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分子生物学细胞。2005年2月；16(2): 433–445.
数字对象标识：10.1091/桶。E04-05-0435号
预防性维修识别码：PMC545874
PMID：15574881

β1-整合素通过Rac1和层粘连蛋白定向上皮极性D类⃞

魏瑜，* 阿尼尔班·达塔，* 帕斯卡尔·勒罗伊，* 露西·艾琳·奥布莱恩，* 格雷斯·麦克，† Zzuu-Shuh Jou（祖-舒-柔），‡ 卡尔·S·马特林，† 基思·莫斯托夫，*和米尔贾姆·M.P.泽格斯*§∥
让·施瓦茨鲍尔，监控编辑器
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摘要

上皮细胞对细胞-细胞和细胞-基质粘附的反应是极化和定向极性。尽管最近在理解上皮细胞的一般极化机制方面取得了很大进展，但在很大程度上尚不清楚细胞外环境是如何控制这种机制的。为了探索细胞-基质相互作用中控制细胞极性方向的信号，我们使用了三维培养系统，其中Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞形成极化的管腔结构。我们表明，极化MDCK单层胶原覆盖后，I型胶原与顶端β1-整合素的相互作用诱导Rac1活化，这是胶原覆盖诱导小管胞形成所必需的。囊肿由包围中央管腔的单层组成，在将单个细胞包埋在胶原蛋白中后形成。在这些培养物中，向胶原蛋白基质中添加β1-整合素功能阻断抗体会导致囊肿，这些囊肿在层粘连蛋白进入基底膜的组织中存在缺陷，并且极性反转。正常极性通过表达活化的Rac1或包含多余的层粘连蛋白-1（LN-1）而恢复。总之，我们的结果表明，β1-整合素的激活通过一种需要Rac1激活和层粘连蛋白组织进入基底膜的机制，引导极化囊肿的顶端。

简介

细胞极化是生物学中的一个基本过程。上皮细胞极化为顶端和基底外侧两极。最近，人们对上皮极化的机制有了很多了解。三种主要的极化复合物，Par3/Par6/非典型蛋白激酶C（aPKC）、Crumbs/PATJ/Stardust和Scribble/Discs大型/致命巨型幼虫复合物是由秀丽隐杆线虫和果蝇属对哺乳动物来说，是上皮极化所必需的(卢武铉和马戈利斯，2003年;马卡拉，2004年). 细胞极化还需要细胞之间的相互作用和细胞外基质（ECM），以及细胞骨架和膜交通的极化组织，尽管这些过程是如何与三种极化复合物联系在一起的还很模糊(织女星-阿拉斯等。, 1987;耶曼等。, 1999;奥布莱恩等。, 2002;莫斯托夫等。, 2003;纳尔逊，2003年;塞赫尔斯等。, 2003).

上皮组织的形成要求单个上皮细胞的极性方向在空间和时间上协调一致。在使用滤膜支架上生长的细胞进行的研究中，这一点没有得到充分的重视，因为滤膜提供了一个压倒一切的外部线索，使细胞的基底外侧表面朝向滤膜，而顶端表面则相反。基于早期观察结果(王等。，1990年)，我们发现上皮极性的产生可以与该极性的方向分离(奥布莱恩等。, 2001). Madin-Darby犬肾（MDCK）上皮细胞生长在三维（3D）胶原凝胶中，形成囊肿，极化单层细胞的顶面朝向中央管腔。重要的是，Rho家族GTPase的显性阴性突变体Rac1（N17Rac1）的表达会导致极性反转，因此顶部表面位于无腔囊肿的外围。这表明Rac1是极性取向途径的一个组成部分。更普遍地说，Rho-GTP酶控制调节细胞极性的各种过程，包括细胞骨架动力学、极化蛋白运输和细胞粘附(霍尔，1998年;艾蒂安·曼尼维尔和霍尔，2002年;Van Aelst和Symons，2002年).

极性的方向也需要上皮细胞与ECM的相互作用。这种相互作用通常涉及整合素、α和β亚单位的异二聚体。整合素介导的粘附提供控制细胞运动、增殖、存活、分化和基因表达的信号(Giancotti和Ruoslahti，1999年). 在MDCK细胞中，含有β1整合素的整合素在极性取向中的作用已被详细研究。在悬浮培养（即无外源性ECM）中，这些细胞形成中空囊，其中单层细胞的顶面朝外（即与上述胶原蛋白生长囊的顶面相反）(王等。，1990年b). 当这些囊肿放置在I型胶原凝胶中时，极性会因依赖β1整合素的机制而逆转(Ojakian和Schwimmer，1994年). 在类似的过程中，在用I型胶原覆盖过滤过生长的极化单层膜的顶部表面后，诱导了β1整合素依赖的心尖极重新定向(Schwimmer和Ojakian，1995年;Zuk和Matlin，1996年;奥贾基安语等。, 2001). 层粘连蛋白是一个由α、β和γ链组成的异源三聚蛋白家族。目前，已鉴定出15种不同的层粘连蛋白亚型（LN-1-LN-15）(Miner和Yurchenco，2004年). 虽然人们早已知道MDCK细胞从基底外侧表面分泌层粘连蛋白(卡普兰等。, 1987)，特定亚型仍需鉴定。正常情况下，生长在I型胶原凝胶中的MDCK细胞囊肿分泌的层粘连蛋白聚集成围绕囊肿的基底膜（BM）样网络(奥布莱恩等。, 2001). 在表达N17Rac1的MDCK细胞的囊肿中，层粘连蛋白没有正确组装到该BM中。然而，添加高浓度的外源性LN-1（可以自发组装）可以在很大程度上挽救N17Rac 1囊肿的反极性，产生几乎正常的囊肿，细胞的顶面朝向中央腔。

这里，我们表明β1整合素位于Rac1的上游，在一条控制极性方向的途径中。胶原蛋白I与β1整合素结合可激活Rac1。这反过来又使细胞的极性定向，这一过程也需要BM的层粘连蛋白依赖性组装。

材料和方法

抗体和试剂

功能阻断大鼠单克隆抗体AIIB2抗β1-整合素的腹水是Caroline Damsky（加利福尼亚大学旧金山分校牙科学院口腔科）赠送的。用纯化的大鼠IgG作为标准物，通过Western blotting测定小鼠腹水中大鼠Ig G的浓度。以亲和纯化的AIIB2为标准，通过分析对I型胶原和LN-1的粘附性，确认腹水中AIIB2抗体的功能。使用HiTrap蛋白G柱亲和纯化AIIB2（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。两种分析都表明腹水中AIIB2的浓度相似。本研究中使用的其他主要抗体包括：小鼠抗gp135抗体（来自SUNY-Downstate Medical Center解剖与细胞生物学系George Ojakian）、兔抗β-catenin抗体、小鼠抗Rac1抗体（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术）、小鼠抗-顺式-高尔基酶GM130（肯塔基州列克星敦BD转导实验室）、兔抗闭塞素（加利福尼亚州南旧金山Zymed实验室）、大鼠IgG（伊利诺伊州罗克福德Pierce Chemical）、大白鼠GoH3抗α6整合素、兔抗α3整合素和鼠抗胶原蛋白IV（加利福尼亚州特梅库拉Chemicon International）、，以及小鼠抗myc和小鼠抗β-微管蛋白（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）。针对LN-1（由α1、β1和γ1链组成）制备兔抗LN-1抗血清（Sigma-Aldrich）。使用的二级抗体是高度交叉吸收的抗小鼠Alexa Fluor 555和抗兔Alexa Fluor 488（分子探针，尤金，俄勒冈州）。肌动蛋白丝用Alexa Fluor 488或549指骨肽（分子探针）染色。核酸用DRAQ5（Biostatus，Leicester，United Kingdom）标记。我-[35S] 蛋氨酸蛋白标记混合物来自PerkinElmer Life and Analytical Sciences（马萨诸塞州波士顿）。

细胞培养

MDCK细胞保存在含有Earle平衡盐溶液（Cellgro，Washington DC）的最低必需培养基（MEM）中，该盐溶液补充了5%的胎牛血清和5%的CO中的抗生素295%空气。表达N17Rac1和V12Rac1的T23 MDCK细胞在四环素可抑制反式激活因子的控制下(Jou和Nelson，1998年)在含有20 ng/ml多西环素的培养基中保存。

对于胶原凝胶覆盖层，生长在24-mm Transwell（孔径0.4-μm）上的汇合细胞被生长介质中的I型胶原凝胶（66%卵黄蛋白，3mg/ml，凝聚力；加州帕洛阿尔托）覆盖，基本上如前所述(Zuk和Matlin，1996年)，在MEM中培养5d。

如前所述制备囊肿培养物(奥布莱恩等。, 2001;于等。, 2003). 简单地说，将细胞胰蛋白酶化为4×10的单细胞悬浮液4I型胶原凝胶中的细胞/ml。然后，将胶原蛋白溶液中的160μl细胞涂敷在Nunc过滤器（直径10 mm，孔径0.02-μm）上进行免疫染色，并将300μl涂敷在无细胞凝胶胶原蛋白层顶部进行生化实验。使胶原混合物在37°C下凝胶，然后加入培养基。细胞每3天喂养一次，并生长7-10天，直到形成带腔的囊肿。为了用AIIB2治疗囊肿，将抗体添加到胶原蛋白凝胶以及最终浓度为8μg/ml的培养基中。为了进行层粘连蛋白拯救实验，将LN-1（BD Biosciences，San Jose，CA）以最终浓度500μg/ml添加到I型胶原溶液中（I型胶原最终浓度为1.0 g/ml）。对于胶原IV拯救实验，将胶原IV（BD Biosciences）以0.15mg/ml的最终浓度添加到胶原I溶液中（胶原I的最终浓度为1.33g/ml）。为了诱导囊肿培养物中V12Rac1的表达，在不含多西环素的情况下，用2.5 mM丁酸钠隔夜刺激表达V12Rac 1的细胞。去除丁酸钠6小时后，细胞被镀在胶原蛋白中，并在没有强力霉素和丁酸钠的情况下生长。

免疫荧光染色

先前详细描述了胶原蛋白凝胶培养囊肿的免疫荧光染色程序(波拉克等。, 1998;奥布莱恩等。, 2001;于等。, 2003). 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）+（含镁的PBS）冲洗样品2+和钙2+)快速两次，37°C下用VII型胶原酶（Sigma-Aldrich）处理10分钟，并用3%多聚甲醛固定30分钟。细胞用0.25%Triton X-100在PBS中渗透10分钟，用50 mM NH淬火4Cl培养10分钟，用0.7%明胶在PBS/0.1%皂苷中封闭30分钟。然后将样品在4°C的一级抗体中培养过夜，然后用Alexa Fluor 532-或Alexa Fuor 488-共轭二级抗体（1:200）稀释液和Alexa Fluor 488卵磷脂（1:50）在4°C下培养过夜。样品用Prolong防褪色剂（分子探针）固定。为了染色层粘连蛋白和IV型胶原染色，在固定前用抗LN-1（1:100）或抗IV型胶原蛋白孵育囊肿4小时。

用PBS+冲洗覆盖胶原凝胶的细胞。然后，轻轻去除胶原蛋白凝胶，用3%多聚甲醛固定过滤器上的细胞20分钟，用50 mM NH淬火4Cl培养10分钟，用0.7%明胶在PBS/0.1%皂苷中封闭并渗透30分钟。样品与一级抗体在4°C培养过夜，然后与Alexa Fluor 532和Alexa Fuor 488-结合二级抗体（1:200）在37°C培养1小时。清洗后，样品在37°C下用1:1000稀释度的DRAQ5培养5分钟，并用氟氯烃（加州圣地亚哥Calbiochem）固定。

透射电子显微镜

用2%戊二醛和0.8%多聚甲醛固定在不含或含有AIIB2的胶原蛋白凝胶中生长的囊肿。前面详细描述了电子显微镜的程序(奥布莱恩等。, 2001). 用透射电子显微镜（Zeiss 10CA）检查超薄切片。

图像分析

为了量化囊肿的极性，对囊肿进行gp135、β-catenin和细胞核染色，并用Zeiss 510 LSM共焦显微镜进行分析。囊肿内表面gp135染色，β-catenin朝向周围ECM，被确定为极性正常的囊肿（内心尖极）。外周表面有gp135且外周没有β-连环蛋白的囊肿被认为是极性倒置的囊肿（外周顶端极）。每种情况下，分析300个囊肿。

免疫沉淀和Western印迹

如前所述，通过免疫沉淀或Western blot测定囊肿中的层粘连蛋白和整合素水平(奥布莱恩等。, 2001)进行了一些修改。为了测定β1和α3整合素水平和细胞相关层粘连蛋白，通过胶原酶处理从胶原蛋白中分离囊肿。为了检测细胞内层粘连蛋白水平，用胰蛋白酶处理分离的囊肿(奥布莱恩等。, 2001). 使用BCA分析（Pierce Chemical）对分离囊肿的裂解液进行蛋白质浓度标准化。通过免疫沉淀法测定培养基和溶解胶原蛋白凝胶中的层粘连蛋白。将样品中SDS的浓度调整为0.5%，并根据分离囊肿的蛋白质浓度对样品进行标准化。β-微管蛋白的Western blotting用作标准化溶解囊肿免疫沉淀和分离囊肿裂解液的裂解液的对照。

囊肿的代谢标记

在没有或存在AIIB2的情况下生长的囊肿在20小时内用100μCi的我-[35S] Met在无Met/Cys-free DMEM中，含10%正常生长培养基和10%胎牛血清。用PBS洗涤胶原中的囊肿，并如上所述通过使用抗LN1抗血清免疫沉淀囊肿相关和细胞内层粘连蛋白。免疫沉淀蛋白在6%SDS-PAGE凝胶上分离，放射性标记蛋白通过放射自显影术鉴定，如前所述(斯科恩伯格等。, 1994)

Rac1激活测定

在指定的时间段内，用胶原蛋白溶液覆盖过滤器上生长的融合MDCK细胞。将总体积为450-500μl的过滤器和胶原蛋白凝胶转移到含有500μl冰镇2×金溶解缓冲液（2%Triton X-100，40 mM Tris-HCl，pH 7.5，1000 mM NaCl，20 mM MgCl）的试管中230%甘油、1 mM二硫苏糖醇和无EDTA蛋白酶抑制剂；Roche Diagnostics，印第安纳波利斯），为了测定V12Rac1表达细胞中的GTP-Rac1水平，采集胶原蛋白和覆盖培养物，并在培养7-d后在2×GLB的等量中稀释。然后将样品在4°C下翻滚20分钟。该处理溶解了>95%的胶原蛋白凝胶。然后将样品在微型离心机中以15000 rpm离心5分钟，以去除剩余的胶原蛋白碎片和细胞碎片。从上清液中取出50μl样品，用于测定总裂解液中的Rac水平，如前所述，使用GST-Pak3-CRIB珠的下拉试验测定Rac1上的GTP负载(汉森等。, 2001). 总裂解物中β-微管蛋白水平的Western blotting作为负荷控制。

层粘连蛋白α链的RNA提取和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析

使用RNeasy Mini试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）从囊肿中提取RNA。用均质器在裂解缓冲液中均质囊肿，并在柱上提取RNA之前用200μg/ml蛋白激酶（QIAGEN）处理30分钟。DNase I处理直接在柱上进行。逆转录1μg总RNA，并按照前面所述进行相对RT-PCR(勒罗伊等。2004年). 以编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的表达为内标，测定cDNA的产量。从1μl cDNA开始，检测GAPDH需要20个以上的周期，并且调整每个cDNA的体积，以在23个周期后，即在其指数扩增范围内，为GAPDH提供相同的PCR信号强度。测试层粘连蛋白α5链的指数放大范围，并对层粘连素α5和GAPDH分别进行38个周期和23个周期的实验。内标物和层粘连蛋白α链在同一试管中扩增(米杜斯，2003年)当层粘连蛋白链扩增剩余23个周期时，添加GAPDH引物。引物如下：层粘连蛋白α5链正向：5′TGGGCAGATATGGGACCTC 3′，反向：5′tgCTGAGCAGCCACTGAAG 3′；对于GAPDH，正向：5′CAGTTGTGGATCTGACCTGC 3′，反向：5′CCTTGGGAGGCCATGTAGACC 3′。在55°C下对层粘连蛋白α5进行退火，并在2%琼脂糖凝胶上观察预期片段（层粘连素α5为500碱基对，GAPDH为271碱基对）。

结果

胶原覆盖物激活β1-整合素诱导Rac1激活

将I型胶原凝胶覆盖层应用于MDCK细胞极化单层的顶端区域，会导致细胞组织及其极性方向发生显著变化。具体地说，心尖区被重新定位，远离新的ECM细胞接触部位，形成多层极化的管腔结构或管腔(Schwimmer和Ojakian，1995年;Zuk和Matlin，1996年; 比较中的控制单分子膜图1AC）中的胶原蛋白覆盖层。因此，这为研究I型胶原蛋白如何参与上皮细胞的定向和组织提供了一个简单的系统，可以将其视为滤膜上单层生长细胞和厚胶原蛋白凝胶中囊肿生长细胞之间复杂性和生理相关性的中间物。虽然在没有覆盖层的情况下不影响单层(图1B)β1整合素功能阻断抗体AIIB2，但不是非特异性对照抗体(图1，E和F)，当添加到I型胶原中时，抑制I型胶原诱导的小管细胞形成(图1D, (Schwimmer和Ojakian，1995年;Zuk和Matlin，1996年).

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β1整合素介导的Rac1激活是胶原覆盖层上小管细胞形成所必需的。（A-F）垂直截面gp135（红色）和β-catenin（绿色）的共焦图像显示，在指定条件下，在Transwell过滤器上生长的MDCK细胞。（A） 在没有AIIB2和胶原凝胶的情况下，合流的MDCK具有极化单层形态。（B） 用8μg/ml AIIB2处理5d不会改变单层表型。（C） MDCK细胞用I型胶原凝胶覆盖在顶端表面5天，可诱导小管细胞的形成。（D） 在胶原蛋白中添加AIIB2可抑制小管细胞的形成，以应对顶端胶原覆盖。（E和F）对照组大鼠IgG和小鼠腹水9E10对胶原覆盖物的反应不抑制小管细胞的形成。箭头表示流明。（G） 通过GST-CRIB-PAK下拉分析评估在无AIIB2（白柱）或有AIIB2的情况下胶原覆盖物激活Rac1的时间进程。极化MDCK单层的顶部表面在指定的时间段内覆盖胶原蛋白。结果被归一化为0分钟车道上的GTP-Rac1水平。该图表示五个独立实验±SD。*p<0.03，**p<0.01，相对于无覆盖（0分钟）。（H） Rac1激活的代表性蛋白质印迹图1Gβ-微管蛋白起负荷控制作用。棒材，10μm。

Rac1调节胶原蛋白中生长的MDCK囊肿的顶端极性取向(奥布莱恩等。, 2001)并通过乳腺上皮细胞3D培养中的整合素激活(查希尔等。, 2003). 为了确定Rac1是否在调节小管细胞形成的β1整合素下游途径中发挥作用，我们检查了I型胶原覆盖层是否激活Rac1。我们使用Cdc42/Rac相互作用结合（CRIB）-结构域下拉分析法分析Rac1 GTP水平(价格等。, 1998). 在本实验中，与在厚胶原蛋白凝胶中生长囊肿相比，胶原蛋白覆盖方法具有优势，因为覆盖技术使I型胶原蛋白与大量极化细胞同步相互作用，诱导细胞极性同步重塑，并允许快速分离细胞以测量Rac1-GTP水平。胶原蛋白覆盖15分钟后，GTP-Rac1水平增加了三倍，这是覆盖后我们能够分析的最早时间点(图1、G和H). Rac1的激活是暂时的，叠加后6小时，GTP-Rac1水平下降至控制水平。相反，当细胞被AIIB2抗体覆盖时，未观察到Rac1激活。相反，我们发现，在覆盖后30和60分钟，AIIB2治疗导致GTP-Rac1水平与基线水平在统计学上没有区别（并且略低于基线水平）。因此，这些结果表明，顶部胶原覆盖物通过激活β1整合素激活Rac1。

小管囊肿形成需要Rac1激活

接下来我们研究了GTP-Rac1的增加是否是肾小管细胞形成所必需的。我们使用的MDCK细胞在四环素可抑制启动子系统的控制下表达显性阴性（N17Rac1）或活化（V12Rac1(Jou和Nelson，1998年). 在该系统中，通过向培养基中添加20 ng/ml多西环素（Dox）抑制异位基因表达。对照实验表明，当未诱导（+Dox）时，胶原I覆盖导致15分钟后GTP-Rac1水平升高，类似于未转染的对照（比较图2A，+Dox，收件人图1H). 正如预期的那样，在N17Rac1表达细胞中未观察到GTP-Rac1，无论有无胶原覆盖，而V12Rac1表示细胞中的GTP-Rac1水平始终较高，但不受胶原覆盖的影响(图2A，-Dox）。

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Rac1激活是小管胞形成所必需的。（A） 在四环素可抑制反式激活因子的控制下，表达myc标记的N17Rac1和V12Rac1的细胞内生和突变Rac1蛋白水平和Rac1激活。在没有或存在Dox的情况下，在过滤器上生长的MDCK单层用胶原蛋白凝胶覆盖指定时间。Western blot显示Rac1总表达。突变体Rac1表达细胞（-Dox）总裂解液中的双谱带显示内源性（顶谱带）和myc标记突变体Rac 1（底谱带）的表达。活化Rac1（GTP-Rac1）通过GST-CRIB-PAK下拉试验测定。在表达N17Rac1的细胞中未检测到GTP-Rac1，但在V12Rac1细胞中含量较高。β-管蛋白用作负荷对照。（B） gp135（红色）和β-catenin（绿色）单分子膜染色的垂直切片显示，表达Rac1的突变细胞生长有或没有胶原覆盖层和AIIB2，如图所示。在没有胶原覆盖层（2B-1和2B-2）的情况下，非诱导和诱导的N17Rac1细胞仍然是极化单层。未诱导的N17Rac1细胞发育为正常的小管细胞（2B-3），而表达N17Rac1的细胞不形成小管细胞。未诱导的V12Rac1和诱导的V12 Rac1细胞在没有胶原覆盖层（2B-5和2B-6）的情况下都具有极化的单层表型，在有胶原覆盖层的情况下形成管状细胞（2B-7和2B-8）。当AIIB2存在于胶原覆盖层中时，未诱导的V12Rac1细胞（2B-9）中的小管细胞形成被阻断，而表达V12Rac 1（2B-10）的细胞中的小管细胞形成则被阻断。箭头表示流明。棒材，10μm。

在没有覆盖层的情况下，单层不受N17Rac1表达的影响(图2B，比较2B-1中的非表达细胞和2B-2中的N17Rac1表达细胞）。然而，与非诱导的N17Rac1对照细胞（2B-3）不同，后者形成了成熟的小管细胞，表达N17Rac 1的细胞并没有在胶原覆盖层（2B-4）上形成小管细胞。相反，它们保留了极化表型，并与AIIB2覆盖的单层相似（比较图2B-4具有图1D). 表达激活的V12Rac1突变体（2B-6）而非非诱导对照（2B-5）的细胞在没有覆盖层的情况下形成稍不规则和部分扁平的单层，但它们本身没有形成小管细胞。在I型胶原覆盖层上，表达V12Rac1的细胞形成类似于非诱导细胞的小管细胞（与2B-8和2B-7相比），尽管与非诱导细胞相比，小管细胞的形成通常更快（我们未公布的数据）。此外，与非诱导细胞（2B-9）相比，V12Rac1的表达挽救了AIIB2诱导的小管细胞形成障碍（2B-10）。总之，这些数据表明，我们在胶原覆盖层上观察到的Rac1激活是激活的β1整合素的下游，是小管细胞形成所必需的。然而，由于V12Rac1在没有胶原覆盖层（2B-6）的情况下不会诱导小管细胞的形成，因此Rac1的激活不足以在单层培养中产生这种形态反应。这可能表明β1整合素激活的其他信号也需要用于小管胞的形成。或者，胶原蛋白可以作为附着和细胞运动和/或自分泌信号分子（如层粘连蛋白）沉积所需的机械支撑。

β1整合素通过Rac1调节MDCK囊肿的极性取向

嵌入I型胶原基质中的单个MDCK细胞形成囊肿，其顶端极朝向中心管腔，基底外侧极朝向基质。N17Rac1的表达导致这些囊肿的顶端极性反转(奥布莱恩等。, 2001). 因为数据表明，在小管囊肿形成过程中，心尖极的重新定向需要β1整合素向Rac1发出信号，所以我们询问是否相同的通路控制MDCK囊肿中心尖极从头形成。为此，我们在8μg/ml AIIB2抗体存在下培养囊肿7-10天(图3 B、B′、D、F、F′和H)与我们之前在表达N17Rac1的囊肿中观察到的结果惊人相似(奥布莱恩等。, 2001). 免疫荧光染色分析显示，在AIIB2治疗后，通常朝向囊肿腔的顶膜蛋白（gp135）、紧密连接标记物（occludin）和高尔基体标记物（GM130）的标记物朝向胶原基质（比较图3A、C、E和E′具有3B、D、F和F′). 电子显微镜图像与这些结果一致，并显示类似细胞间连接复合体的结构在对照细胞的管腔附近(图3G，箭头），而在AIIB2治疗的囊肿中，它们定位于面对胶原的细胞-细胞接触处(图3H，箭头）。用顶端gp135和基底外侧β-连环蛋白对囊肿进行共染，结果表明AIIB2处理的囊肿内细胞极性反转，而非随机分布；在两个控件中(图3，A和A′)和AIIB2治疗的囊肿(图3，B和B′)顶端抗原和基底外侧抗原的定位相互排斥。后者的发现与表达N17Rac1的细胞形成对比，N17Rac具有倒置的顶端极性，但在所有细胞表面都发现了基底外侧标记物，包括β-catenin（我们未发表的数据）(奥布莱恩等。, 2001). 一种可能的解释是，除了激活Rac1外，β1整合素与胶原蛋白的结合也可能激活调节上皮形态发生的其他信号成分。最后，AIIB2囊肿充满了内腔，表明细胞增殖和/或凋亡发生了变化（我们的未公开数据）；这将是未来调查的主题。

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β1整合素的抑制可在膀胱形成过程中逆转根尖极性，并降低α3整合素表达。（A-F）在没有（A，A′，C，E和E′）或存在（B，B′，D，F和F′）8μg/ml AIIB2的情况下生长的囊肿，用红色标记根尖（gp135，高尔基和闭塞素），基底外侧膜标记物β-连环蛋白（A′和B′）或肌动蛋白（C，D，E′和F′）为绿色，细胞核为蓝色。紧密连接标记物闭塞素在E′和F′中被染成红色，在E和F中仅为清晰显示。在未经治疗的囊肿中，顶端标记物gp135（A）、高尔基体标记物GM130（C）和闭塞素（E和E′）定位于腔内表面或朝向腔内表面，而基底外侧膜标记物β-连环素（A′）染色仅限于细胞间接触和外周表面，不包括在管腔表面（A和A′代表同一囊肿）。此外，管腔周围（C和E′）观察到强烈的肌动蛋白染色。这些染色模式表明存在正常极化。相反，AIIB2治疗的囊肿的极性相反，如gp135的外周染色（B）、外周表面β-连环蛋白的排除（B′）、外周表面下高尔基体的定向（D）和咬合素的外周染色（F和F′）所示。箭头显示，在AIIB2治疗的囊肿（B和B′）中，gp135发生在外周表面，β-catenin从这些区域消失。箭头指向连接复合体，在对照囊肿（E和E′）中，连接复合体朝向内腔，在AIIB2治疗的囊肿（F和F′）中则朝向外围。（G和H）囊肿的电子显微照片。在没有AIIB2的情况下生长的囊肿中，细胞与细胞接触处的紧密连接（箭头）靠近内腔，微绒毛（箭头）朝向内腔。在AIIB2存在的情况下，连接面朝向胶原蛋白。（一） 添加大鼠IgG作为对照抗体并不影响膀胱生成。（J） 大鼠抗整合素α6抗体治疗不会改变囊肿的表型。（K） Western blot分析表明，在AIIB2治疗的囊肿中，β1整合素水平没有改变（双链底部带代表β1整合素的前体形式），但α3整合素降低。β-管蛋白水平用作负荷控制。棒材，10μm（A-F、I和J）和2μm（G和H）。

AIIB2治疗诱导的囊肿表型对β1整合素的抑制具有特异性。对照实验表明，两组大鼠均未出现IgG1(图3I)在6-60μg/ml的浓度范围内，作为腹水添加的非反应性抗体（我们未发表的数据）也不会影响囊肿的形态。此外，抑制I型胶原粘附所需的AIIB2浓度与诱导囊肿表型的能力密切相关。具体而言，在标准粘附试验中，添加8μg/ml AIIB2导致对I型胶原粘附的抑制率达到95%（我们的未公开数据）(舍恩伯格等。, 1994)并导致囊肿培养，其中90%以上的囊肿具有倒置表型(图5D). 更高浓度的AIIB2（高达80μg/ml）产生了类似的结果。另一方面，添加1μg/ml AIIB2导致35%的粘附抑制，并在约50%的囊肿中诱导表型（我们的未发表数据）。

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外源性LN-1拯救正常的囊肿表型。（A-C）在AIIB2存在下生长的囊肿具有反极性（A）。在AIIB2治疗的囊肿中添加外源性LN-1（B），但不添加IV型胶原（C），可使顶极回复到腔表面，并诱导腔的形成。共聚焦图像显示7天龄AIIB2治疗的囊肿，在LN-1或IV型胶原存在的情况下，用顶端蛋白标记物gp135（红色）、基底侧蛋白、β-连环蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）染色。A和C中的箭头表示囊肿周边存在顶端gp135。（D） 对未经治疗的囊肿、AIIB2治疗的囊肿和AIIB2处理的带有外源性LN-1的囊肿的囊肿表型进行定量分析表明，在存在外源性LN-1的情况下，具有内极的囊肿比例随着时间的推移逐渐增加。棒材，10μm（A-C）。

MDCK细胞表达α2β1、α3β1和α6β4整合素异二聚体(斯科恩伯格等。, 1994). 含有β1的整合素，而不是α6β4，作为I、IV和LN-1胶原的受体(斯科恩伯格等。, 1994). 由于α6整合素功能阻断抗体GoH3抑制对MDCK细胞分泌的ECM的粘附（我们的未公开数据），α6β4可能与MDCK内源性ECM的另一个目前尚未确定的成分相互作用。我们发现用GoH3抑制α6β4整合素不会影响囊肿的表型(图3J)与我们的发现一致，AIIB2诱导的表型具体取决于含β1整合素的抑制。

接下来，我们试图确定哪种含β1的整合素与AIIB2诱导的表型有关。我们可获得的已知功能抑制抗α2和抗α3整合素抗体均未抑制MDCK细胞与I型胶原的粘附（我们的未发表数据）。因此，我们无法测试这些α整合素亚基对囊肿培养的抑制作用。然而，AIIB2治疗的囊肿的Western blot分析表明，β1整合素水平与未治疗的对照组相比没有变化，但α3整合素的水平下降了80%(图3K). 因为在MDCK细胞中发现β1整合素水平过高(斯科恩伯格等。, 1994)这些数据表明α3β1整合素在正常囊肿形态发生中可能起作用。

β1整合素的抑制对层粘连蛋白组织的影响

MDCK囊肿中的细胞分泌层粘连蛋白并将其组装成围绕囊肿周围的BM样网络。MDCK产生的类BM网络可能不像体内大多数上皮细胞下面的基底膜那样发育完整，但如下文所述，它包含层粘连蛋白和IV型胶原组成网络，在本文中，我们将其简单称为BM。我们最近报道，表达N17Rac1的囊肿不能正确地将层粘连蛋白组装到BM中。然而，当与过量LN-1培养时，LN-1通过β1和γ1链的相互作用自发自组装(Yurcenco和Cheng，1993年)这些细胞形成含有管腔的囊肿，顶端区域朝向这些管腔。这些数据表明Rac1通过层粘连蛋白控制顶端方向(奥布莱恩等。, 2001).

我们的数据表明，AIIB2诱导的表型是由细胞无法通过β1整合素激活Rac1介导的，因此我们检查了这些细胞的极性反转是否也是由于层粘连蛋白组织进入BM所致。我们通过用针对LN-1产生的多克隆抗体对囊肿进行染色来分析层粘连蛋白沉积。LN-1由α1、β1和γ1链组成。我们发现，我们使用的兔抗层粘连蛋白抗血清识别MDCK细胞的β1和γ1，但不识别α1链(奥布莱恩等。, 2001). 我们用层粘连蛋白染色囊肿，方法是将层粘连蛋白抗血清加入活囊肿中，然后固定并用第二抗体染色。该程序仅显示细胞外层粘连蛋白。如所示图4A未经治疗的囊肿中，层粘连蛋白在细胞-ECM间期的细胞外周呈细点状分布。在多个共焦切片的投影中，可以看到层粘连蛋白在囊肿周围形成一个精细的网络(图4A′). 我们将此作为正常MDCK囊肿组织层粘连蛋白在囊肿周围形成BM样网络的证据。相比之下，当囊肿在AIIB2的存在下生长时，囊肿周围的层粘连蛋白染色明显改变且非常不规则(图4B). 我们认为这表明层粘连蛋白组装或组织成类BM网络与正常情况有很大不同。异常层粘连蛋白组织在投影图像中尤为明显(图4，A′和B′)这是通过投影跨越整个囊肿的连续共焦切片创建的（补充图1）。对单个共焦切片的仔细分析表明，在AIIB2治疗的囊肿中，一些层粘连蛋白似乎位于囊肿内部，位于单个细胞之间。由于我们的染色程序只染色了可从囊肿外部获得的层粘连蛋白，所以我们为什么检测到这种层粘连蛋白质尚不清楚，因为紧密连接位于这些囊肿的囊肿外围。然而，初步数据表明，AIIB2治疗的囊肿紧密连接处具有异常结构（我们未发表的数据），这可能解释为什么层粘连蛋白抗血清可以进入囊肿内部。骨髓的另一主要成分IV型胶原的染色模式与层粘连蛋白的染色模式非常相似。因此，在未经治疗的囊肿中，我们发现IV型胶原在细胞基底侧的囊肿周围形成一个规则的BM样网络(图4，C和C′)而在AIIB2治疗的囊肿中（图D和D′），它类似于我们也观察到的层粘连蛋白的不规则染色。总之，这些数据表明，β1整合素的抑制改变了MDCK囊肿周围BM的组织。

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AIIB2治疗的囊肿具有层粘连蛋白和IV型胶原的无序沉积。（A-H）层粘连蛋白（A和B中的红色）、IV型胶原（C和D中的红色）、肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）的免疫荧光染色揭示了未治疗囊肿（A和C）外周表面层粘连蛋白和IV型胶原的精细网络，但AIIB2处理的囊肿（B和D）中有大量聚集物。连续共焦切片的投影更清楚地显示了未经治疗（A′，层粘连蛋白和C′，IV型胶原）和AIIB2治疗的囊肿（B′，层粘蛋白和D′，IV号胶原）之间的差异。（E） 免疫沉淀层粘连蛋白的免疫印迹显示，未经治疗的囊肿和AIIB2治疗的囊肿在分泌层粘连素（培养基）、总合成层粘连肽（可溶性凝胶）、细胞相关层粘连蛋白质（孤立囊肿）和细胞内层粘连质（孤立囊肿和胰蛋白酶治疗囊肿）方面没有差异。β1/γ1带在～200kDa迁移。（F） RT-PCR分析表明，AIIB2治疗不会显著影响层粘连蛋白α5链的表达水平。RT是无逆转录酶的对照。（G） 未经治疗或AIIB2治疗的囊肿被代谢标记为我-[35S] 蛋氨酸。显微照片显示从分离的囊肿中免疫沉淀的层粘连蛋白的放射自显影，代表细胞内和细胞相关的细胞外层粘连素，以及从用胰蛋白酶处理以消化细胞外层黏连蛋白的分离的囊肿（细胞内）。除了β1/γ1链～200 kDa外，免疫沉淀了一个～400-kDa蛋白，这可能是一个来自含β1/β1的层粘连蛋白异源三聚体的共免疫沉淀层粘连素α链。注意，AIIB2不影响任何层粘连蛋白链的水平或α链和β1/γ1链之间的比率。棒材（A-D′），10μm。

我们分析了AIIB2诱导的BM沉积缺陷是否是由于层粘连蛋白合成或分泌的变化引起的。为此，我们通过免疫沉淀和Western blotting测定分泌和细胞内β1/γ1层粘连蛋白的水平(奥布莱恩等。, 2001). 在以下池中分析层粘连蛋白水平：1）培养基，代表分泌的层粘连素；2） 含有胶原囊肿的胶原凝胶，其与池1一起代表合成的总层粘连蛋白；3） 囊肿，从胶原酶处理后的胶原蛋白凝胶中分离出来，代表具有相关BM的囊肿，并含有细胞外和细胞内细胞相关层粘连蛋白；和4）细胞内层粘连蛋白，来自用胰蛋白酶处理以消化细胞外BM的孤立囊肿。如图4E，AIIB2治疗不会影响这些池中的β1/γ1层粘连蛋白水平。

先前的研究表明，LN-1异源三聚体的分泌可以由α1-链调节，α1-链可以独立于β1/γ1链分泌(尤尔琴科等。, 1997). 此外，β1整合素缺乏的小鼠胚胎体不分泌LN-1，因为这些细胞中层粘连蛋白α1链的合成被阻断(奥梅利等。, 2000). 因此，我们试图研究AIIB2如何影响层粘连蛋白α链的合成和分泌。因为我们无法通过Western blotting检测到层粘连蛋白α链，所以我们通过RT-PCR分析确定AIIB2处理对层粘连蛋白质α链转录的影响。我们检测到层粘连蛋白α3（我们未发表的数据）和α5链的稳健表达，发现两者均不受AIIB2的影响(图4F; 我们未发布的数据）。然而，我们没有检测到层粘连蛋白α1链（我们未发表的数据），这表明LN-1在MDCK中明显不表达。层粘连蛋白α3链存在于LN-5（α3β2γ2）、LN-6（α3α1γ1）和LN-7（α5β2γ1）中。虽然LN-5存在于肾脏中，但我们不太可能用抗LN-1抗血清检测到这种层粘连蛋白形式，因为LN-1与LN-5没有任何链。相反，由α5β1γ1链组成的LN-10是肾脏中表达最丰富的层粘连蛋白，与LN-1共享β1和γ1层粘连素(Miner，1999年). 因此，我们用多克隆抗LN-1抗血清检测到的β1和γ1层粘连蛋白链很可能实际上来自LN-10。事实上，当我们将代谢标记为[35S] 蛋氨酸，我们提取了α5层粘连蛋白链预测大小的蛋白质（～400kDa）(同上等。2004年; (图4G). 这表明，用抗层粘连蛋白抗血清进行免疫沉淀可以拉下整个LN-10异源三聚体，尽管我们不能排除它是不同层粘连素的可能性。正如我们发现的那样，对于β1γ1链，AIIB2处理既不影响具有相关BM的分离囊肿中的α链水平，也不影响胰蛋白酶消化囊肿的细胞内水平（分别为上述池3和4）。

总之，我们的数据表明，我们观察到的BM形成的改变并不是由于AIIB2介导的层粘连蛋白合成或分泌本身的改变(图4，E-G).

外源性LN-1部分挽救正常囊肿表型

当镀在补充有LN-1的I型胶原基质中时，LN-1能够自我组装(Yurcenco和Cheng，1993年)AIIB2处理的MDCK细胞的倒置顶端极性被显著挽救。而AIIB2治疗的囊肿没有或只有很小的腔(图5A)在这些培养物中添加LN-1导致形成多个管腔(图5B). 引人注目的是，根尖标记物（gp135）现在局限于这些管腔内，并且大部分在囊肿的外围没有发现(图5B). 紧密连接标记物闭塞素染色证实外源性LN-1在AIIB2囊肿中拯救了正常极性（我们的未发表数据）。这与我们报告的在补充LN-1的I型胶原中生长N17Rac1囊肿时极性取向的修复非常相似(奥布莱恩等。, 2001). AIIB2治疗还导致IV型胶原沉积受到干扰(图4，D和D′)，但添加外源性IV型胶原并没有挽救表型(图5C). 这一发现与IV型胶原与BM的整合是次要事件并取决于层粘连蛋白的初始沉积这一概念相一致(锂等。, 2003).

外源性LN-1对倒置顶端极性的挽救作用随着时间的推移而增加。在5天的旧培养物中，LN-1的存在仅略微增加了AIIB2治疗的具有内心尖极的囊肿的数量（在含有LN-1基质中为25%，而在没有LN-1时为20%）。然而，在9天龄培养物中，添加LN-1导致培养物中80%的囊肿具有内部根尖极性，而9天龄对照培养物中只有20%没有LN-1(图5D). 我们测试了依赖时间的救援是否是由于AIIB2的周转。当我们仅在培养基中加入AIIB2培养囊肿，并每隔一天用新的含AIIB2的培养基重新培养囊肿时，我们发现与根据我们的原始方案（我们未公布的数据）培养的囊肿相比，无论是观察到的表型还是外源性LN-1能够挽救表型的程度，都没有差异。此外，当在80μg/ml AIIB2（而不是8μg/ml）的存在下生长时，外源性LN-1的表型拯救程度和时间进程没有改变（我们未公布的数据）。这些结果表明，随着时间的推移，救援的增加并不是由于AIIB2在这些实验条件下的不稳定性，而是与作为极化关键方面的BM层粘连蛋白依赖性组装相一致。

激活的Rac1拯救骨髓组织和囊肿极性

我们的发现是Rac1是β1整合素介导的小管细胞形成所必需的(图2)以及我们之前的工作，证明了Rac1在层粘连蛋白组织转化为BM和极性发育中的作用(奥布莱恩等。, 2001)表明β1整合素到Rac1信号通路调节BM的形成和随后的极性取向。为了进一步验证这一假设，我们测试了激活的V12Rac1能否拯救AIIB2治疗的囊肿中的反转极性。如所示图2，A和B-10在没有Dox的情况下生长的细胞中，V12Rac1的表达水平足以完全挽救AIIB2诱导的胶原覆盖上小管胞形成的阻滞。然而，当我们从表达V12Rac1的细胞中培养囊肿时，在7天的培养基中，V12Rac 1的表达降低到背景水平以下。在MDCK细胞中的多种转染基因中，在囊肿培养过程中观察到四环素可抑制系统的类似表达缺失（我们的未发表数据）。因此，在将细胞镀成胶原蛋白之前，我们通过在没有Dox的情况下用2.5 mM丁酸钠处理单层细胞过夜来刺激V12Rac1的表达(裘（Jou）等。, 1998). 去除丁酸钠六小时后，将细胞胰酶化，并在没有Dox的情况下悬浮在胶原蛋白中。然后像往常一样将囊肿生长7天。在胶原蛋白中电镀之前用丁酸盐隔夜处理，在7天龄的囊肿中产生的表达水平与我们在重叠分析中获得的表达水平相当(图6A). 此外，尽管GTP-Rac1水平低于非诱导性囊肿（+Dox）的检测水平，但在表达V12Rac1突变的囊肿中发现了高水平的GTP-Rac 1(图6A). 对照实验表明，在未转染的MDCK细胞中，短暂的丁酸钠处理不会干扰囊肿中极性的建立，也不会干扰AIIB2处理后极性的反转（我们的未发表数据）。

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在AIIB2存在的情况下，组成活性Rac1的表达诱导内心尖极的建立。（A） 内源性和外源性Rac1和GTP-Rac1在MDCK囊肿中的表达，该囊肿在四环素可抑制反式激活物的控制下表达V12Rac1。在Dox存在或不存在的情况下生长的囊肿培养7天，并按照材料和方法通过抗Rac1和抗myc抗体检测内源性Rac1水平和myc标记的V12Rac1突变。β-管蛋白染色作为负荷对照。请注意，Rac-GTP水平在非诱导对照组（+Dox）低于背景水平，在V12Rac1表达的囊肿（-Dox）中较高。（B-E）层粘连蛋白染色的表达V12Rac1的囊肿的多个共焦图像的投影。未经诱导的V12Rac1细胞在未经治疗的囊肿（B）中有均匀的层粘连蛋白沉积，在AIIB2（C）的存在下生长时有不规则的层粘着蛋白沉积。在未经治疗（D）和AIIB2治疗（E）的培养物中，表达V12Rac1的囊肿具有均匀的层粘连蛋白分布。（F） V12Rac1囊肿表型的定量，如材料和方法表明99%的非诱导或表达V12Rac1的囊肿具有正常的极性。在AIIB2存在的情况下，只有30%的非诱导性囊肿具有正常极性，而V12Rac1的表达拯救了正常极性并将具有内心尖极的囊肿的百分比增加到总人口的85%。图表表示三个独立实验的平均值±SD。在每个实验中，分析每个条件下200个囊肿。（G-J）F的典型共焦图像。gp135（红色）、β-catenin（绿色）和细胞核（蓝色）染色显示，V12Rac1细胞形成极性正常的囊肿（G），AIIB2治疗的囊肿具有外周心尖极（H），如图3在不存在AIIB2的情况下，表达V12Rac1的细胞在管腔表面形成具有gp135的正常囊肿（I）。在AIIB2存在的情况下，表达V12Rac1的细胞仍然会形成具有内心尖极（J）的囊肿，尽管腔不像未经治疗的囊肿那样牢固。棒材，10μm。

当在胶原中培养时，表达V12Rac1的MDCK细胞中的层粘连蛋白染色在囊肿周围看起来像一个均匀的网状物(图6、B和D)和正常极性形成的囊肿(图6、G和I)，带有（-Dox）和不带（+Dox）V12Rac1表达式。这与Dox（即V12Rac1不表达）和AIIB2存在时生长的对照组形成对比，后者层粘连蛋白分布不规则(图6C)只有35%的囊肿极性正常(图6、F和H). 引人注目的是，在AIIB2治疗的囊肿中V12Rac1的表达导致层粘连蛋白染色模式的完全恢复（与非诱导细胞相比图6C至诱导细胞图6E). 此外，当在AIIB2的存在下生长时，V12Rac1的表达在很大程度上挽救了AIIB2诱导的倒置极性，并导致培养中80%的囊肿具有内腔、内顶极和正确定向的基底外侧表面，尽管一些细胞通常位于内腔内(图6，F和J). 这为β1整合素介导的Rac1激活调节层粘连蛋白启动的BM组装的信号通路提供了额外的证据，而层粘连素启动的组装又在上皮形态发生过程中定向极性。

讨论

我们使用三维培养系统分析了β1整合素如何调节上皮细胞极性的方向。我们的数据与一个模型一致，在该模型中，I型胶原、β1整合素、Rac1活化和BM的层粘连蛋白依赖性组织位于一个相互的自分泌途径中，该自分泌途径在培养中定向MDCK细胞的极性。胶原蛋白I通过β1整合素激活Rac1，至少在覆盖系统中可以最直接地进行评估。β1整合素或Rac1的抑制可阻止胶原蛋白覆盖系统中的小管细胞形成，并使生长在3D胶原蛋白凝胶中的囊肿极性反转。激活的Rac1可以绕过β1整合素阻断，分别在覆盖系统和囊肿系统中拯救小管囊肿的形成和极性。

β1整合素的抑制(图4)或Rac1(奥布莱恩等。, 2001)防止层粘连蛋白在囊肿周围形成规则的BM，从而导致极性反转。尽管层粘连蛋白的合成和分泌是正常的，但如光镜水平所示，层粘连素在BM中的整体组织或组装是严重异常的，β1整合素受到抑制。β1整合素的连接可能激活许多调节上皮极性的不同信号通路。令人惊讶的是，我们的结果表明，当β1整合素功能被抑制时，激活的Rac1足以挽救BM组织，至少在层粘连蛋白和IV型胶原网络的水平上，并且在很大程度上可以挽救极性和管腔形成的正常方向。最后，外源性LN-1以足够高的浓度参与自组装(Yurcenco和Cheng，1993年)可以克服β1整合素(图4)和N17Rac1块(奥布莱恩等。, 2001)并能挽救极性取向。

总之，我们的数据和其他许多数据不仅确定了与极性取向有关的通路的几个组成部分，还可以解释为将这些组成部分排序为一个简单的线性通路：胶原蛋白I→ β1整合素→→ Rac1激活→→层粘连蛋白组织形成新生骨髓→→ BM装配→→ 极性方向。整个机制无疑要复杂得多，无论是在体外还是在体内。例如，该模型显然遗漏了许多中间组件。胶原蛋白I可能直接与β1整合素相互作用，但该模型中其他成分之间的联系几乎可以肯定是间接的。然而，通过在3D培养中使用MDCK细胞的简单模型系统，我们能够证明上皮细胞和细胞外基质之间相互关系的调节。具体来说，我们表明，最初的“外入”信号（β1整合素到Rac1）随后是“内出”信号（Rac1到BM组装），然后是第二个“外入”信号事件（BM到细胞极化方向）。这些观察结果非常重要，因为它们使我们能够了解上皮细胞与其基质在更复杂系统中的关系。

β1整合素介导的信号在上皮极化中的作用最初在肾脏发育中被认识到(索罗金等。, 1990). β1整合素抑制抗体(林诺斯卡等。, 1999)或显性负性β1整合素干扰乳腺发育，从这些腺体分离的细胞不能正常极化(法拉尔多等。, 1998). 另一方面，β1整合素缺失的角质形成细胞正常定位E-cadherin(制动器总线等。, 2000)β1整合素抑制抗体恢复致瘤人乳腺细胞的组织结构和细胞极性(编织者等。, 1997). 这些明显相反结果的原因尚不清楚，但可能是这些肿瘤细胞中β1整合素水平升高所致。抗体对β1整合素的抑制可能通过将β1整合素介导的信号传递到与非转化细胞类似的水平来恢复正常组织结构。

我们已经开始分析哪些特定的整合素异二聚体和层粘连蛋白异三聚体参与上述信号通路。在这里，我们使用了一种针对LN-1（α1β1γ1）的多克隆抗血清，LN-1是一种成人组织中基本上不存在的层粘连蛋白亚型(Colognato和Yurchenco，2000年). 我们无法通过RT-PCR检测到α1层粘连蛋白，而我们检测到α3和α5层粘连蛋白质链的稳健表达。虽然我们不能排除其他层粘连蛋白形式的存在，但我们相信，我们通过免疫荧光、Western blotting和代谢标记检测到的层粘连素很可能代表源自LN-10（α5β1γ1）的β1/γ1链，LN-10是肾上皮沉积的主要层粘连蛋白质亚型(Miner，1999年).

与报道的β1整合素在层粘连蛋白沉积到BM中的作用一致(法拉尔多等。, 1998;沙沙贵等。, 1998;奥梅利等。, 2000;洛希坎卡斯等。, 2001;锂等。, 2002)我们发现，用AIIB2抑制β1整合素会导致囊肿周围层粘连蛋白染色的显著变化。表达突变β1整合素的乳腺细胞不适当地将层粘连蛋白沉积在细胞的外侧，而不是基底表面(法拉尔多等。, 1998). 可能，一些BM聚集在MDCK囊肿的内部，这反过来可能导致极性轴倒置，可能是通过层粘连蛋白与细胞表面受体的相互作用。

LN-1异三聚体的分泌可通过α1的合成进行调节(尤尔琴科等。, 1997)可能还有α5链(Miner和Yurchenco，2004年)，并且β1-整合素缺陷的小鼠胚状体由于抑制该链的合成而不能沉积LN-1或空化(奥梅利等。, 2000;锂等。, 2002). 在这里，我们发现当β1整合素功能被抑制性抗体阻断时，β1和γ1层粘连蛋白链的合成和分泌不受影响。此外，我们发现无论是α3和α5层粘连蛋白链的转录，还是含有完整层粘连蛋白β1/γ1-的异源三聚体（可能是LN-10）的分泌都没有受到抑制。因此，我们的数据表明，在MDCK囊肿中，β1整合素通过另一种机制调节BM的组织（见下文）。

目前尚不清楚为什么β1整合素抑制类胚体中层粘连蛋白α链的合成(锂等。, 2002)但不在MDCK细胞中。可能是α5层粘连蛋白和α1层粘连蛋白质链的合成，在发育早期共定位，但在后期分化(矿工等。, 1998)，在胎儿和成人组织中有不同的调节。或者，这些差异可能是由于使用了不同的细胞系统和方法来抑制β1整合素。然而，尽管MDCK囊肿和类胚体中的BM组装似乎通过不同的机制介导等。(2002)这里的数据与上皮形态发生受β1整合素介导的层粘连蛋白在BM中的组织调控的模型一致。

由于β1整合素不影响层粘连蛋白链的合成或分泌，我们认为MDCK囊肿中BM组织的改变是在层粘连素相互作用受体水平的下游进一步介导的。骨髓成分，如IV型胶原和某些层粘连蛋白（LN1-4、LN-10和LN-11）能够在体外自组装(尤尔琴科等。, 1992;Yurcenco和Cheng，1993年;Miner和Yurchenco，2004年). 然而，在体内，细胞表面受体被认为通过增加细胞表面层粘连蛋白的局部浓度来调节其优先聚合(科洛尼亚托等。, 1999;尤尔琴科等。2004年). 随后可能会出现IV型胶原聚合物的结合，这可能会稳定新生的骨髓，并允许纳入额外的骨髓成分。调节细胞表面BM组装的受体尚未明确确定，多种不同的受体可能发挥多余的作用(尤尔琴科等。2004年). 然而，大量证据表明α-dystroglycan和含β1整合素的整合素在这一过程中发挥作用(迪佩西奥等。, 1997;亨利和坎贝尔，1998年;科洛尼亚托等。, 1999).

α2β1和α3β1整合素是MDCK细胞中含有β1整合素的整合素(舍恩伯格等。, 1994). 虽然这两种整合素都具有广泛的配体特异性，但这两种LN-10的首选结合伙伴是α3β1整合素(吉川等。, 1998;同上等。2004年). 有趣的是，在显性负Rac1表达的α3整合素水平降低了70-80%(奥布莱恩等。, 2001)和AIIB2处理的细胞，这可能表明α3β1在BM组装中的作用。然而，值得注意的是，α2β1，而非α3β1已被证明是I型胶原诱导的小管胞形成的相关受体(Schwimmer和Ojakian，1995年;Zuk和Matlin，1996年). 或者，MDCK细胞可以通过α-dystroglycan结合层粘连蛋白(卡钦斯基等。, 1999)或Forssman糖脂(辛克尔等。1996年). 此外，路德糖蛋白特异性结合层粘连蛋白α5并通过与LN-10/11的相互作用集中于细胞外周(穆尔森等。, 2001)，可能参与调节BM形成的信号传导。尽管在包括肾脏在内的许多上皮细胞中表达(穆尔森等。, 2001)，尚不清楚MDCK细胞是否内源性表达路德(El Nemer公司等。, 1999).

AIIB2处理过的囊肿中的BM组装、正常细胞极化和管腔形成可以通过过量的LN-1来挽救，正如之前关于类胚体的报道一样(锂等。, 2002)或通过激活的Rac1。这表明AIIB2抗体不会通过简单掩盖β1整合素的结合位点干扰BM组装，这与β1整合素的AIIB2和配体结合位点不重叠的发现一致(Takada和Puzon，1993年). 相反，我们的数据表明，从I型胶原到β1整合素的最初“外入”信号随后是Rac1依赖性的向层粘连蛋白受体发出的“内出”信号，促进BM在细胞表面的组装。可能Rac1通过α-dystroglycan和syntrophin/utrophin复合物调节肌动蛋白发挥这一功能(卡钦斯基等。, 1999)，因为细胞表面的优先层粘连蛋白聚合依赖于肌动蛋白细胞骨架(科洛尼亚托等。, 1999).

最后，我们的数据表明，BM的层粘连蛋白依赖性组装诱导了第二个“外入”型信号传导，该信号传导指向顶端-基底外侧极性。该信号通路至少部分独立于Rac1，因为表达N17Rac1的囊肿的表型可以被外源性LN-1部分挽救(奥布莱恩等。, 2001)，它不会激活AIIB2处理的覆盖培养基中的Rac1（我们未发布的数据）。这种信号通路的作用是使细胞的顶端表面与基底表面相对，而基底表面是BM的位置。目前尚不清楚为什么我们观察到细胞极性颠倒而不是混乱。正如引言中所提到的，三个主要络合物负责极化，其中Par3/Par6/aPKC络合物被认为是其他两个络合物的上游。很容易推测，组装BM下游的信号最终会影响Par3/Par6/aPKC复合体，以确定其在顶端的位置，从而确定细胞的方向。

尽管这些数据可以用线性途径来解释，但上皮形态发生显然要复杂得多，尤其是在体内。信号和形态发生途径通常是复杂网络的一部分，具有许多其他输入，以及不同级别的许多交叉连接和反馈回路。然而，这项工作说明了简单细胞培养系统开始理解复杂形态发生事件的细胞基础的能力，例如上皮组织的组装。

补充材料

【补充材料】

致谢

我们感谢Sandra Huling和加州大学旧金山肝脏中心核心设施提供的电子显微照片，以及Gina Whitmore和Holly Weachter的杰出技术援助。W.Y.得到了美国心脏协会、西方附属机构（0325013Y和0120084Y）和国家肾脏基金会的研究金支持。A.D.得到了Susan G.Komen乳腺癌基金会（PDF0100766）的资助。P.L.由法国国家科学研究中心（Centre National de la Recherche Scientifique）支持。K.S.M得到了国立卫生研究院R01 DK046768的支持。G.M.得到了Shriners Hospital for Children Research Fellowship、University Surgeons Society of University and National Institutes of Health T32 DK64581的Ethicon外科研究奖学金的支持。T.-S.J.得到了国立台湾大学医院（NTUH 92-S014）的研究资助。K.E.M得到了美国国立卫生研究院的资助。M.Z.得到了美国癌症学会加利福尼亚分部（2-7-99）的奖学金和辛辛那提大学外科学系的启动资金的支持。

笔记

文章在印刷前在线发布媒体中的MBC2004年12月1日(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E04-05-0435).

D类⃞本文的在线版本包含补充材料，网址为MBC在线(http://www.molbiolcell.org).

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会