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.2009年12月15日；336(2):169-82.
doi:10.1016/j.ydbio.2009.09.037。 Epub 2009年10月3日。

调控分枝形态发生的机械化学检查点和负反馈环的识别

威廉·P·戴利 1, 凯瑟琳·M·古尔福, 沙龙·J·塞奎拉, 梅琳达·拉森
附属公司

调控分枝形态发生的机械化学检查点和负反馈环的识别

威廉·P·戴利等。 求文献一篇. .

摘要

裂孔的形成是下颌下唾液腺（SMG）分支形态发生的最初步骤，可能是由局部肌动蛋白介导的细胞收缩引起的。由于ROCK调节细胞骨架收缩，我们研究了ROCK抑制对小鼠SMG离体器官培养的影响。ROCK的药理学抑制剂、异构体特异性ROCK I而非ROCK II siRNAs，以及肌球蛋白II活性抑制剂在启动时阻止分裂。这一发现意味着存在一个机械化学检查点，调节起始裂向进行性裂的转变。在检查点下游，通过ROCK I/肌球蛋白II促进的纤维连接蛋白的局部组装，使裂口变得有能力。Cleft进展主要由ROCK I/肌球蛋白II刺激的细胞增殖介导，细胞收缩起作用。此外，我们证明FN组装本身以ROCK依赖的方式促进上皮增殖和裂隙进展。ROCK还刺激增殖独立的负反馈回路，以防止进一步的分裂启动。这些结果表明，裂纹的萌生和发展是两个物理和生物化学上截然不同的过程。

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数字

图1
图1
ROCK的药理抑制阻断了器官培养中SMG的分支形态发生。（A） 与溶媒对照组相比，用浓度增加的Y27632和H-1152处理24小时的活E13 SMG图像显示分支减少（另请参阅电影S1）。24小时后芽数的量化显示，在两种ROCK抑制剂存在的情况下，分支受到剂量依赖性抑制。（B） 与溶媒对照组相比，用140μM Y27632或2μM H-1152处理24小时的E13 SMG在上皮芽表面出现的初始裂缝数量增加，但没有拉长（对比白色箭头）。量化显示，Y27632和H-1152的这种未成熟裂口呈剂量依赖性增加。（C） 用140μM Y27632或2μM H-1152处理24小时的E12 SMG的分枝形态发生在裂起始阶段也受到抑制。岩石抑制导致初始裂缝数量增加，但不会延长裂缝（与白色箭头相比）。（D） 用140μM Y27632或2μM H-1152培养24小时的E13 SMG上皮原基也显示出多发性未成熟裂痕（另见电影S1）。定量分析显示，完整芽数的减少与剂量相关，而小裂口数的增加与剂量相关。方差分析*p<0.05，**p<0.01，N=5。标尺，250μm（A、C和D）和50μm（B和C）。
图2
图2
ROCK I在E13 SMG的上皮细胞中表达，并调节裂隙进展。（A） 对E13 SMG的上皮和间充质细胞提取物进行的西方分析表明，ROCK I、ROCK II和MLC2在上皮和间质中均表达，并根据GAPDH标准化的相对带强度进行量化。（B） ROCK I（绿色）和ROCK II（青色）的免疫细胞化学表明，ROCK亚型在上皮细胞中的表达高于间质，上皮细胞被E-钙粘蛋白（红色）标记。从每个SMG的中心获取共焦图像。（C） 用400 nM ROCK I siRNA在器官培养中转染E13 SMG 48小时，而不是400 nM LOCK II或阴性对照siRNA，可减少SMG分支，其形态扰动与药物ROCK抑制剂相似，高倍图像显示ROCK I siRNA处理的SMG中存在不完整的裂痕，但未显示对照或ROCK II siRNA治疗的SMG（白色箭头）。对siRNA-处理的SMG进行量化显示，敲除ROCK I而非ROCK II可以阻止分裂进展并促进额外的启动事件。联合使用ROCK I和II siRNA处理的SMG在芽和起始裂中表现出与单独使用ROCKI siRNA处理SMG相似的折叠变化。（D） Western blot分析以确认ROCK I和ROCK II与异型体特异性ROCK siRNA的敲除。量化标准化为GAPDH，并表示为相对于阴性对照处理SMG的百分比。U、 未经处理；R、 仅转染试剂；C、 400 nM阴性对照siRNA。方差分析*p<0.05，**p<0.01。比例尺，50和20μm（B）以及250和50μm（C）。
图3
图3
肌球蛋白活性是SMG分裂进展所必需的，并促进上皮芽周围的细胞骨架张力。（A） E13 SMG与100μM抑泡素培养24小时后，开始分裂的数量增加，但没有拉长（白色箭头）。随着blebbistatin浓度的增加，形态学变化的量化。（B） 西方分析显示，随着Y27632、H-1152和ROCK I siRNA浓度的增加，磷酸化pMLC2的数量呈剂量依赖性减少。（C）通过免疫染色SMG中心的共聚焦图像显示，pMLC2（绿色）存在于上皮芽周围（白色箭头），而肌球蛋白IIb重链（红色）在Z维的整个上皮中都存在，如XY视图（左）和通过SMG的堆叠XZ投影（右）所示。与溶媒对照组相比，140μM Y27632处理24小时的上皮原基pMLC2染色降低。（D） 共聚焦图像显示ROCK I（青色）位于上皮表面，带有pMLC2（绿色）和肌动蛋白（红色）。（E） 与溶媒对照组相比，用140μM Y27632、2μM H-1152或100μM玻利巴司他丁培养24小时的E13 SMG的厚度减少，直径扩大。方差分析*p<0.05，**p<0.01。标尺，250μm（A）、20μm（C）和10μm（D）。
图4
图4
抑制ROCK和肌球蛋白活性可降低SMG增殖。（A） 使用BrdU分析评估在140μM Y27632、2μM H-1152、100μM blebbistatin或0.5 mM HU存在下培养24小时的E13 SMG的增殖情况：BrdU（增殖核，绿色）、Na+/K（K）+ATP酶（优先用于上皮膜，红色）。在载体控制SMG中，增殖核定位于进行性裂的远端（白色箭头），但在近端裂基部（箭头）没有增殖核，这在共焦图像中很明显。所有抑制剂处理后，这种BrdU阳性核大大减少。（B） 将表达为BrdU阳性细胞核的增殖细胞核定量为总细胞核（SYBR绿色阳性）。（C） 用0.5 mM HU培养24小时后，SMG出现初始裂口，但没有进展性裂口，高倍镜下可见（白色箭头）。与Y27632、H-1152和镇静剂相比，经HU浓度增加处理24小时的SMG显示出完整芽数和开始裂数的量化。方差分析**p<0.01，N=5。比例尺，10μm（A）和250μm（C）。
图5
图5
裂开进展需要增殖和收缩作用。（A） 膨胀指数（EI，青色虚线）和收缩指数（CI，红色虚线）的示意图，分别表示相对于固定起点（初始裂隙的基底，黑色虚线）裂隙基底的侵入。进展指数（PI）是一个衡量裂隙长度的指标。测量和计算详见图S7。（B） 将裂隙区域宽场延时成像（见电影S2）中的选定图像进行蒙太奇拼接，以显示裂缝底部（时间0，黑色虚线）、芽生长范围（最后一个时间点，青色线）和裂缝底部（最后一时间点，红线）作为对照，140μM Y27632、100μM blebbistatin和0.5 mM HU处理的E13 SMG。（C） EI、CI和PI的量化（单位：AU）。方差分析*p<0.05，**p<0.01，N=6。比例尺，50μm。
图6
图6
分支SMG基底膜中FN组装需要ROCK信号。（A） 对使用140μM Y27632、2μM H-1152或100μM布利他汀处理24小时的E13 SMG提取物进行FN的西方分析。总内源性FN的量化（归一化为GAPDH并相对于载体对照表达）表明两个治疗组之间没有显著差异。（B） 用Y27632、H-1152、滤泡抑素或ROCK I siRNA处理的SMG在上皮芽周围的基底膜中显示出点状、无组织的FN（绿色）（白色箭头）。E-钙粘蛋白（红色）在SMG中心获得的共聚焦图像中标记上皮芽。（C） 与溶媒对照组相比，经Y27632、H-1152或blebbistatin处理的SMG和SCA-9细胞显示DOC不溶性FN减少。SMG和SCA-9细胞DOC提取物的定量分别归一化为波形蛋白和GAPDH，并相对于载体对照表达。波形蛋白（DOC不溶性）和肌动蛋白（DOC-溶性）证实了这两个组分的分离。（D） 用50μM Y27632（白色箭头）处理的SCA-9细胞中，L8抗体（红色）对总外源性FN基质（绿色）的免疫染色降低，如宽视野图像所示。（E） 从经140μM Y27632处理的E13 SMG上皮雏形中心获得的共聚焦图像显示，相对于载体对照处理的SMG，上皮芽周围基底膜的L8染色（红色）减少。比例尺，5μm（B）、20μm（D）、20和10μm（E）。
图7
图7
FN以ROCK依赖的方式促进上皮细胞增殖。（A） 用500 nM FN siRNA而非阴性对照siRNA处理E13 SMG 24小时，抑制分支形态发生。这种抑制可以通过向培养基中添加0.5 mg/mL外源性血浆FN来缓解，但在140μM Y27632的存在下无法缓解。在指定条件下培养24小时后的芽数量化。（B） E13 SMG在指定的培养条件下培养24小时，并用BrdU脉冲2小时。在存在500 nM FN siRNA的情况下，BrdU细胞核（青色）大大减少，可通过向培养基中添加0.5 mg/mL外源FN来挽救，但在存在140μM Y27632的情况下则无法挽救。在浓度不断增加的外源性FN存在下培养24小时的E13 SMG表现出BrdU标记的掺入增加，但在140μM Y27632存在下没有。FN（绿色）染色证实FN敲除和掺入。在每个SMG的中心采集共焦图像。BrdU阳性核的定量，表示为与SYBR绿色阳性核总数的比率。方差分析*p<0.05，**p<0.01，N=5。比例尺，250μm（A），100μm（B）。
图8
图8
提出了SMG裂形成过程中ROCK I介导的肌动球蛋白收缩力模型。ROCK I信号调节一个检查点，通过该检查点，一个初始的裂经历向一个进行性的、稳定的裂的过渡，需要局部收缩性介导的FN组装。FN促进局部上皮细胞增殖，产生向外的扩张力，克服表面张力，导致裂隙进展，ROCK I介导的肌动球蛋白收缩性也刺激负反馈回路，暂时阻止更多裂隙的产生。
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