介绍
蛋白激酶C包含一个带有NH的丝氨酸/苏氨酸激酶家族2-含有独特的富含半胱氨酸的Zn-finger基序的末端自动调节区（有关综述，请参阅Hug and Sarre 1993年). 其中，非典型PKC（aPKC）代表了该家族的一个亚组，包括λ/∏和ζ亚型，其活性既不受钙也不受二酰基甘油/佛波酯的影响。包括我们在内的几项研究表明，aPKC在体内通过涉及磷脂酰肌醇3-激酶的途径被激活(Akimoto等人，1996年;Toker和Cantley 1997)和参与多种信号转导途径，指导有丝分裂原刺激的细胞生长(Berra等人，1993年;Akimoto等人，1996年)，胰岛素刺激的GLUT4易位(Kotani等人，1998年)和凋亡(Diaz-Meco等人，1996年).
最近，我们鉴定了一种哺乳动物同源物秀丽隐杆线虫PAR-3，六个之一标准建立单细胞胚胎细胞极性所必需的基因产物(Kirby等人，1990年;Guo和Kemphues 1996)，作为aPKC特异性相互作用蛋白（ASIP）(Izumi等人，1998年). 然后，我们证明了这一点秀丽线虫aPKC，PKC3也直接与PAR-3结合，在单细胞胚胎中表现出不对称分布于前周，如PAR-3(Tabuse等人，1998年). PKC-3和PAR-3之间的功能相互作用进一步证明，PKC-3的RNAi导致PAR-3不对称分布的破坏，以及类似于在第3部分突变体(Tabuse等人，1998年). 这些结果表明aPKC具有一种意想不到的生理功能：它需要建立或维持细胞的极性秀丽线虫早期胚胎。非常有趣的是，我们之前的研究还表明，在顶端-基底细胞极性发育良好的哺乳动物上皮细胞中，ASIP/PAR-3与PKC一起集中在紧密连接处（TJ）(Drubin和Nelson，1996年;Izumi等人，1998年). 考虑到TJ是上皮特异性连接结构之一，被认为对维持上皮细胞表面极性很重要，这一结果提出了一个非常有趣的可能性，即aPKC-PAR系统在细胞极性的建立中起着基础性作用，而不仅仅是在秀丽线虫胚胎，也存在于哺乳动物的上皮细胞中。
在这项工作中，我们报道了使用腺病毒表达载体将aPKC的显性阴性突变体（aPKCkn）引入MDCK II细胞，以直接检测aPKC在上皮细胞极性中的功能重要性。我们提供证据表明，aPKCkn可以阻止钙离子转换后或正常细胞生长期间紧密连接形成的完成。aPKCkn表达细胞的细胞表面极性受损还表现为荧光膜脂质的域间扩散增加和Na的非对称分布被破坏+，K+-ATP酶。另一方面，我们还证明，aPKC不仅与ASIP/PAR-3相关，而且与另一个对基因产物PAR-6的哺乳动物同源物相关，PAR-6与PKC-3和PAR-3在秀丽线虫胚胎(Watts等人，1996年;Tabuse等人，1998年;1999年洪和坎普). 正如预期的那样，哺乳动物PAR-6与aPKC和ASIP/PAR-3一起定位于顶端连接区。这些结果表明，aPKC可能通过与ASIP/PAR-3和PAR-6形成三元复合物，在上皮连接结构的发育中起关键作用，并控制哺乳动物上皮细胞的细胞极性。
材料和方法
Northern Blot分析
Northern blot分析是按照使用人类多组织Northern blot（CLONTECH Laboratories，Inc.）的标准程序进行的。克隆n32（1269 bp）和克隆16-5-5（1162 bp）的放射性标记cDNA插入物分别用作探针，以检测人类PAR-6和16-5-5 mRNA（参见补充图S2）。
抗体
本研究中使用的抗体是：兔抗nPKCδ（δ5）、抗aPKCλ（λ1，λ2）和抗ASIP（C2-3）多克隆抗体，之前在我们实验室中获得(Mizuno等人，1991年;Akimoto等人，1994年;Izumi等人，1998年); 小鼠抗ZO-1和大鼠抗claudin-1单克隆抗体（获自日本京都京都大学S.Tsukita博士）；兔抗-Na+，K+-ATP酶多克隆和小鼠抗gp135单克隆抗体（来自加利福尼亚州斯坦福大学J.D.Nelson博士）；小鼠抗aPKCⅦ、E-cadherin和β-catenin单克隆抗体（转导实验室）；兔抗闭塞素和ZO-1多克隆抗体（Zymed Laboratories）；兔抗aPKCζ多克隆抗体（C-20；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）；小鼠抗T7单克隆抗体（Novagen）；小鼠抗Flag单克隆抗体（M2；Sigma-Aldrich）。在兔子体内产生抗人PAR-6多克隆抗体GW2、GC2和N12。GW2AP是针对谷胱甘肽-S-转移酶（GST）-人PAR-6提出的，并在麦芽糖结合蛋白（MalE）-PAR-6亲和柱上纯化。针对GST–PAR-6（氨基酸126–346）提高GC2AP并如上所述纯化。N12AP针对MalE–PAR-6（氨基酸1-125）升高，并在MalE和MalE-PAR-6柱上纯化亲和力。
表达式向量
如前所述，获得了编码野生型小鼠aPKCλ及其激酶缺失突变体（aPKC∧kn）的互补DNA(Akimoto等人，1994年,Akimoto等人，1996年). 如前所述，使用cosmid载体pAxCAwt生成编码这些cDNA的腺病毒载体(Miyake等人，1996年). 小鼠nPKCδ激酶缺陷突变体（赖氨酸376被丙氨酸取代）的腺病毒载体；Hirai等人，1994年)小鼠aPKCζ（赖氨酸281被色氨酸取代）是Oka博士（日本山口大学）慷慨赠送的礼物；LacZ的载体来自Riken基因库(Miyake等人，1996年). 在SRHis载体上构建T7标记的ASIP表达载体(Izumi等人，1998年); ASIPwt编码全长大鼠ASIP（氨基酸1–1337），而ASIPΔ30编码缺乏氨基酸残基741–743和827–856的ASIP剪接亚型。在pME18S标记载体上构建标记人PAR-6表达载体；PAR-6wt编码全长PAR-6（氨基酸1–346），PAR-6ΔaPKCBD缺少对应于aPKC结合域的氨基酸1–125，而PAR-6△CRIB/PDZ缺少对应于CRIB和PDZ域的氨基酸126–258。编码野生型或缺失氨基酸1-47的突变型的aPKCλ表达载体（aPKC∧ΔN47）已在前面描述过(Akimoto等人，1994年).
细胞培养与腺病毒感染
MDCK II细胞在含有10%FCS、青霉素和链霉素的DMEM中生长，生长在12 mm圆形盖玻片或12 mm直径的Transwell™过滤器（Corning Coaster Corp.）上，过滤器的孔径为0.4μm。对于腺病毒感染，细胞接种在24孔板（1.25×10）上5细胞/厘米2)感染前1天，或过滤器插件（1.5×105细胞/厘米2)感染前2天。为了提高病毒感染的效率，低钙预培养细胞会破坏细胞间的粘附2+含有5%FCS和3μM Ca的（LC）培养基2+(Stuart等人，1994年)2小时，然后用150μl稀释至3×10的适当病毒溶液将细胞培养1小时8pfu/ml在LC培养基中。当受到钙开关的影响时(Gumbiner和Simons 1986年)，细胞在新鲜LC培养基中培养>20h，然后用正常钙替换培养基2+（NC）生长培养基。在钙转换后的适当时间，对细胞进行处理以进行免疫荧光分析。当跳过钙开关时，病毒感染后立即在NC培养基中培养细胞，使细胞在异位蛋白表达之前完成TJ的形成。
免疫细胞化学
用含有0.9 mM CaCl的PBS清洗盖玻片或过滤器上生长的细胞两次2和0.49 mM氯化镁2在室温下用2%多聚甲醛在PBS中固定15分钟。然后用含有0.5%（vol/vol）Triton X-100的PBS渗透细胞10分钟，并在室温下用含有10%小牛血清的PBS封闭细胞1小时。仅在claudin-1免疫染色的情况下，使用含有0.3%多聚甲醛和0.1%Triton X-100的PBS同时进行固定和渗透程序。在37°C下，在含有10 mM Tris/HCl、pH7.5、150 mM NaCl、0.01%（vol/vol）Tween 20和0.1%（wt/vol）BSA的缓冲液中进行抗体孵育45分钟。使用的二级抗体为：BODIPY或Alexa488-共轭羊抗兔IgG（Molecular Probes Inc.）、Cy3-共轭羊抗鼠IgG、，Cy3-共轭山羊抗兔IgG（Amersham Pharmacia Biotech）和FITC-共轭山羊抗鼠IgG抗体（EY Laboratories）。为了染色F-actin，使用罗丹明-球蛋白（Molecular Probes Inc.）代替次级抗体。使用Vectashield（Vector Laboratories）安装盖玻片，并在配备共焦系统的荧光显微镜下进行检查（μRadiance；Bio-Rad Laboratory）。为了进行免疫组织化学，将小鼠（12周龄）的一段小肠固定在4°C的2%多聚甲醛/PBS中30分钟，用50 mM NH冲洗4Cl/PBS，在4°C下用含有1.0 M蔗糖的PBS处理24小时，并嵌入Tissue-Tek OTC化合物中。冷冻的组织是在低温恒温器中切割的。切片（～7μm）安装在玻璃载玻片上，并按照上述方法进行染色。
MDCK细胞TJ屏障功能的评价
如其他地方所述，使用ERS电阻系统（Millipore）测量过滤器上生长的MDCK II单层的跨上皮电阻（TER）(Balda等人，1996年). TER值是通过减去过滤器和洗浴液的贡献得到的，用欧姆×厘米表示2在腺病毒感染的MDCK II细胞汇合单层上进行细胞旁流量测量，该细胞在2天前接受了钙离子交换。如前所述，制备FITC-共轭右旋糖酐40K和500K（分别为40和500 kD；Molecular Probes，Inc.）的储备溶液(Balda等人，1996年). 试验开始时，用含有0.5 mg/ml FITC-共轭葡聚糖的200μl DMEM/FBS替换顶端培养基，用不含示踪剂的600μl DMME/FBS替换基底培养基。将细胞在37°C下培养3 h，然后收集基本培养基，并用荧光计测量可扩散FITC-右旋糖酐（激发，492 nm；发射，520 nm）。根据已知示踪剂浓度的滴定曲线计算右旋糖酐的量。
质膜的荧光脂质标记
使用BODIPY-FL-C5鞘磷脂（Molecular Probes，Inc.）和脱脂的BSA（Sigma-Aldrich）在P缓冲液（10 mM Hepes，pH 7.4，1 mM丙酮酸钠，10 mM葡萄糖，3 mM CaCl）中制备鞘磷脂/BSA复合物（5 nmol/ml）2和145 mM NaCl；Pagano和Martin 1994年). 将经钙离子交换的腺病毒感染的MDCK细胞用冰镇P缓冲液冲洗两次，然后将200μl鞘磷脂/BSA复合液添加到顶端隔室，将600μl冰镇P缓冲器添加到基底隔室。标记10分钟后，将细胞在冰冷的P缓冲液中洗涤两次，并在冰上进一步在P缓冲液中孵育1小时或直接制备用于显微镜检查。荧光脂质的分布如前所述使用共焦激光扫描显微镜进行分析(Balda等人，1996年).
免疫沉淀分析
通过电穿孔将合适的cDNA表达质粒转染COS1细胞（Gene Pulser；Bio-Rad实验室）。将培养在10厘米培养皿中的这些细胞悬浮在200μl含有20 mM Hepes、pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM EDTA、50 mM NaF、1 mM-Na的裂解缓冲液中三VO（旁白）4、10μg/ml亮氨酸肽、1 PMSF、1.8μg/ml抑肽酶和1%Triton X-100。在冰上孵育30分钟后，通过14000 rpm离心30分钟澄清裂解产物，并在4°C下与蛋白G-sepharose（Amersham Pharmacia Biotech）上预吸收的抗体孵育1小时。用裂解缓冲液洗涤四次后，免疫复合物在SDS样品缓冲液中变性，并通过SDS-PAGE进行分离。
电泳和Western Blot分析
将200μl SDS样品缓冲液添加到每个孔或上述免疫复合物中制备的MDCK II细胞提取物在8%凝胶中进行SDS-PAGE。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）上，然后将其浸泡在5%脱脂牛奶中。如前所述，处理吸水膜进行免疫反应(铃木等人，1995年)，并通过化学发光ECL系统（Amersham Pharmacia Biotech）进行可视化。使用发光图像分析仪LAS-1000（日本东京富士胶片公司）对化学发光信号进行量化。
酵母双杂交分析
通过标准方法将PAR-6和aPKCλ的各种缺失突变体分别亚克隆到pAS2-1C和pGAD424（CLONTECH Laboratories，Inc.）中，同时转化到酵母菌株HF7C（CLONTECH Laboratory，Inc.）(Gietz等人，1992年). 在30°C条件下，在缺乏色氨酸和亮氨酸或缺乏色氨醇、亮氨酸和组氨酸的选择性培养板上生长4d后，通过菌落形成评估相互作用。
在线补充材料
补充图S1：人类PAR-6与其他PAR-6同源物的比较。补充图S2：人体组织中PAR-6 mRNA的Northern blot分析。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/152/6/1183/DC1。
结果
aPKC功能衰竭导致ASIP/PAR-3和ZO-1定位错误
已有研究表明，一个缺乏激酶的aPKCλ突变体（aPKC∧kn），其中ATP-结合位点中的保守赖氨酸残基被谷氨酸取代，对HepG2细胞中依赖于aPKC的TRE（TPA-response element，TPA反应元件）的激活具有显性负效应，以及3T3-L1脂肪细胞中胰岛素刺激的葡萄糖摄取和GLUT4易位(Akimoto等人，1996年;Kotani等人，1998年). 作为评估aPKC在上皮细胞极性中作用的第一步，我们使用腺病毒介导的基因转移方法在MDCK II细胞中过度表达这种aPKCλ突变体，并分析其对ASIP/PAR-3结合定位的影响。如所示MDCK II细胞融合单层的腺病毒感染导致aPKCλkn和aPKC∧wt的异源表达，从极高水平到最低水平，产生饱和免疫荧光信号，信号略高于背景。根据aPKCλwt和aPKC∧kn的免疫染色结果估计当前条件下的感染效率均为～40%(、a和c，以及). SDS-PAGE分析显示，与内源性aPKCλ相比，这两种蛋白的平均过表达量为五倍（数据未显示）。过度表达的aPKCλkn和aPKC∧wt广泛分布于细胞溶质中，没有显示内源性蛋白的显性连接定位(Dodane和Kachar，1996年;Izumi等人，1998年)，表明异位aPKC的膜锚定位点很少保留（注意，这里使用的抗aPKCλ抗体不能清楚地检测内源性aPKCλ；参见c、 左上角）。这似乎与大量内源性aPKC也分布在胞浆中这一事实相一致(Izumi等人，1998年).
表1
| | ZO-1染色 | 小环结构 | 表达可检测水平异位aPKC的细胞 |
|---|
| 完全消失 | 零碎的 | 完成 |
|---|
| | | % | | % | | % | | % |
| LacZ公司 | | 0 | 0 | 6 | 1.2 | 504 | 98.8 | 0 | 第二次 |
| aPKCλwt | | 0 | 0 | 0 | 0 | 564 | 100 | 0 | 38.8 |
| PKCλkn | | 86 | 10.4 | 426 | 51.4 | 316 | 38.2 | | 43.1 |
| 表达式级别 | −/+ | 9 | 1.9 | 198 | 42 | 264 | 56.1 | 37 | |
| + | 24 | 10.8 | 152 | 68.5 | 46 | 20.7 | 8 | 26.8 |
| ++ | 30 | 33.7 | 54 | 60.7 | 5 | 5.6 | 1 | 10.7 |
| +++ | 23 | 50 | 22 | 47.8 | 1 | 2.1 | 0 | 5.65 |
在融合的MDCK单层中过度表达缺乏激酶的aPKCλ突变体（aPKCkn），只有当细胞发生钙离子交换时，才会破坏ASIP和ZO-1的连接定位。（a） 接种在盖玻片上的融合MDCK细胞感染编码aPKCλkn的腺病毒载体。病毒感染后20小时，对细胞进行钙离子交换（+CS）或不治疗（−CS）（见材料和方法）。再过20小时，用顶部（左侧和中部）所示的抗aPKCλ和抗ASIP双重标记细胞。每张照片代表了使用激光扫描共焦显微镜从顶膜到基底膜获得的光学截面（0.4μm）的投影视图（除非另有说明，否则以下数据是以相同的方式获得的）。请注意，照片中未观察到内源性aPKCλ的荧光信号，因为使用的抗aPKC∧抗体（λ2）不够敏感，无法清楚地检测MDCK II细胞中的内源性蛋白，并且因为调整了暴露时间以覆盖aPKCκkn表达的高度异质性水平。（右）经抗ZO-1抗体染色的独立样本。棒材，25μm。（b） aPKCλkn表达水平与ZO-1定位错误严重程度的相关性。根据aPKCλ的荧光强度，细胞分为不可检测（−/+）、低（+）、中（++）或高（++）表达，相应细胞的ZO-1染色模式估计为完全（白色）、部分消失（阴影）或完全消失（黑色）。原始统计数据见（c）用抗aPKCλ和抗ZO-1抗体对钙开关作用下的LacZ-或aPKC∧wt表达细胞进行双重染色。棒材，25μm。
当aPKCλkn在正常钙离子条件下维持的MDCK II细胞中表达时，即使在aPKC∧kn表达水平极高的细胞中，ASIP/PAR-3的连接定位也没有受到损害(a、 −CS）。然而，如果表达aPKCλkn的细胞进行钙离子交换以诱导细胞-细胞粘附的中断-再生过程，则ASIP/PAR-3的连接染色受到显著影响(a、 +CS）。尽管相位对比观察（数据未显示）表明汇合单层明显恢复正常，但ASIP/PAR-3在整个细胞周长上并没有形成完整的连接分布，即使在钙离子转换后6小时（参见a） 对照细胞钙离子转换后<2h达到。这种细胞-细胞边界的零碎染色在钙离子转换后20小时保持不变(a、 +CS），表明aPKCλkn显著抑制了ASIP/PAR-3的连接定位。有趣的是，TJ标记物ZO-1在细胞中的连接定位同样受到钙开关依赖性的干扰，这表明TJ形成本身受到严重影响(a、 右侧）。总结了在钙转换后20小时观察到的ZO-1定位错误的统计结果。而大多数（>99%）感染携带LacZ和aPKCλwt的腺病毒载体的细胞显示正常的ZO-1染色(c、 和)，>60%感染aPKCλkn编码腺病毒载体后，ZO-1出现部分或完全定位错误。ZO-1定位错误的严重程度与aPKCλkn表达水平密切相关(、和b） ；例如，>50%的高荧光信号（+++）细胞显示ZO-1完全消失，而低荧光信号（+）细胞的ZO-1消失率<11%。另一方面，数据也表明，>40%的细胞对aPKCλ荧光信号（−/+）明显呈阴性，也显示出零星的ZO-1分布。考虑到所用抗aPKCλ抗体的低敏感性，以及荧光信号强度与表型严重程度之间的比例相关性(b） ，我们推断实际感染效率高于估计，并且一些荧光信号阴性的细胞也表达aPKCλkn的水平，这些水平是检测不到的，但仍然足以影响ZO-1的分布。
aPKCλkn-表达细胞中各种连接成分和F-actin的分布。表达aPKCλkn的MDCK II细胞的融合单层受到钙开关的影响。6 h后，通过双重染色将ZO-1分布与其他TJ组分（a）或粘附连接组分（b）进行比较，如图所示。对于E-钙粘蛋白和罗丹明-球蛋白染色，也提供了表达LacZ细胞的数据以供参考。箭头表示异常小环连接结构的位置，箭头表示ZO-1和比较的TJ成分之间观察到差异染色的区域。棒材，25μm。（c和d）腺病毒感染的MDCK II细胞中几种连接蛋白的Western blot分析。细胞进行钙离子转换，6小时后裂解，并使用所示抗体进行Western blot分析（左）。（c） 给出了典型的蛋白质印迹分析结果。感染的病毒显示在顶部。根据印迹膜考马斯亮蓝染色的定量结果（数据未显示），对每条通道中的蛋白质总量进行精细调整。基于三个独立实验的定量结果，检测了表达LacZ（白色条）、aPKCλwt（阴影条）或aPKC∧kn（黑色条）的MDCK细胞中指示蛋白的数量，以d表示。使用发光图像分析仪定量每个结合蛋白免疫染色带的化学发光信号。
a表明，随着aPKCλwt和aPKC∧kn数量的增加，联合感染逐渐以剂量依赖的方式恢复ZO-1的网状染色。此外，b表明，在引入aPKCζkn后，观察到了相同的表型，但没有观察到nPKCδkn。由于aPKCλ和aPKCζ之间具有显著的序列相似性，我们不能排除aPKC∧kn不仅对内源性aPKCκ产生影响，而且对aPKCξ产生影响的可能性，反之亦然。事实上，我们观察到与aPKCζwt联合感染可以挽救由aPKCλkn引起的TJ形成缺陷表型（数据未显示）。因此，我们得出结论，观察到的ASIP/PAR-3和ZO-1的定位错误是由aPKC激酶缺陷突变体对内源性aPKC（λ和/或ζ）活性的显性负效应引起的。
aPKCkn通过其对内源性aPKC活性的显性负效应，特异性干扰ZO-1的连接定位。（a） 将与编码aPKCλwt和aPKC∧kn的腺病毒载体共同感染的MDCK II细胞进行钙开关，如20小时后，用抗ZO-1抗体染色。通过与LacZ编码病毒载体混合，将感染的总多重性标准化为120。每个矢量的混合比率如下：aPKCλkn:aPKC∧wt:LacZ=2:0:2（顶部）、2:1:1（中部）和2:2:0（底部）。注意，共表达aPKCλwt的数量增加，越来越多地挽救了aPKC∧kn引起的表型。（b） 过度表达aPKCζwt、ζkn或δkn的MDCK II细胞的制备类似于20小时后，用对应于每个PKC亚型（左）和抗-ZO-1（右）的抗-PKC抗体进行双重染色。棒材，25μm。
aPKCλkn作用的钙开关依赖性表明，只有当细胞形成连接结构以建立上皮细胞极性时，这种显性阴性突变体才有效。事实上，我们进一步观察到当细胞在正常生长条件下形成新的细胞-细胞接触并发展为TJ时，aPKCλkn的类似作用。如所示在病毒感染后立即稀疏接种细胞，并在免疫荧光分析前培养40小时，表达LacZ或aPKCλwt的细胞外观正常，而表达aPKC∧kn的细胞呈扁平状，有明显的跛足(c） ASIP/PAR-3和ZO-1染色许多细胞-细胞边界阴性(、a和b）。然而，值得注意的是，即使在细胞-细胞边界没有ASIP/PAR-3或ZO-1染色的情况下，aPKCλkn-表达细胞仍会形成岛状结构，并通过细胞-细胞粘附相互靠近(c） ●●●●。这些结果表明，aPKCλkn对TJ形成的影响并不是完全破坏细胞间粘附的结果。
在正常生长条件下，aPKCkn的过度表达也破坏了MDCK II细胞中ASIP和ZO-1的连接定位。用所示腺病毒载体感染的MDCK II细胞稀疏接种（1.7×104细胞/厘米2)并在40小时后进行免疫荧光分析。（上图）使用的抗体已标明。棒材，25μm。
aPKCλkn-表达MDCKⅡ细胞中TJ成分和F-actin组织的异常定位
显示了钙开关后6 h对aPKCλkn-表达细胞融合单层的详细免疫荧光分析结果。ZO-1和ASIP/PAR-3的双重染色显示，这些具有三个PDZ结构域的外周TJ蛋白完全共定位，如断裂连接染色所示(a） ●●●●。此外，组成TJ链、闭塞素和克劳丁-1的主要膜蛋白的膜累积(Furuse等人，1993年,Furuse等人，1998年b)，也被禁止。由于观察到不成熟的连接结构对ZO-1呈阳性染色，但对闭塞素或克劳丁-1无阳性染色，因此aPKCλkn过度表达对这些膜蛋白的影响似乎比对ZO-1或ASIP/PAR-3的影响更严重(a、 箭头）。最近的结果(Gow等人，1999年)已经表明，claudin-11缺陷小鼠在少突胶质细胞和支持细胞的髓鞘中缺乏TJ链，而这种claudin亚型主要在支持细胞中表达(Morita等人，1999年). 因此，上述结果表明，aPKCλkn-表达细胞在TJ结构本身的发育中存在缺陷。E-cadherin的基底外侧定位似乎受影响较小，但在缺乏ZO-1染色的接触区荧光强度较弱(b） ●●●●。罗丹明-球蛋白染色显示，aPKCλkn-表达细胞在围绕上皮细胞周长形成的皮质F-actin束中显示缺陷(b） ●●●●。相反，这些细胞表现出F-actin的应力纤维样结构的显著保留。此外，一些细胞表现出特征性的大F-actin聚集体，其位置完全对应于包含此处检测的所有TJ成分的异常小环结构(，a和b，箭头）。这些结果表明，aPKCλkn干扰上皮特异性连接结构的发育，如带状粘附连接（AJ）和TJ，这是由F-actin和连接成分之间的协同作用介导的。由于TJ的异常小环结构仅在aPKCλkn低表达的细胞中观察到()当aPKCλkn对内源性aPKC活性的抑制不完全时，可能会产生这些结构。
和，显示Western blotting分析的结果，以检查在钙转换后6 h采集的腺病毒感染的MDCK II细胞中几个连接蛋白的数量。钙开关后aPKCλkn-表达细胞的长时间孵育（20 h）导致ASIP/PAR-3和ZO-1的数量减少，可能是因为它们无法通过被招募到结合复合体中来稳定（数据未显示）。然而，至少在细胞极化的早期，当aPKCλkn-表达细胞明显显示TJ形成缺陷时(a） ，所检查的连接蛋白的量没有显著减少(和). 这些结果表明，aPKCλkn过度表达的影响并不是由于结合蛋白的降解增强所致。
aPKCλkn-表达MDCKII细胞中TJ屏障功能的破坏
通过测量穿过渗透性载体上生长的细胞单层的被动离子流的TER，进一步从功能上证明了aPKCλkn表达细胞中TJ形成的缺陷(a） ●●●●。与中显示的免疫染色结果一致a、 如果在TJ生物发生完成后安排实验以诱导异位蛋白的表达，则包括LacZ、nPKCδkn或aPKCλwt以及aPKC∧kn在内的外源表达蛋白都不会影响TER(a、 顶部，0-45小时）。这也表明，这些蛋白质的过度表达，特别是aPKCλkn，不会对TJ屏障功能产生任何人为的细胞毒性作用。另一方面，如果随后对细胞进行钙离子交换（在LC培养基中培养2小时，然后切换到NC培养基），则只有表达aPKCλkn的细胞在TER发育中表现出较大的延迟(a、 顶部，45–70小时）。如果将低钙培养基中的预孵育时间延长至20小时，以确保钙转换前细胞-细胞附着物的分离，则aPKCλkn对TER发育的影响更为显著：类似于，在LC培养基中培养的细胞中诱导异位蛋白的表达，并在病毒感染后20 h应用钙开关(a、 底部）。在这种情况下，与LacZ-或aPKCλwt表达的对照细胞相比，aPKC∧kn-表达细胞的TER发育在钙转换后48小时之前受到了显著抑制，这表明在aPKCκkn-表示细胞中功能性TJ的发育受到了强烈抑制。
aPKCλkn的过度表达抑制了MDCK II细胞钙开关后TER的发展。（a） 用腺病毒载体感染生长在滤纸上的融合MDCK II细胞，并测量TER。（顶部）体外表达的蛋白质如下：无（X）、LacZ（•）、aPKCλkn(□), aPKCλwt(▵), 和nPKCδkn(○). 细胞接种后2天（1.5×105细胞/厘米2)当TER值达到稳定值时，在LC培养基中处理细胞进行腺病毒感染（时间0，左）2小时。病毒感染后，立即将培养基改为NC生长培养基，使细胞在表达异位蛋白之前完成连接结构的形成。在TER测量45小时后，通过将培养基换成LC培养2小时，然后再换回NC，对细胞进行钙离子交换。给出的值代表三个平行培养物的平均值（1±SD）。扣除了空滤波器获得的背景电阻。值得注意的是，只有表达aPKCλkn的细胞在钙离子转换后，TER发育迟缓。（底部）MDCK II细胞感染编码LacZ（•）、aPKCλkn的腺病毒载体(□), 或aPKCλwt(▵) 如a.在这种情况下，将细胞保存在新鲜的LC培养基中，以在没有细胞-细胞粘附的情况下诱导异位蛋白表达。病毒感染后20 h，将培养基改为NC培养基，并监测TER的发展48 h。注意，即使在钙离子转换后48 h，aPKCλkn-表达细胞也显示出对TER发展的实质性抑制。（b） aPKCλkn的过度表达以分子质量依赖的方式增加FITC-右旋糖酐的细胞旁扩散。评估FITC-右旋糖酐40K（左）和500K（右）在腺病毒感染的MDCK II细胞上的细胞旁扩散。在2天前将FITC-右旋糖酐添加到接受钙离子交换的细胞顶端的培养基中。在37°C下孵育3小时后，用荧光计测量基底侧培养基的荧光强度。给出的值代表三种平行培养物的平均值（±SD）。
通过测量非离子溶质的细胞旁扩散，也证实了表达aPKCλkn的细胞中TJ屏障功能的损伤(b） ●●●●。在这些实验中，细胞按照，并在钙离子转换48小时后测量FITC-右旋糖酐在MDCK II单分子膜上的扩散，以确保上皮细胞极性的发展。如所示b、 表达aPKCλkn，但不表达LacZ或aPKC∧wt的细胞在37°C下3小时内仍表现出FITC-共轭右旋糖酐40 K（平均40 kD）的五倍扩散增强。另一方面，右旋糖酐500（平均500kD）的扩散仅显示1.1倍的增强，证实右旋糖聚糖40扩散的增强不是由于aPKCλkn表达的细胞毒性作用。这些结果表明，TJ的发育需要aPKCλ活性，这对上皮细胞的屏障功能至关重要。
aPKCλkn-表达MDCK II细胞表面极性的破坏
TJ被认为有助于上皮细胞表面极性的建立，其作用是作为顶端和基底外侧膜结构域之间质膜外叶中脂质扩散的屏障(van Meer和Simons 1986年). 因此，发现aPKC功能缺失阻碍了包括TJ在内的上皮特异性连接结构的发育，这表明aPKCkn表达也可能导致上皮细胞表面极性的破坏。为了证实这种可能性，我们使用共焦显微镜检查了外源性荧光脂质在aPKCλkn表达细胞中的二维扩散。在a、 在4°C下用BODIPY-鞘磷脂标记心尖膜10分钟，然后在冰上再放置60分钟。对这些细胞的x–z切片的共聚焦显微镜分析表明，只有aPKCλkn表达细胞在60分钟追踪后显示出显著增强的侧膜标记，表明顶端膜和基底外侧膜之间的扩散屏障减少。
aPKCλkn的过度表达破坏了MDCK II细胞的顶-基底细胞表面极性。（a） 外标荧光脂质从顶端到基底外侧区的二维扩散。用BODIPY-鞘磷脂在冰上标记感染所示腺病毒载体并进行钙离子转换的滤过生长MDCK II细胞单层的顶部表面10分钟。然后立即将细胞安装（0分钟）或在大量清洗后在冰上再放置60分钟。然后通过共焦显微镜的z截面图分析荧光脂质的分布。上箭头和下箭头分别表示顶膜和基底膜的位置。棒材，25μm。（b和c）aPKCλkn对上皮极性标记不对称分布的影响。腺病毒感染的MDCK II细胞用抗aPKCλ和抗Na双重免疫染色+，K+-钙开关后20小时，ATP酶（b）或抗gp135抗体（c）。给出了共焦显微分析获得的典型xz截面图。请注意，aPKCλkn-表达细胞（箭头）显示NKA和gp135的定位受到干扰，这些蛋白在表达LacZ的对照细胞中显示极化分布。棒材，25μm。
另一方面，已经证明一些膜蛋白，例如基底外侧膜标记，Na+，K+-ATP酶（NKA）以及顶膜标记物gp135通过与区域特异性膜骨架结构的相互作用，即使在没有TJ的情况下也能保持其极化定位(Ojakian和Schwimmer 1988年;McNeill等人，1990年). 因此，为了评估aPKCλkn的过度表达不仅通过抑制TJ生物发生，而且通过干扰细胞极化的其他机制影响上皮细胞表面极性的可能性，我们检测了内源性NKA和gp135在aPKC∧kn表达细胞中的分布。在表达LacZ的对照细胞中，NKA局限于侧膜，而在表达aPKCλwt的细胞中，其极化定位受到轻微干扰，在顶膜中产生漏泄分布(b） ●●●●。值得注意的是，高度表达aPKCλkn的细胞在顶端和基底外侧膜域中几乎均匀分布NKA(b、 箭头），表明维持NKA极化分布所需的机械存在缺陷。gp135的顶端定位也受到aPKCλkn过度表达的影响(c） ：表达aPKCλkn的细胞倾向于在心尖膜上显示gp135水平降低。相反，在这些细胞中经常检测到增加的胞浆信号。
aPKC和ASIP/PAR-3在极化上皮细胞中形成包含秀丽线虫PAR-6哺乳动物同源物的蛋白质复合物
结合aPKC和ASIP/PAR-3之间进化上保守的相互作用，上述发现表明建立上皮细胞极性需要aPKC活性，这有力地支持了一种观点，即由aPKC蛋白和PAR蛋白组成的细胞极化机制存在于秀丽线虫也可能在哺乳动物的上皮细胞中保存。因此，我们下一步决定鉴定和表征秀丽线虫PAR-6与PKC-3和PAR-3相互依赖秀丽线虫单细胞胚胎(Watts等人1996;Tabuse等人，1998年;1999年洪和坎普). PAR-6的克隆人类同源物显示出与其他物种中的PAR-6同源物的总体相似性，共享几个保守序列延伸（补充图S1；c） ：（a）NH的序列2-末端区域包含两个高度保守的区域，即CR1和CR2；（b） 类似于CRIB基序的序列(Burbelo等人，1995年); 和（c）前面描述的COOH终端一半中的单个PDZ域(1999年洪和坎普). 另一方面，PDZ结构域之后的COOH末端区域很少保守。对人体组织的Northern分析表明，PAR-6在多种人体组织中表达（补充图S2）。为了证实PAR-6在MDCK细胞中的表达，我们提出了三种抗–PAR-6抗体，GW2AP、GC2AP和N12AP，它们是针对人类PAR-6全长126–346和1–125氨基酸而提出的。如所示a、 MDCK细胞裂解物的免疫沉淀分析显示存在一个与GW2AP和N12AP反应的43-kD蛋白，该蛋白通常与GW2AP和GC2AP免疫沉淀。再加上这个43-kD蛋白与COS1细胞中过度表达的人PAR-6（计算为37.4kD）结合(a） ，我们得出结论，该43-kD带代表上皮MDCK细胞中的内源性PAR-6蛋白。
全极化上皮细胞内源性PAR-6的鉴定及其与aPKCλ和ASIP的相关性。（a） MDCK II细胞内源性PAR-6蛋白的鉴定。用1μg亲和纯化的抗PAR-6兔多克隆抗体（GW2AP，GC2AP）或对照正常兔IgG免疫沉淀半融合MDCK细胞。使用括号（右）中所示的抗体对产生的免疫沉淀物进行Western blot分析。GW2AP和GC2AP特异性免疫沉淀一个43-kD蛋白与COS细胞表达的PAR-6结合，该蛋白被N12AP和GW2AP识别。（b） 体内PAR-6、aPKCλ和ASIP/PAR-3三元复合物的形成。使用抗-aPKCλ单克隆或抗-ASIP多克隆抗体分析如a中制备的抗-PAR-6（GW2AP）免疫沉淀物（IP）。PAR-6免疫沉淀物特异性包含内源性aPKCλ、全长ASIP及其剪接变体（底部带）。（c和d）酵母双杂交分析总结，以分析PAR-6–aPKCλ相互作用。通过在缺乏组氨酸的培养板上生长来检测相互作用。NH2-PAR-6的末端区域包括CR1和2足以与aPKCλ（c）相互作用，而NH2-aPKCλ的末端残基22–113足以与PAR-6（d）相互作用。
重要的是，Western blot分析进一步表明，aPCKλ以及ASIP/PAR-3与PAR-6特异性共免疫沉淀(b） ，增加了PAR-6与aPKC ASIP/PAR-3复合物相互作用的可能性。一致地，酵母双杂交分析显示c确认NH2-PAR-6末端125个氨基酸残基与aPKCλ相互作用。自从NH2-末端区域包括两个保守区域，CR1和CR2，我们试图进一步缩小它们相互作用所需的区域。然而，无论是氨基酸1-64（包括CR1但不包括CR2）还是氨基酸34-346（包括CR2而不包括CR1）都不会与aPKCλ相互作用(c） 表明NH2-包括CR1和CR2在内的125末端氨基酸序列形成了蛋白质-蛋白质相互作用所需的结构域（称为aPKCBD）。另一系列分析也表明NH2-aPKCλ的末端残基22–113足以与PAR-6相互作用(d） 。再一次，NH2-或该区域COOH末端缺失导致相互作用消失(d） ，表明该区域对应于aPKCλ的D1区域（多样区域1），形成蛋白质-蛋白质相互作用的另一个结构域。
aPKC作为链接器介导ASIP/PAR-3和PAR-6之间的相互作用
之前，我们证明aPKCλ通过其激酶结构域直接与ASIP/PAR-3结合。因此，上述结果增加了aPKCλ同时结合ASIP/PAR-3和PAR-6并介导aPKC-ASIP/PAR-3–PAR-6三元复合物形成的可能性。为了检验这种可能性，我们接下来在COS1细胞中进行了一系列免疫沉淀实验(). 如所示a、 当标记有Flag的PAR-6过度表达并用抗Flag抗体免疫沉淀时，共表达的T7-标记ASIP与内源性aPKCλ共同沉淀。值得注意的是，当T7标记的ASIPΔ30（对应于缺乏aPKC结合区的亚型）与标记的PAR-6而非野生型ASIP共存时，内源性aPKCλ而非该ASIP亚型与PAR-6共免疫沉淀，表明ASIP通过aPKC∧间接与PAR-6相关。事实上，一个T7标记的PAR-6突变体缺乏NH2-末端aPKCλ结合区（ΔaPKCBD）不仅与内源性aPKC∧相互作用，还与ASIP相互作用(b） 尽管另一个PAR-6突变体（ΔCRIB/PDZ）缺乏CRIB和PDZ结构域，但保留了aPKCλ结合区域，可以与这两种蛋白质相互作用。此外，c表明，aPKCλ的过度表达增强了T7标记的ASIP与标记的PAR-6的共沉淀。另一方面，不能与PAR-6结合的aPKCλΔN47的过度表达并没有显示出这种增强，而是抑制了ASIP/PAR-3与PAR-7的共沉淀。这可以解释为该aPKCλ突变对ASIP的显性负效应，通过内源性aPKC∧抑制ASIP与PAR-6的间接关联。总之，我们得出结论，aPKC作为PAR-6和ASIP之间的连接分子，并介导由aPKCλ、ASIP/PAR-3和PAR-6组成的三元蛋白复合物的形成(d） ●●●●。
PAR-6、aPKCλ和ASIP/PAR-3的三元络合物形成。（a–c）如图所示，用表达载体转染COS细胞（顶部）。细胞裂解物（Sup）经抗Flag（a和c）或抗T7（b）单克隆抗体处理后进行免疫沉淀（IP），并用抗aPKCλ（l）、抗T7、抗Flags或抗ASIP（C2-3AP）抗体分析共免疫沉淀蛋白。（a） Flag-PAR-6免疫沉淀物含有T7-ASIPwt，但不含缺乏与aPKC相互作用关键序列的T7-ASIPΔ30。（b） ASIPwt不包含在PAR-6ΔaPKCBD免疫沉淀物中，而是包含在PAR-6wt或ΔCRIB/PDZ免疫沉淀物质中。（c） 共表达aPKCλwt可增强T7-ASIP与Flag-PAR-6的共免疫沉淀，但aPKC∧ΔN47无PAR-6结合区序列。（d） PAR-6–aPKC-ASIP/PAR-3三元络合物示意图。PAR-6通过aPKCλ作为链接器与ASIP交互。
与ZO-1将PAR-6、aPKCλ和ASIP/PAR-3定殖为上皮连接复合体
为了评估上皮细胞中aPKCλ、ASIP/PAR-3和PAR-6之间物理相互作用的生理意义，我们接下来检查了MDCK细胞中PAR-6的细胞内定位。如所示a、 抗PAR-6抗体GW2AP清楚地染色融合的MDCK II细胞的细胞-细胞边界。由于另一种独立抗体GC2AP也获得了类似的结果(b） ，我们得出结论，这些连接染色代表了内源性PAR-6在MDCK II细胞中的真正定位。通过共焦z切片对内源性PAR-6的定位进行更仔细的检查，发现PAR-6染色位于ZO-1细胞-细胞接触区的最顶端(c） ●●●●。因为，正如之前所建议的(Izumi等人，1998年)，aPKCλ和ASIP/PAR-3也通过ZO-1定位到相应区域(c） 这些结果强烈表明，PAR-6与aPKCλ和ASIP/PAR-3共同定位于上皮细胞的顶端连接复合体。为了进一步阐明PAR-6在上皮细胞中的定位，我们接下来对小鼠肠上皮细胞进行染色，这是一种典型的含有极化上皮细胞的组织。与aPKCλ和ASIP/PAR-3类似，PAR-6也定位于与ZO-1结合复合体的最顶端(d） 。此外，与ASIP/PAR-3一样，PAR-6在aPKCλkn-表达细胞中的结合定位受到严重干扰，显示出与ZO-1的完全共定位(e） ●●●●。结合这三种蛋白质之间的物理相互作用，上述结果提供了证据，支持PAR-6、aPKCλ和ASIP/PAR-3作为三元蛋白复合物不对称地定位在极化上皮细胞的顶端连接复合体中的观点。
在上皮细胞的细胞-细胞接触区顶端用ZO-1对PAR-6、aPKCλ和ASIP/PAR-3进行克隆化。（a和b）用抗PAR-6多克隆抗体、GW2AP（a）和GC2AP（b）对MDCK细胞进行免疫荧光染色。IgG指用作阴性对照的等量正常兔IgG。在b组中，照片的灵敏度高于a组，以显示GC2AP的弱细胞染色。（c） 用抗PAR-6（GW2AP）、抗aPKCλ（λ1）或抗ASIP抗体（绿色）和抗ZO-1抗体（红色）双重染色的MDCK细胞的共焦z截面图。箭头表示基底膜的位置。所有三种蛋白都与ZO-1共定位到侧膜的顶端。（d） 用抗PAR-6（GW2AP）、抗aPKCλ或抗ASIP抗体（绿色）对小鼠肠上皮冰冻切片进行免疫染色。仅显示带有反ZO-1染色（红色）的合并视图。（e） aPKCλkn的过度表达影响PAR-6和ZO-1的连接定位。棒材，25μm（a、b、d和e）和10μm（c）。
讨论
aPKC激酶活性是建立连接结构和上皮细胞极性所必需的
使用PKC激活剂或抑制剂的药理学研究表明PKC参与了TJ的生物发生(花旗银行1992;Balda等人，1993年;Stuart和Nigam 1995年;Denker等人，1996年). 然而，一种细胞类型表达多种PKC同工酶，对活化剂或抑制剂的敏感性不同(Ogita等人，1991年;Mizuno等人，1995年). 事实上，MDCK II细胞至少表达cPKCα、nPKCε、η和aPKCλ、ζ（Shimizu，M.，未发表的结果）。因此，迄今为止使用这些药物获得的结果应反映出它们对MDCK细胞中几个PKC的影响之和，即使假定它们的靶点仅限于PKC。
在本文中，我们使用aPKC的显性负突变体来证明组装TJ需要aPKCλ或ζ。这一结论基于以下结果。（a） 表达aPKCλ或ζ（aPKCkn）显性负点突变体，但不表达野生型的细胞，即使在钙转换后20小时，ZO-1的连接定位也受到抑制。（b） 这种效应是aPKCs显性-阴性突变体所特有的，并且当使用nPKCδ和cPKCα的此类突变体时没有观察到（数据未显示）。（c） aPKCλkn的作用是通过以剂量依赖性的方式共同导入aPKC∧wt来挽救的，这表明aPKC的作用是基于其对内源性aPKC活性的显性抑制。（d） 不仅ZO-1的连接定位，而且所有测试的TJ组分都受到aPKCλkn的类似影响，这表明TJ结构本身的发育在aPKC∧kn表达细胞中受阻。（e） 通过TER和右旋糖酐的细胞旁扩散测定，aPKCλkn的过度表达会损害MDCK细胞在钙离子转换后屏障功能的恢复。需要注意的是，只有在TJ结构从头形成期间存在异位蛋白时，才能观察到aPKCλkn的这些作用。一般来说，激酶缺陷点突变体的显性-负面效应被认为是由于与内源性激酶竞争，以与正常功能所需的其他分子相互作用而产生的。目标分子可以是（a）激酶的特定底物，（b）活化剂，或（c）锚定伙伴，它们决定了激酶应该在哪里被生理和有效激活。在这个阶段，我们无法得出我们使用的aPKCkn突变体在细胞内以何种方式工作的结论。然而，目前的结果清楚地表明，在动态重建连接结构和上皮细胞极性的过程中，需要调节aPKC激酶活性。
结合以往的药理学研究，本文报道的aPKCkn的作用特征与PKC特异性抑制剂H7和钙磷蛋白的作用特征一致(Stuart和Nigam 1995年)：根据ZO-1分布和TER发育监测，两者均抑制TJ装配，但对MDCK细胞E-cadherin的基底外侧积聚影响较小。这两种药物都会影响TJ的形成，但不会影响其维持。这些巧合可能表明目前研究的PKC抑制剂的主要靶点是aPKC。事实上，体外测定了H7和钙磷蛋白对aPKCζ的抑制常数（ε-肽分别为90和1μM；Mizuno等人，1995年)，是cPKCα的四到五倍，这可能是为什么这些抑制剂对ZO-1分布的影响与aPKCkn的作用相比相当弱的原因(Stuart和Nigam 1995年据报道，培养基中25μM H7和500 nM钙磷蛋白可延缓但不完全阻断ZO-1结合环的形成）。然而，还应注意aPKC是对二酰甘油不敏感的非典型PKC(Akimoto等人，1994年). 这意味着我们的数据不能解释先前研究中的发现，即1,2-二辛酰甘油（一种二酰甘油类似物）即使在没有细胞外钙且没有AJ形成的情况下也能诱导TJ样结构(Balda等人，1993年). 一个可以解释上述所有结果的工作假设是，不仅aPKC，而且双酰甘油应答的PKC（传统和/或新型PKC）在调节TJ形成中发挥积极作用。我们现在正在努力验证这个假设。
aPKC调节连接结构形成的分子机制
aPKC参与TJ生物发生的分子基础尚不清楚。考虑到内源性aPKC以及ASIP/PAR-3，其具有三个PDZ结构域的特异性结合蛋白，定位于极化上皮细胞的TJ(Izumi等人，1998年)很容易推测，aPKC被ASIP/PAR-3招募到TJ中，从而发挥激酶活性促进TJ结构的发育。这种想法似乎与目前的观察结果不一致，即aPKCkn主要分布在胞浆中，而不是细胞-细胞边界(a） ；然而，这可能表明突变体通过竞争与胞浆中的ASIP/PAR-3或其他结合蛋白的结合，抑制内源性aPKC向细胞-细胞结合区的移位。我们没有直接证据表明aPKC的磷酸化是ASIP/PAR-3靶向TJ所必需的，但应该记住，aPKC和PAR-3的极化定位在秀丽线虫单细胞胚胎。
当然，aPKC主要作用的区域可能不是细胞-细胞连接，而是胞浆。事实上，细胞液中检测到大量内源性aPKC，尽管一些集中在上皮细胞的侧膜顶端(Dodane和Kachar，1996年). 此外，在细胞-细胞粘附中断后，定位于细胞-细胞连接处的aPKC以及ASIP/PAR-3重新分布到胞浆，这表明aPKC-ASIP/PAR-3复合物的动态性质(Izumi等人，1998年). 在这方面，有趣的是，有几篇报道表明aPKCs参与了囊泡运输的调节。例如，aPKC的显性-阴性突变特异性抑制胰岛素依赖性谷氨酸4向脂肪细胞质膜的移位(Kotani等人，1998年). 此外，aPKCs与p62/ZIP和Rab7在Hela细胞胞浆中的囊泡样结构上共定位，其显性-阴性突变严重损害EGF受体的胞内膜转运，而对转铁蛋白受体没有影响(Sanchez等人，1998年). 因此，另一个有趣的可能性是，aPKC调节蛋白质（包括结合蛋白）的极化膜靶向，以响应最初的细胞-细胞粘附。这可能解释了目前的结果，即即使在没有TJ的情况下，NKA和gp135的极化定位也可以在表达PKCλkn的MDCK细胞中保持。另一方面，我们不能排除aPKC的主要靶点可能不是TJ生物发生本身，而是由初始细胞-细胞附着触发的上游事件的可能性。事实上，我们观察到aPKCλkn-表达细胞也显示E-cadherin在细胞-细胞边界的积累减少，发育的F-actin外周束的形成缺陷仍保留应力纤维状结构(b） ●●●●。因此，aPKC可能调节膜下和/或细胞内细胞骨架的重组，这与包括TJ、带状AJ和桥粒在内的上皮特异性连接结构的不对称发育密切相关。这一观点可能与最近的报道一致，即aPKCλ和ζ参与了Ras介导的NIH3T3细胞F-actin细胞骨架的重组，或者aPKC∧和ξ在Cdc42下游工作，破坏NIH3T_3细胞的应激纤维(Uberall等人，1999年;Coghlan等人，2000年). 这种想法也可以解释在表达aPKCλkn的MDCK细胞中NKA和gp135定位错误的缺陷。为了解决这些问题，需要进一步研究以确定这种激酶的生理底物，其磷酸化状态和活性在上皮细胞极化过程中动态变化。
哺乳动物上皮细胞中的aPKC–PAR系统
在这里，我们提供的数据表明，aPKC显性-阴性突变的过度表达扰乱了上皮细胞沿顶基轴的表面极性(). 这些结果与我们之前的发现一致，即秀丽线虫缺乏aPKC的单细胞胚胎（PKC-3）在建立前-后极性方面存在缺陷(Izumi等人，1998年). 我们在此进一步证明，哺乳动物PAR-6同源物与aPKC和ASIP/PAR-3形成三元复合物，并积聚在上皮细胞-细胞连接的顶端。此外，正如秀丽线虫缺乏PKC-3表达的胚胎，ASIP/PAR-3和PAR-6的连接定位受到aPKCλkn过度表达的干扰。虽然我们在本文中没有成功地直接证明ASIP/PAR-3和PAR-6参与aPKC功能，但上述巧合越来越支持这样的假设，即aPKC-PAR系统不仅在细胞极化机制中起进化保守的作用秀丽线虫早期胚胎也存在于哺乳动物的上皮细胞中。重要的是，a果蝇属最近有人建议aPKC的同源物与Bazooka有关(果蝇属PAR-3的同源物）并控制上皮细胞和成神经细胞的极性(Wodarz等人，2000年). 本研究通过表明aPKC/PAR-3/PAR-6复合锚定物的极化连接结构的发展需要aPKC活性来进一步了解这一机制。这可能表明，一般来说，不对称膜/亚膜结构的建立是随后细胞极化的主要步骤。为了充分理解aPKC这种进化保守作用的分子基础，哺乳动物上皮细胞为未来的生化分析提供了一个有利的系统，为体外重建细胞极化过程提供了一种方便的方法。
