽周和芽内细胞的外侧边缘。此外，抗体处理腺体中β-连环蛋白的免疫染色显示，它仍然存在于E-钙粘蛋白抗体靶向的外侧细胞边界（数据未显示）。因此，功能阻断抗体能够接触SMG内的所有细胞，但似乎没有破坏所有现有的粘附连接，这与MDCK细胞的研究结果一致(卡帕尔多和马卡拉，2007年). 为了确定EC5处理是否改变了钙粘蛋白复合物的稳定性，我们检测了E-钙粘蛋白的Triton溶解度。我们检测到对照组和EC5处理的SMG之间的E-钙粘蛋白Triton溶解度没有变化(图8D)与β-catenin在细胞-细胞界面持续存在一致。尽管E-cadherin复合物的稳定性不受影响，但EC5治疗后E-cadherin表达水平降低了42%(图8E). 后者很可能反映了导管结构的缺失（见下文）。

为了进一步评估EC5介导的E-cadherin功能抑制的形态学后果，我们对IgG和EC5处理的SMG的苏木精和伊红染色（H&E）系列切片进行了组织学分析。虽然IgG对照组表现出由终芽和导管组成的特征性结构特征，但在EC5抗体存在下培养的SMG显示出异常扩张的管腔，延伸到终芽(图9A，未填充的箭头）。在所检查的样本中，扩张导管的发生率>90%，在新发育导管延伸到顶芽区域的部位最为突出。这些结果证实了我们对E-cadherin siRNA的观察结果，并进一步证明了E-cadherin在SMG形态发生过程中对导管的正常管腔化是必需的。

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EC5功能阻断抗体抑制E-cadherin导致导管异常扩张。答：E13.5 SMG在存在IgG或EC5功能阻断抗体的情况下培养48小时，并进行常规H&E染色。横截面（顶部）和纵截面（底部）显示，扩张的导管结构导致EC5处理的SMG中出现顶芽（方框箭头）。比例尺=10μm。B类：在EC5治疗的SMG中，F-actin和细胞核的共焦成像显示异常大的管腔(d–f日)充满了在对照组（a–c）中未检测到的致密细胞核（e，虚线轮廓）。比例尺=10μm。抄送：E13.5 SMG在存在IgG或EC5功能阻断抗体的情况下培养42小时，并对裂解caspase 3进行免疫染色。裂解半胱天冬酶3的免疫荧光定位显示EC5处理腺体扩张管腔区域的显著染色（方框箭头）。比例尺=20μm。

如所示图5当导管前体分化为导管细胞时，它们在顶端外侧边缘获得显著的E-cadherin连接。由于E-钙粘蛋白已被证明能促进信号细胞存活，我们研究了EC5治疗的SMG内腔异常扩张是否是由于分化导管细胞的不当死亡所致。首先，我们检测了用针对EC5的E-钙粘蛋白功能阻断抗体处理的SMG中的F-肌动蛋白分布和核染色。与经IgG处理的对照组相比，在构成外层的细胞或相邻的增殖导管前体中未检测到明显的形态学变化(图9B). EC5处理未破坏外层的发现表明，在胚胎SMG的这一区域可能有另一种钙粘蛋白表达。为了检测外层是否存在另一个钙粘蛋白连接与E-钙粘蛋白共存的可能性，我们用N-钙粘蛋白抗体对E12.5 SMG进行免疫染色，并用共焦显微镜进行检查。N-cadherin在早期SMG中表达，并且似乎主要定位于外层（补充图4）。

与外层细胞层相反，早期胚胎SMG暴露于EC5功能阻断抗体会导致分化导管细胞的紊乱，并导致管腔结构内细胞内显著的F-actin染色所描绘的大的中空区域的形成(图9B，d). 这些区域充满了致密核，这可能是由于E-cadherin功能受到抑制而导致凋亡细胞死亡的结果(图9B，e虚线轮廓）。相反，在非免疫性IgG处理的腺体中，在发育中的导管新形成的管腔内仅检测到少数脓核(图9B、b、c)与之前的研究一致，这些研究表明SMG发育过程中管腔的形成与细胞凋亡有关(Melnick和Jaskoll，2000年;塔克，2007年). 我们注意到，用EC5抗体处理后，检测到脓核的芽数和区域发生了变化，这表明该效应对发育阶段敏感。

为了证实E-cadherin对分化的导管细胞的生存至关重要，我们用裂解caspase 3（细胞凋亡的标志物）抗体对对照组和EC5处理的SMG进行免疫染色。培养42小时的EC5处理的SMG显示管腔异常扩张，胱天蛋白酶3明显染色，表明它们是由成熟导管细胞中凋亡细胞死亡途径的不当激活形成的(图9C). 到48小时，当管腔已经发生显著扩张时，在新形成的导管延伸到顶芽的区域仍然检测到caspase 3染色，表明导管的异常管腔化是由E-cadherin功能抑制导致的细胞凋亡驱动的（数据未显示）。EC5处理的SMG组织切片扩张管腔中的TUNEL染色阳性进一步证实了细胞死亡（数据未显示）。我们的结论是，E-钙粘蛋白功能是稳定E-钙黏蛋白连接所必需的，而E-钙粘蛋白连接又是导管管腔化期间这些细胞存活的关键。

讨论

SMG属于上皮组织，包括肺、肾和乳腺，它们通过分支形态发生从单个上皮芽发育而来。后者是一个复杂的发展过程，涉及不同细胞类型之间的相互信号传递、基因表达模式的改变、细胞的动态重组和运动、基底膜的重塑、许多信号通路的时空参与，所有这些都汇聚在一起调节生长、分支、，和管道形成(霍根，2006年;Kerman等人，2006年;Patel等人，2006年). 虽然E-钙粘蛋白粘附受体在上皮分支形态发生中具有公认的功能，但除了介导细胞间粘附外，E-钙黏蛋白如何影响腺泡和导管的发育尚不清楚。在本报告中，我们提供的证据表明，在SMG胚胎发育过程中，腺泡和导管细胞的命运已经在单个芽期确定，E-cadherin连接在其组织形成成熟结构中发挥关键和独特的作用。

与之前的报告类似，该报告表明，最初的芽由无组织细胞组成，E-cadherin和β-catenin均匀而弥散地分布在其表面(Hieda等人，1996年;Heida和Nakanishi，1997年)，我们在早期SMG芽的内部发现了无组织细胞。然而，我们的研究也表明，最初的SMG芽在与基底膜接触的外层含有另一个细胞群。该细胞群具有柱状形态，具有明显的E-钙粘蛋白连接。上皮细胞极性起始中E-cadherin粘附的关键作用的分子机制最近被描述(Nejsum和Nelson，2007年). 因此，外柱状细胞中有组织的E-cadherin连接可能与其柱状形态有关。我们的研究还表明，随着初芽的分裂和生长，这些有组织的外周细胞保持在并局限于新形成的终芽的外层细胞层。用siRNA或功能阻断抗体抑制E-钙粘蛋白表明，E-钙粘蛋白连接是分支形态发生所必需的。一种可能的解释是，外周细胞层的E-cadherin连接是分枝和新芽形成所必需的。然而，在这些研究中，外层细胞的形态未受影响。可能在缺乏E-钙粘蛋白功能的情况下，外细胞的形态由N-钙粘蛋白连接维持，这些连接在这些细胞中高度表达。也有可能，E-cadherin抑制SMG生长和出芽的观察效果受到缺陷导管形成的影响。

之前曾报道过两种形态不同的细胞群，但直到SMG形态发生的后期，即E13.5或假腺期，才使用EM方法(Kadoya和Yamashina，1989年，1993，2005;Kadoya等人，1995年). 通过对细胞迁移行为的研究，进一步证明了假腺期终末芽内存在两个不同的细胞群体，其中与基底膜接触的细胞与内部细胞的移动和旅行方式不同(Larsen等人，2006年). 此外，芽内部的细胞可以整合到外层，进一步强调了SMG发育过程中顶芽的动态特性(Larsen等人，2006年).

我们的研究首次提供证据表明，具有组织化E-cadherin/β-catenin连接的外周柱状细胞注定会导致腺泡细胞的命运。免疫荧光分析显示，早在E13.5，只有外层细胞表达新生儿腺泡细胞标记物B1。Western blot研究表明，继初芽期之后，E13.5检测到B1，表明SMG初芽的外周细胞是腺泡前体细胞。重要的是，通过在细胞分化的E18.5 SMG中形成腺泡，在SMG的分支和生长过程中保持了B1-阳性的外细胞层。我们在腺泡结构形成之前很久就将外层细胞鉴定为表达新生儿腺泡标志物B1的细胞是新的，这表明我们已经鉴定了腺泡前体。

虽然在SMG胚胎发育过程中，腺泡谱系中的细胞仅限于外层细胞层，并最终形成腺泡，但芽内部的细胞形成导管系统。早在E13.5，这些导管的初始组织就被确定为一组沿着近轴排列的细胞，具有显著的F-actin丝，并表达细胞角蛋白导管标记物K7。此外，导管前体的这种初始组织在这些细胞中获得明确的E-cadherin连接之前。首次在排列导管的细胞顶部外侧边界检测到定义明确的E-cadherin连接，并与管腔形成一致。后者还与在E-cadherin连接的顶端位置检测到ZO-1相关，表明这些细胞具有紧密连接。因此，内部芽细胞中组织较少的E-cadherin可能是在最初导管形成期间允许细胞重排的关键。一旦导管腔形成，可能需要E-cadherin连接来稳定导管结构。

细胞凋亡与SMG和其他腺组织的正常管腔形成有关(Melnick和Jaskoll，2000年;Mailleux等人，2007年). 我们对E-cadherin siRNA和EC5功能阻断抗体的功能研究表明，上皮细胞中的E-cadherin连接在管腔化过程中起到保护作用，这些上皮细胞将排列新形成的导管的管腔。这两种方法都阻断了导管细胞中E-cadherin连接的形成，导致管腔异常扩张。在这些管腔中检测到大量的致密核和裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，提供了证据表明管腔扩张是由于导管细胞凋亡不当所致。因此，E-cadherin连接为成熟的导管细胞提供生存信号。在果蝇唾液腺中，E-cadherin对细胞存活的类似作用也显示出来，其中β-catenin和E-cadherin的不当丢失是由组成活性Rac1V的表达引起的12诱导细胞死亡(Pirraglia等人，2006年). 此外，在缺乏E-cadherin的稳定伙伴p120连环蛋白的情况下，小鼠SMG显示出异常扩张的管腔(Davis和Reynolds，2006年). 在其他组织中，如乳腺和皮肤，E-cadherin也被证明可以促进细胞存活(Boussadia等人，2002年;Tinkle等人，2003年).

总之，我们的研究表明，从单芽期开始，SMG中存在两个不同的细胞群体。我们首次证明，外层的细胞群中含有腺泡细胞的前体，它们继续形成细胞分化腺的腺泡结构。第二个群体，即内芽区的细胞，重组形成导管。这两个种群都有E-cadherin连接，尽管它们在发育过程中的组织不同。干扰E-钙粘蛋白功能对SMG的发育有重要影响，阻碍其生长、芽形成，并因失去对管腔上皮的保护而导致导管扩张。未来的研究将侧重于SMG发育过程中E-cadherin连接的其他功能，特别是它们在导管形成和腺体形态发生过程中的机械传递事件中的作用(Lecuit和Lenne，2007年). 这些钙粘蛋白功能在细胞边界的形成和细胞重排中可能很重要，而细胞重排对腺泡和导管结构的形成至关重要。

实验程序

SMG器官培养

动物实验由波士顿大学医学中心动物护理和使用委员会（IACUC）批准。颌下腺/舌下腺原基(霍夫曼等人，2002年)从E12.5–E18.5 CD-1或ICR小鼠身上解剖，并在37°C的空气/介质界面上，在5%的加湿CO中，在Whatman Nucleopore Tracketch过滤器上培养2大气。将过滤器漂浮在200μl DMEM/F12中，并添加100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、150μg/ml维生素C和50μg/ml转铁蛋白，置于50 mm的玻璃底微孔皿中（MatTek，Ashland，MA）。

RNA干扰

靶向E-cadherin的小干扰RNA（siRNA）作为SMART-pool获得™来自Dharmacon的序列。非筛选阴性对照siRNA购自Qiagen。使用非靶向Cy3-siRNA（Dharmacon）测定转染效率为98%。为了确定siRNA介导的E-cadherin表达部分抑制的最佳条件，最初在12、24、36、48和72小时的不同时间段内测试了50到400 nM范围内的siRNA浓度。在22到48小时之间用200 nM siRNA检测到对SMG分支形态发生的最显著影响。低于200 nM的浓度对分枝形态发生没有明显的抑制作用，而400 nM的结果与200 nM相似。在72小时的siRNA处理后，分支形态发生的抑制减轻，表明siRNA的作用是可逆的。因此，我们选择在22–48小时内使用200 nM siRNA来部分抑制E-cadherin表达，12个E12.5 SMG（6个腺体/过滤器）转染200 nM E-cadherin-siRNA或使用RNAiFect（Qiagen）转染非沉默对照siRNA。每个胚胎都是一个用于siRNA的SMG和一个用于非沉默对照的SMG的来源。转基因SMG培养22–48小时，并进行RT-PCR分析，以测量基因敲除。纯化总RNA并用于cDNA合成，通过实时PCR评估E-cadherin基因的表达。通过使用看家基因29S对E-cadherin的Ct（阈值循环数）进行标准化，并通过比较非沉默（NS）和沉默（S）E-cadherin-siRNAs处理的SMG的基因表达，生成基因表达谱。使用三种独立RNA制剂的实时PCR进行统计分析。

功能阻断抗体

靶向EC5外结构域的E-cadherin功能阻断抗体的使用浓度为100μg/ml。该浓度是根据剂量和时间依赖性研究确定的。所选剂量在较高浓度或更长的孵育时间下没有进一步的表型结果。在抑制研究中，在添加功能阻断抗体之前，将E13.5 SMG培养2小时，然后在功能阻断抗体存在的情况下培养48小时。通常，一次实验使用两胎的12个SMG（每个过滤器6个SMG），每个胚胎作为一个SMG的来源，用于功能阻断抗体和一个用于对照IgG孵育。在配备尼康E5400相机的尼康Eclipse TS100（4×/0.13）显微镜上处理后2、24和48小时收集亮场图像。MetaMorph（宾夕法尼亚州唐宁顿Universal Imaging Corporation，V6.2）对芽进行计数，并将数据制成表格。使用PRISM软件（加利福尼亚州圣地亚哥Graph software Inc.；V4.0）将统计分析制成表格。

组织提取和蛋白质测定

如图所示，分离的SMG要么立即冷冻在干冰上，要么生长在过滤器上。为了制备总组织裂解物，在OGT缓冲液中提取SMG（在含有100mM NaCl、1mM MgCl的缓冲液中的1%Triton X-100、45mM正辛基β-D吡喃葡糖苷2、5 mM EDTA、10 mM咪唑、3 mM焦磷酸钠、50 mM氟化钠、1 mM钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma））。

为了测定Triton溶解度/不溶性，以衡量SMG蛋白的细胞骨架结合程度，使用Triton提取缓冲液（1%Triton X-100，在含有100 mM NaCl、1 mM MgCl的缓冲液中）提取组织24°C下，5 mM EDTA、10 mM咪唑、3 mM焦磷酸钠、50 mM氟化钠、1 mM钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）。通过12000℃离心分离Triton可溶性和不溶性组分克用OGT缓冲液重新萃取得到的Triton不溶性颗粒10分钟。蛋白质浓度由BCA测定。

抗体和染色

从BD转导获得E-钙粘蛋白、β-连环蛋白、γ-连环素、α-连环肽、N-钙粘蛋白和Ki67的抗体。从Sigma Aldrich获得β-actin特异性抗体和E-cadherin胞外域EC5特异性功能阻断抗体（克隆DECMA-1）。细胞角蛋白7（K7）抗体从AbCam购买，Zymed购买ZO-1抗体。裂解半胱天冬酶-3的抗体来自细胞信号转导，水通道蛋白5（AQP5）的抗体来自Alpha Diagnostic International。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（perlecan）抗体（克隆A7L6）来自Chemicon。抗B1抗体是加州大学伯克利分校Lily Mirels赠送的礼物。从Molecular Probes购买罗丹明结合的指骨样肽和单体花青素核酸染色剂。与辣根过氧化物酶结合的二级抗体来自Bio Rad，AffiniPure山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG Fab片段来自Jackson ImmunoResearch Laboratories或Molecular Probes。纯化的大鼠IgG购自BD Biosciences。

组织学

为了进行组织学分析，四个E13.5 SMG在存在IgG或EC5功能阻断抗体的情况下培养48小时，固定在PBS中4%的多聚甲醛中并脱水。样本在哈佛大学核心设施（贝思以色列女执事医疗中心）用石蜡包埋、切割（8-μm切片）并用苏木精和伊红染色。使用TE 300显微镜（尼康）获取光学显微镜的数字图像。

免疫沉淀

在每项独立研究中，均使用80–350μg的蛋白质提取物。蛋白质提取物由两胎至九胎共16至70只E13.5 SMG和一胎共四只E18.5 SMG制备而成。如前所述，用E-cadherin单克隆抗体连续孵育1小时，然后用4°C（1小时孵育）的小鼠True Blot IP珠免疫沉淀E-cadherin（加州圣地亚哥eBioscience）(Walker和Menko，1999年;Walker等人，2002年).

免疫印迹

对于每个Western blot分析，包括Triton溶解度测定，将一窝8到10只E13.5 SMG和一窝2只E18.5 SMG混合，用于蛋白质提取，如上所述。蛋白质在从Novex获得的4–12%三甘醇凝胶上分离，电泳转移到Immobilon-P膜（Millipore Corp.，Bedford，MA），并如前所述进行免疫印迹。对于免疫印迹分析，常规将整个组织裂解物加载到总蛋白的10-15μg。对于Triton-soluble组分的免疫印迹分析，以相同的蛋白质浓度（10-15μg）装载样品。它们各自的不溶性部分以与可溶部分相等的体积装载，以便进行直接比较。所有凝胶均在还原条件下运行。检测时，使用了来自Amersham Life Sciences的ECL或ECL plus试剂。使用Kodak 1D软件扫描免疫印迹并进行密度测定分析。为了确保在线性范围内进行量化，对印迹进行多次曝光。

免疫荧光

对于全贴装免疫荧光，分离的E12.5和E13.5 SMG在过滤器上培养过夜，而E15.5和E18.5 SMG在过滤上培养2小时，然后用特定抗体进行免疫染色。通常，每项免疫荧光定位研究包括两个滤镜，每个滤镜有一窝六个SMG。SMG用3.7%多聚甲醛固定2小时，用PBS洗涤，并在室温下用0.1%Triton X-100渗透15分钟。对于α-连环蛋白免疫染色，用冰冷的丙酮/甲醇（1:1）在冰上固定组织15分钟，并用PBS洗涤。在4°C下用10%的驴血清和1%的BSA在PBS Tween 20（0.1%）中封闭腺体过夜，并在RT下与一级抗体孵育4-6小时，然后用二级抗体，驴或山羊F（ab）用荧光素（分子探针，尤金，OR）标记2个片段1小时。添加与交替荧光色素结合的磷灰石30分钟，用单体菁核酸染色观察细胞核。使用蔡司共焦激光扫描显微镜LSM510 META对免疫染色样品进行分析，以可视化单个光学切片，并使用LSM510-专家模式采集软件生成穿过整个腺体的光学平面Z堆叠。为了追踪内部假定的导管细胞，分析了厚度为0.1μm的光学切片的Z堆栈的详细共焦分析。为了确保特定研究中样本之间荧光强度的有效比较，将设置固定到染色最深的样本，并在这些设置下获取所有其他图像。

致谢

资助赞助商：NIH；批准号：DE014437、DE010183、EY014798。

我们感谢惠灵顿·卡多佐的有益讨论，感谢米海·尼塔·拉扎尔、唐娜·阿夫沙尔和米歇尔·伦纳德对手稿的批判性阅读。作者还感谢倪翟在共焦成像方面的技术帮助。这项工作得到了NIH/NIDCR向M.A.K.和EY014798向A.S.M.提供的拨款DE14437和DE10183的支持。

脚注

其他支持信息可以在本文的在线版本中找到。

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