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.2004年3月1日；164(5):717-27.
doi:10.1083/jcb.200308104。 Epub 2004年2月23日。

哺乳动物PAR-1通过组织微管细胞骨架来决定上皮管腔的极性

科恩 1, 帕特里克·J·布伦沃尔德, 恩里克·罗德里格斯-博兰, 安妮·穆施
附属公司

哺乳动物PAR-1通过组织微管细胞骨架来决定上皮管腔的极性

科恩等。 J细胞生物学. .

摘要

上皮分化涉及管腔表面和沿极性轴排列的非中心微管（MT）网络的生成。柱状上皮细胞（例如肾、肠和Madin-Darby犬肾[MDCK]细胞）产生顶端管腔并垂直定向MT，而肝上皮细胞（肝细胞和WIFB9细胞）在细胞间接触部位（胆道）产生管腔并水平定向MT。我们报道，在培养的MDCK和WIFB9细胞极化过程中，秀丽隐杆线虫Par-1（EMK1和MARK2）哺乳动物同源基因的敲除或抑制阻止了其特征性内腔和非放射状MT网络的发育。相反，EMK1过度表达导致MDCK细胞中出现细胞间管腔和水平MT阵列，使EMK1成为第一个已知的调控肝和柱状上皮细胞之间发育分支决定的候选细胞。我们的实验表明，EMK1主要促进MT网络的重组，这与该基因产物在其他系统中的MT调节作用一致，而其他系统又控制管腔的形成和位置。

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数字

图1。
图1。
MDCK细胞中的内源性EMK1。（A） EMK定位于紧密连接处：紧密连接区（ap）和中平面（mid）的x-y共焦切片，以及标记为EMK（绿色）和ZO1（红色）的MDCK细胞的共焦垂直视图（x-z），在没有（左侧）或存在（右侧）用作抗原的COOH-末端EMK肽的情况下，用于提高和纯化抗体。注意，可溶性抗原在紧密连接处与EMK竞争，并减少细胞内标记。棒材，10μm。（B） EMK1 mRNA水平在非接触（第2道）、接触（第3道）和三维融合（第4道）MDCK培养物的极性RT-PCR发展过程中受到调节；（通道1）无模板控制PCR。顶部，用EMK1引物扩增；右车道，EMK1 cDNA；底部，用引物扩增G3PDH，一个看家基因。
图2。
图2。
EMK1敲低抑制MDCK细胞中管腔的形成。（A） EMK1敲除：左，用对照或EMK1-KO细胞总RNA的EMK1特异性引物进行RT-PCR；EMK1-cDNA作为阳性对照（质粒）；对照组和EMK1-KO裂解物的EMK-免疫印迹；星号，EMK1波段；右图，用pSUPER（对照）或pSUPER-siEMK1质粒（EMK1-KO）转染细胞24小时后，在相同曝光下拍摄的宽视野图像；对细胞进行EMK免疫标记。（B） 胶原覆盖层：对照组（转染pSUPER）或EMK1-KO细胞在I型胶原上培养24小时，然后在顶端表面覆盖额外的胶原，24小时后进行分析。绿色，gp135；红色，指骨蛋白；蓝色，细胞核。注意EMK1-KO培养物中缺乏管腔。棒材，10μm。（C） 钙开关：用pSUPER或pSUPER-KO转染对照或EMK1-KO细胞24小时后，将其置于低钙培养基中。12小时后，将培养物切换到正常培养基中24小时。顶部、x-y和x-z共聚焦投影标记为gp135（绿色）、β-catenin（红色）和ZO-1（蓝色）或E-cadherin（绿色）。棒材，10μm。底部，垂直于基底切片的细胞的透射EM；箭头指向微绒毛。棒材，1μm。
图3。
图3。
KN-EMK1在MDCK细胞中模拟EMK1-KO。（A） KN-EMK1-myc表达：在全极化细胞中通过腺病毒介导的基因转移表达myc标记的KN-EMK1后，标记myc（绿色）和ZO1（蓝色）的MDCK细胞的紧密连接区（ap）和中平面（mid）的x-y共聚焦切片和共聚焦垂直视图（x-z）。（B） 胶原覆盖层：细胞在胶原上镀膜后12 h用对照（GFP）或KN-EMK1病毒转导，并在胶原覆盖前再培养12 h，24 h用gp135（绿色）和卵磷脂（红色）对小管进行x-z观察；细胞核（蓝色）。请注意，KN-EMK1表达导致心尖区缺失。（C） 钙开关：在钙开关前12 h，用KN-EMK1病毒或GFP病毒（对照）转导接触免疫MDCK细胞24 h。红色，gp135；蓝色，ZO-1；绿色E-cadherin条，10μm。注意，在用于感染的病毒滴度下，细胞内GFP荧光可以忽略不计。
图4。
图4。
EMK1促进MDCK细胞的外侧管腔。野生型EMK1在四环素启动子作用下的极化（A）或极化（B和C）MDCK细胞中表达；控制，EMK1+tet；EMK1-过表达细胞，EMK1−tet。（A） 重组EMK1-myc表达：通过从完全极化的细胞中撤出多西环素表达myc标记的野生型EMK1后，在紧密连接区（ap）和中平面（mid）的x-y共聚焦切片和标记有myc（绿色）和ZO1（蓝色）的MDCK细胞的共聚焦垂直视图（x-z）。棒材，10μm。（B） I型胶原覆盖层：在I型胶原基质上生长亚融合单层，并覆盖I型胶原12小时（顶部）或36小时（底部）；共焦x-z切片描绘两个细胞层之间的管腔；红色，gp135；绿色，FITC-卵磷脂。棒材，10μm。（C） 钙开关：钙开关后0或24小时过滤生长细胞。（顶部）绿色，gp135；红色，ZO-1，蓝色，细胞核。x-y和x-z截面；箭头表示VAC（0 h）和侧腔（24 h）；箭头表示单元格顶点和单元格底部的位置。钙开关24小时后，（中间）E-cadherin（绿色）和ZO-1（红色）。棒材，10μm。（底部）Ca开关后24小时平行于基底切割的EMK1细胞的透射EM；三个细胞（“nu”表示细胞核）围绕管腔排列（星号）；请注意左图中管腔中的微绒毛被放大。棒材：（右）2μm；（插图）1μm。
图5。
图5。
EMK1调节WIFB9细胞中BC的形成。（A） EMK1定位：（左）相细胞（右）的x-y宽场图像，并为EMK（左）和ZO-1（中）标记；通过腺病毒介导的基因转移表达myc-tagged KN-EMK1后，（最右侧）宽视野图像标记myc。（B） 对照细胞中的BC形成：电镀后第5天（顶部）或第15天（底部）标记DPPIV、CE9（绿色）和ZO1（红色）的细胞的x-y期和共聚焦荧光图像。（C） 分析前48小时，用GFP控制病毒（GFP）或表达KN-EMK1腺病毒的KN-EMK1转导KN-EMK-1表达细胞上的BC形成。棒材，10μm。第9天，对照组和KN-EMK1细胞中的（荧光）DPPIV；（直方图）在电镀后第5天、第7天、第9天、第11天、第13天和第15天，从～1500个细胞的相位图像中计数细胞间半透明孔BCs。在第5、7、9和13天用表达腺病毒的GFP（蓝条）或KN-EMK1（红条）的相同pfu感染细胞，并在感染后48 h进行分析；黑条，未感染的细胞。数据来自三个独立的实验。棒材，10μm。
图6。
图6。
EMK1促进肝脏MT组织。GFP病毒（对照）或KN-EMK1腺病毒（KN-EMK1）表达后第11天、第2天的WIFB9细胞；EMK1-MDCK细胞在重组激酶存在（EMK1）或不存在（对照）的情况下Ca转换24小时后。中心体平面的共焦截面；中心蛋白，一种中心体标记物（红色）、MT（绿色）和细胞核（蓝色）。（方案）红色，中心体；绿色，MT及其+/-端方向；和棕色管腔标记。箭头表示中心体。棒材，10μm。注意，细胞在固定前被洗涤剂提取，导致WIFB对照细胞中的GFP完全提取。
图7。
图7。
EMK1促进MDCK细胞外侧皮层MT的组装。（A） 通过在EMK1-MDCK细胞极化（EMK1）后提取多西环素诱导重组EMK1；用EMK1-siRNA载体转染内源性EMK1-KO，将其敲除，培养48h；显示的对照组代表了保存在多西环素中的EMK1-MDCK细胞和转染对照siRNA-vector的MDCK细胞。MT组织，MT最顶端（ap）和中间平面（mid）的共焦切片；箭头，外侧皮质MT；37°C下诺康唑治疗1h后MT稳定性、顶部和侧面MT；和MT成核，MT asters（绿色）代表冷处理后MT再聚合过程中的MT成核中心。β-微管蛋白标签在所有面板中均为绿色。此外，对照细胞和EMK1细胞在x-y视图中显示β-连环蛋白（红色），在x-z视图中显示细胞核（蓝色）。Pericentrin是一种中心体标记物（红色），在x-z切片中定位于β-微管蛋白aster。在EMK1-KO细胞中，E-cadherin和细胞核标记为蓝色。棒材，10μm。模型（右）：中心体定位（红点）和MT排列（红线）差异的示意图；黑色箭头表示垂直MT的数量。（B）MT再生：诺克唑洗脱4分钟后，对照组和EMK1-KO细胞的连续根尖至基底x-y切片标记MT（绿色）、β-catenin（红色）和γ-tubulin（蓝色）。注意，在对照细胞的外侧皮质和EMK1-KO细胞的核周区，MTOC释放的MT（标记为γ-微管蛋白；星号）（箭头所示）。棒材，10μm。
图8。
图8。
EMK1通过两步过程调节MT和流明极性。本研究中使用的三个模型系统：MDCK细胞中的钙开关（顶部路径）、MDCK单层的胶原覆盖（中间路径）和肝细胞系WIFB9的长期培养（底部路径）。在所有系统中，柱状极性在低钙培养时都会瞬间丧失2+胶原蛋白覆盖层（MDCK）的水平或增加，或过渡柱状期（WIFB9）的自发丧失。在非极化状态下，管腔标记物（绿色）积聚在细胞内储存室中（钙转换前的MDCK；WIFB）或检测不到（胶原覆盖下的MDCK细胞），MT（红线）呈放射状排列（MTOC，红点）。EMK1信号转导增加（1）导致非极化期转化为“肝极性期”，在细胞-细胞接触部位有一个水平MT阵列和一个亚蛋白中心体和管腔结构域（钙开关中的VAC胞吐，胶原覆盖层和WIFB9细胞中的自发细胞间腔形成）。在第2步中，EMK1信号水平调节上皮细胞的最终极性。高EMK1信号水平，如EMK1过度表达的MDCK细胞或WIFB9细胞（本例假设），巩固了侧腔极性和水平MT组织（“肝型”）。较低的EMK1信号水平，如对照组MDCK细胞，导致管腔结构域重新定位到细胞顶点和垂直MT（柱状组织）。
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