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.2003年3月1日；255(1):178-91.
doi:10.1016/s0012-1606（02）00047-7。

PI3-激酶和PIP3在颌下腺分支形态发生中的作用

梅琳达·拉森 1, 马修·P·霍夫曼, 酒井隆行（Takayoshi Sakai）, 贾斯汀·奈鲍尔, 乔纳森·米切尔, 肯尼斯·山田
附属公司

PI3-激酶和PIP3在颌下腺分支形态发生中的作用

梅琳达·拉森等。 求文献一篇. .

摘要

小鼠颌下腺（SMG）上皮在胚胎发育过程中经历了广泛的形态发生分支，这是建立其腺结构的第一步。然而，SMG分支形态发生所需的特定信号通路尚不清楚。通过E13小鼠SMG器官培养，我们发现磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3-激酶）抑制剂、沃特曼和LY294002显著抑制SMG的分支形态发生。去除间充质的上皮原基的分支形态发生同样受到抑制，表明PI 3-激酶抑制剂直接作用于上皮。免疫染色和Western分析表明，PI3-激酶的p85亚型在上皮中的表达水平高于间质。PI 3-激酶的靶点Akt/蛋白激酶B（PKB）通过Western分析显示，在PI 3-激酶抑制剂存在的情况下，Ser（473）的磷酸化降低。PI 3-激酶的主要脂质产物，磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP（3）），在PI 3-激酶抑制剂存在下通过膜运输载体外源性添加到SMG中，并被发现可以刺激分裂形成，这是分支形态发生的第一步。总之，这些数据表明，PI3-激酶通过PIP（3）途径在小鼠SMG上皮分支形态发生的调节中发挥作用。

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数字

图1
图1
PI 3-激酶抑制剂在器官培养中抑制唾液腺分支形态发生。（A）E13 SMG用20μM LY294002或对照介质并观察用延时显微镜观察20小时，显示的是第一张和最后一张对照图像经LY处理的SMG（参见http://wwwdir.nidcr.nih.gov/dirweb/cdbrb/DMD/larsen/DB/movies.asp电影1）。在20μM LY294002相对于20小时时的对照腺体。（B，C）PI 3-激酶抑制剂LY和沃特曼（wmn）以增加的浓度添加到SMG器官培养物中。E13 SMG培养物中LY（B）和wmn（C）的剂量反应显示年-轴。从生长培养基中去除抑制剂后，LY对SMG分支的影响可以逆转。所示为24小时的SMG：控制（D），10μM LY（E）和50 nM wmn（F）。68小时后，对照腺体（G）继续分支，用LY（h）处理的SMG仍然受到抑制。（一） 用LY处理SMG 24小时，然后切换到对照培养基（LY-wash），SMG已恢复分支。（J） 用10定量抑制μ24小时的M LY和从培养基中取出LY后SMG的恢复，用芽/腺体表示，标准化为2小时每个腺体的芽数，并用任意单位（AU）与时间表示。通过单因素方差分析，所有样本之间的差异（24小时时的LY和LY-wash除外）在P（P）<0.05，68小时时LY和LY-wash之间的差异在P（P）<0.0001，不成对，双尾t吨检验，假设方差相等。比例尺，100μ米。
图2
图2
PI 3-激酶抑制剂抑制无间充质的SMG培养物中的分支形态发生。（A） 分离E13 SMG，酶法和物理去除间充质。（B） 缺乏间充质的SMG在Matrigel中培养48小时，培养基中含有20 ng/ml EGF和200 ng/ml FGF7，发生分支形态发生。（C，D）SMG上皮雏形在Matrigel中生长，含有EGF和FGF7的培养基在PI 3-激酶抑制剂存在下培养48小时，其分支减少：20μM LY（C）和50 nM wmn（D），表明PI 3-激酶抑制剂直接作用于上皮细胞。比例尺，100μ米。
图3
图3
PI3-激酶在胚胎SMG中表达。（A） 用识别PI 3-激酶p85亚型的抗体探测E12和E13 SMG提取物，在两种提取物中均观察到表观分子量为85 kDa的条带。E13 SMG被固定，免疫染色，并通过共焦显微镜检查。图中所示为单个芽的单个部分，标记有：（B）抗p85抗体，（C）基膜标记物perlecan，和（D）结合肌动蛋白丝并显示标记分子有效渗透的罗丹明-球蛋白。（E） 三个通道的合并。PI 3-激酶主要定位于上皮（e），部分定位于间质（m）。比例尺，20μ米。
图4
图4
E13 SMG中PI 3-激酶和下游靶点Akt的Western分析。（A） 生成富含上皮（E）和间充质（M）的细胞提取物，并通过西方分析进行分析。使用上皮标记物E-cadherin和间充质标记物vimentin来确认分离的有效性。与免疫定位一致，PI 3-激酶主要在上皮细胞中表达，而Akt在两个细胞室中表达。（B） （A）中西方分析的定量，以每条带相对于每条车道肌动蛋白控制的相对像素密度表示。（C） 用LY（25μM） 或wmn（50 nM）1.5、3、7或25 h。提取物用抗pAkt（Ser473)剥离并复制印迹上的Akt和肌动蛋白抗体。（D） （C）中蛋白质印迹的定量，以每条泳道中每条带相对于肌动蛋白对照的相对像素密度绘制，并在每个时间点标准化为对照，表明Akt在Ser473与LY的潜伏期增加相关。在25小时和1.5–7小时时，wmn治疗显示出类似的效果（数据未显示）。
图5
图5
项目实施计划三在LY抑制剂存在下刺激SMG分支。用含有10μM LY+托架C1（A和C）或10μM LY+C1+PIP三（B和D）。项目实施计划三相对于（C）中的配对腺体，在10mM LY的存在下刺激裂隙形成（参见D中高放大视图中的箭头）。（E） 计算每个腺体的裂口数，并绘制出与时间零点时每个腺体裂口数相关的图表，以AU表示。比例尺，100μm（A、B）和50μm（C，D）。
图6
图6
PI 3-激酶抑制剂对SMG的作用不同于其他信号分子。44小时后，与对照SMG（A）相比，10μ经M LY处理的E13 SMG（B）表现出较少且较大的圆形芽，而50个μM PD98059处理的SMG（C）的芽数减少。10的组合μM LY和50μM PD98059（D）与（E）中量化的LY相比无显著差异。用EGFR信号抑制剂PD153035在50 pM（F）下处理SMG，与对照相比，芽数减少（a）。（G） 结合LY（5μM） 和PD15035（50pM），与单独的LY几乎没有差异，这可以定量观察到（H）。（一） 用1.5处理SMGμFGFR1信号抑制剂M SU5402的茎伸长，芽结构异常。（J） 用LY（5）治疗SMGμM） 和SU5402（2μM） 显示了使人联想到这两种抑制剂的复合形态，以及量化时的加性抑制效应（K）。比例尺，100μ米。
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