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尼姆斯:美国国立卫生研究院238984
Rho-激酶指导Bazooka/Par-3平面极性果蝇属轴向伸长率
霍华德·休斯医学院,发育生物学项目,斯隆-凯特琳研究所,1275 York Avenue,New York,NY 10065 USA
1当前地址:美国科罗拉多州丹佛市丹佛大学生物科学系
*通讯作者:Jennifer Zallen发育生物学项目Sloan-Kettering Institute 1275 York Avenue New York,NY 10065电话:212-639-8937传真:212-717-3623gro.ccksm@jnellaz - 补充资料
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总结
单元格重排形成果蝇属胚胎通过空间调节细胞形状和粘附的变化。我们表明,肌球蛋白II和粘附连接蛋白的平面极化分布需要Bazooka/Par-3(Baz),极化的插入行为在巴兹突变体。肌球蛋白II激活物Rho-激酶在嵌入细胞的前后边缘不对称富集,与Baz互补。Rho-kinase的缺失导致Baz结构域的扩张,活化的Rho-kinase足以将Baz从皮层中排除。Baz的平面极化分布需要其C端畴。Rho激酶可以磷酸化该结构域并抑制其与磷脂酰肌醇膜脂的相互作用,这表明Rho蛋白激酶可以调节Baz与细胞皮层的结合。这些结果表明,Rho激酶通过将Baz/Par-3和肌球蛋白II靶向互补的皮层结构域,在平面极性中发挥指导作用。
结果
轴伸长期间的夹层行为需要Baz/Par-3
轴伸长率果蝇属胚胎的特征是前、后细胞界面处肌球蛋白II和F-actin平面极化富集,背、腹细胞界面处E-cadherin、β-catenin和Baz/Par-3平面极化富集(Bertte等人,2004年;Zallen和Wieschaus,2004年;Blankenship等人,2006年). 极化肌动球蛋白的收缩性在定向细胞行为中起着重要作用(Rauzi等人,2008年;Fernandez-Gonzalez等人,2009年)Baz和粘附连接的作用尚不清楚。合子突变的胚胎伸长率降低巴兹但这些胚胎含有母体巴兹mRNA和蛋白质(Zallen和Wieschaus,2004年). 为了完全消除Baz活性,我们为两个空等位基因产生了母体和合子突变胚胎,巴兹GD21公司和巴兹FA50型(实验程序)(Denef等人,2008年). 合子致死率巴兹GD21公司和巴兹FA50型纯合子被Dp(1;Y)W73包含巴兹开放阅读框,表明每一个都包含一个在巴兹轨迹。这两个等位基因在母体和颧骨突变的胚胎中均未显示出可检测的Baz染色巴兹,此处称为巴兹突变胚胎。
轴伸长在以下延时电影中严重缺陷巴兹突变体(). 突变细胞参与较少的重排()并显示邻接交换和玫瑰花结形成减少,这两种行为需要肌动球蛋白的极化收缩力(Bertte等人,2004年;Blankenship等人,2006年). 中发生的单元格移动巴兹突变体表现出方向性的中度丧失(). 一些细胞在第7期晚期开始顶端收缩,导致第8期异位凹槽的形成(;电影S1,S2系列) (Muller和Wieschaus,1996年;Wodarz等人,1999年). 这些缺陷不是由凋亡引起的,而凋亡在野生型或巴兹这些阶段的突变胚胎(图S1). 这些结果表明,细胞重排和轴伸长期间的空间调节收缩行为需要Baz。
巴兹突变体在细胞插入中有缺陷(A–D)野生型和突变胚胎延时电影中的细胞行为。(A) 种带伸长在巴兹GD21公司和平方小时1突变体。(B) 中每个单元丢失的邻居更少巴兹和平方小时突变体。获得了每个胚胎的平均值,误差条表示胚胎的s.e.m.(n=10 WT,5巴兹GD21公司、和2平方英寸1胚胎)。WT胚胎用GFP:Resille(4)、GFP:Spider(3)和E-cadherin:GFP(3)成像,巴兹GD21公司胚胎用GFP成像:蜘蛛,平方小时1胚胎用E-cadherin:GFP成像。t=0是第7阶段伸长率的开始。(C) 野生型收缩行为偏向与AP轴垂直的边(角度以度为单位,平行于AP轴的边为0)。条形图表示从0–10°开始的10°箱。(D) 收缩行为巴兹突变体减少,部分空间放松管制:66%的收缩边缘方向≥60°in巴兹与野生型的88%相比,16%的突变体定向于≤30°in巴兹与<1%的野生型突变相比(n=10野生型和5野生型巴兹GD21公司胚胎,33–161个细胞/胚胎)。(E,F)野生类型电影中的静像(E)和巴兹GD21公司(F) 表达蜘蛛的胚胎:GFP。星号表示腹沟闭合缺陷巴兹突变体和箭头指向顶部收缩的细胞簇。比例尺=10μm。请参见图S1,电影S1,2.
Baz/Par-3是肌球蛋白II和粘附连接平面极性所必需的
调查以下缺陷的基础巴兹突变体,我们分析了插入细胞中的蛋白质定位。在野生型中,肌球蛋白II位于顶部,并集中在前细胞和后细胞之间的边界(AP边缘)() (Zallen和Wieschaus,2004年). 肌球蛋白顶端定位在巴兹突变体(图S2; 第5页,共5页巴兹GD21公司和6/6巴兹FA50型胚胎显示顶端肌球蛋白定位)。相比之下,肌球蛋白平面极性被强烈破坏,肌球蛋白质在所有方向的边缘和内侧顶端皮层以不规则的方式积聚() (0/10巴兹GD21型和0/3巴兹FA50型胚胎显示肌球蛋白平面极性)。粘附连接蛋白的平面极化定位也需要Baz(0/3巴兹GD21公司和0/7巴兹FA50型胚胎显示臂/β-连环蛋白平面极性)。肌球蛋白平面极性在RNAi破坏Arm/β-catenin的胚胎中正常发生,在母体和合子突变的胚胎中臂043年06月甚至在与邻居明显分离的细胞中(图S2)表明Baz在肌球蛋白调节中的作用与其在粘附中的作用是分开的。
肌球蛋白II和β-连环蛋白的平面极化定位需要Baz/Par-3(A,D,G,J)7期野生型(A)肌球蛋白II(Zip重链,红色)、β-catenin(绿色)和Baz(蓝色)的定位,巴兹FA50型(D) ,巴兹GD21公司(G) ,以及平方小时1(J) 胚胎。左侧面板显示肌球蛋白(红色)和β-连环蛋白(绿色)的叠加。左前方,腹侧向下。比例尺=10μm。(B,E,H)肌球蛋白平面极性在巴兹FA50型(P<0.001)(E)和巴兹GD21公司(P<0.001)(H)与野生型(B)(n=5野生型,3巴兹FA50型, 4巴兹GD21公司胚胎)。(C,F,I)β-catenin平面极性在巴兹FA50型(P<0.001)(F)和巴兹GD21公司(P<0.001)(I)与野生型(C)相比(n=11野生型,3巴兹FA50型, 4巴兹GD21公司胚胎)。(K,L)Baz平面极性保留在平方小时1与野生型(K)相比的突变体(L)(n=11野生型,14平方小时1胚胎)。请参见图S2.
Baz/Par-3在AP边缘下调,在DV边缘上调,形成平面极性
这些结果表明,不对称定位的Baz蛋白调节了插入细胞中肌球蛋白II和β-连环蛋白的定位。因此,我们有兴趣确定负责Baz定位的上游机制。Baz在DV边缘的积聚可能是通过Baz向DV边缘募集、Baz与AP边缘结合的抑制或两者的结合而发生的。为了区分这些可能性,我们分析了表达Baz:GFP和Myo:mCherry的胚胎的延时电影中的Baz定位。这两种融合蛋白都有功能并且定位正确(本顿和圣约翰斯顿,2003年;Martin等人,2009年;McGill等人,2009年).
Baz在第5阶段被定位于顶端,而肌球蛋白在第6阶段首次被检测到() (电影S3). Baz最初在顶部皮层呈点状非极化分布,在嵌入开始之前的第6阶段局限于DV边缘(). 相反,肌球蛋白一经检测到就在AP边缘富集(). AP边缘的肌球蛋白募集对应于Baz耗尽的部位。当Baz强烈定位于DV边缘且肌球蛋白主要为AP时,平面极性在第7阶段嵌入开始时变得更加突出(). 延时电影中Baz水平的定量显示,Baz水平最初在AP边缘降低,随后在DV边缘增加(,图S3). 这些结果表明,Baz平面极性是通过一种双重机制从均匀分布中产生的,在这种机制中,Baz首先在AP边缘下调,然后Baz顶点定位增加,限制在DV边缘。
Baz/Par-3在AP边缘下调,在DV边缘上调,形成平面极性(A–D)在Gal4驱动器(绿色)的控制下,胚胎中嵌入细胞表达Myo:mCherry(红色)和Baz:GFP的电影静像。t=0是第7阶段伸长率的开始。A−11分钟,B−4分钟,C 3分钟,D 9分钟。(B)在第6阶段,Baz:GFP被取代,Myo:mCherry在AP边缘(箭头)积聚。(C,D)在第7阶段,Myo:mCherry和Baz:GFP分别占据AP和DV边缘。比例尺=5μm。
(E,F)Baz:GFP荧光强度的定量。(E) 日志2Baz:GFP强度在DV边缘(相对于AP轴方向≤30°)相对于AP边缘(相对于AP轴方向≥60°)的比率在所有细胞中平均(n=5个胚胎,764–2142个边缘/胚胎)。误差线表示胚胎的s.e.m。t=0是第7阶段伸长率的开始。(F) 单个胚胎中按边缘方向分组的绝对边缘强度。Baz首先在AP边缘(黄色、紫色)下调,然后在DV边缘(深蓝色、绿色)上调。请参见图S3,电影S3.
Baz/Par-3平面极性需要Rho激酶
由于AP边缘Baz的丢失与肌球蛋白的募集相关,我们询问Baz平面极性是否需要肌球蛋白活性。虽然不可能产生缺乏肌球蛋白的胚胎,但由于肌球蛋白调节轻链的部分突变,胚胎发生母体突变(平方小时1) (Karess等人,1991年)轴伸长和细胞插入严重缺陷(). 在这些突变体中,肌球蛋白重链的皮质水平降低,不再是平面极化的(; 1/11平方小时1胚胎显示肌球蛋白平面极性)。尽管肌球蛋白重链定位错误,但Baz和野生型一样集中在DV边缘() (9/11平方小时1突变胚胎表现出Baz平面极性)。因此,虽然Baz对肌球蛋白定位是必要的,但肌球蛋白的平面极性对Baz定位是不必要的。
为了确定替代的Baz调节因子,我们转向Rho激酶,该激酶已被证明在培养的哺乳动物细胞中磷酸化Par-3(Nakayama等人,2008年). 肌球蛋白皮质定位需要Rho激酶果蝇属(图S4)与之前胚胎的结果一致(Bertte等人,2004年;Dawes-Hoang等人,2005年)和其他单元格类型(Winter等人,2001年;Dean and Spudich,2006年;Wang和Riechmann,2007年). 为了询问Baz定位是否需要Rho激酶,我们分析了胚胎母体突变的Rho蛋白激酶零突变(DRok公司2突变体)。Baz与心尖粘连连接正常发生于DRok公司2突变体,但Baz平面极性严重缺陷() (0/12DRok公司2突变胚胎显示出野生型Baz平面极性)。臂/β-连环蛋白平面极性在DRok公司2突变体(0/12DRok公司2突变胚胎显示野生型β-catenin平面极性)。在母体突变的胚胎中观察到类似的缺陷DRok公司1等位基因(图S4). 观察到两个具有不同严重程度缺陷的突变类,与弱父系贡献一致(图S4). 这些结果表明,Rho激酶是插入细胞中Baz及其效应蛋白平面极化定位所必需的。
Baz/Par-3平面极性需要Rho激酶(A–H)Baz(绿色)和β-catenin(红色)在第7阶段野生型(A–D)和DRok公司2突变(E–H)胚胎。D,H中的横截面。野生型(B,C)中Baz和Arm/β-catenin平面极性的定量DRok公司2(F、G)。Baz和β-catenin平面极性在DRok公司2突变胚胎与野生型胚胎的比较(P(P)每个结果<0.001)(n=11个野生型,8个DRok公司2胚胎)。观察到两类缺陷,此处显示了更多的缺陷类别。请参见图S4.
(I–L)Baz(绿色)在注射水(I)或Y-27632(J)的7期胚胎中的定位。与野生型(L)相比,Y-27632注射胚胎(K)的Baz平面极性降低(P(P)=0.002)(n=5个对照注射胚胎,4个Y-27632注射胚胎)。
(M,N)Baz(绿色)在14期对照胚胎(M)或表达活化Rho激酶的胚胎(Rok-CA,N)背外侧表皮的定位。比例尺=10μm。
为了询问Rho激酶活性是否是其在Baz定位中的作用所必需的,我们在插入开始后的7/8阶段向胚胎注射Rho酶抑制剂Y-27632。Y-27632导致皮质肌球蛋白丢失(数据未显示),注射后5-10分钟内Baz迅速重新分布()(0/41个Y-27632注射胚胎显示Baz平面极性,而10/10个对照注射胚胎显示),表明插入期间对Rho激酶的持续需求。Y-27632也被证明能抑制aPKC(阿特伍德和普雷霍达,2009年),但aPKC不太可能对这些缺陷负责,因为平面极性保留在aPKC公司和第6段突变体(Blankenship等人,2006年;Harris和Peifer,2007年).
Rho激酶不对称定位于与Baz/Par-3互补的AP细胞边界
为了研究Rho激酶调节Baz定位的机制,我们首先分析了Rho蛋白激酶在插入细胞中的分布。HA标记的野生型Rho激酶在插入细胞的AP边界选择性富集,与F-actin共定位(,7/7个胚胎)。由于高水平的Rho激酶通常会破坏胚胎形态,因此我们产生了一种病毒标记的Rho-激酶变体,该变体突变为激酶结构域中的一个保守残基,从而破坏了催化活性(Winter等人,2001年). Rho激酶K116A型局限于第5阶段的细胞化前沿和第6阶段的顶端皮层,位于与粘附连接重叠的区域(数据未显示)。在第6阶段和第7/8阶段的细胞嵌入期间,Rho激酶K116A型在AP边缘呈平面极化分布()类似于野生型蛋白质().
Rho激酶在插入细胞中呈平面极化(A,B)Rho激酶(HA:Rok,红色)和F-actin(指骨样蛋白,绿色)在7期野生型(A)或LatB注射型(B)胚胎中的定位。
Rho激酶的(C–L)定位(金星:韩国K116A型,红色)和Baz(绿色)。阶段7野生型胚胎(C)或注射巴兹dsRNA(E)、LatB(G)、,前夕和矮子dsRNA(I),或氪dsRNA(K)。野生型(D)和注射胚胎(F、H、J、L)平面极性的定量。Rho激酶平面极性不受巴兹RNAi(F)(n=6野生型金星:RokK116A型表达胚胎,7巴兹dsRNA注射胚胎,P(P)=0.29). 注射LatB(H)(5个胚胎,P(P)<0.001),前夕和矮子dsRNA(J)(7个胚胎,P(P)<0.001),或氪dsRNA(L)(4个胚胎,P(P)=0.01). 比例尺=10μm。
Rho-激酶平面极性在缺乏Baz的胚胎中正常发生() (16/16巴兹dsRNA注射的胚胎与9/9对照注射的胚胎相比显示出Rho激酶平面极性),这可能解释了为什么巴兹突变体定向正确(). 为了询问F-actin是否是Rho激酶平面极性所必需的,我们向胚胎注射了Latrunculin B(LatB),这是一种抑制肌动蛋白聚合的毒素。在7/8期插入期间注射LatB导致Rho激酶平面极性迅速丧失,注射后5-10分钟内Baz皮质定位降低()(0/13个注射LatB的胚胎显示出Rho-kinase平面极性,而11/11个对照注射胚胎显示出此极性)。这些结果表明,肌动蛋白依赖的不对称性是Rho激酶平面极性所必需的,而不是其皮层定位所必需的。
来自AP图案系统的空间线索对于平面细胞极性来说是必要且充分的(Zallen和Wieschaus,2004年). RNAi介导的配对规则基因的破坏前夕和矮子或者gap基因克鲁佩尔导致Rho激酶平面极性丧失() (0/10前夕和矮子dsRNA注射胚胎和0/4胚胎克鲁佩尔dsRNA注射的胚胎显示Rho-激酶平面极性),表明不对称Rho激酶定位需要AP模式系统。
Rho激酶足以将Baz/Par-3从皮层中置换出来
Rho激酶在Baz水平降低的皮层区域积聚,表明Rho蛋白激酶可以抑制Baz与皮层的结合。为了测试这个模型,我们生成了一种Rho激酶变体,在Rho结合和pleckstrin同源结构域之前,该变体在1390个氨基酸中的553个氨基酸后终止,从而产生组成性激酶活性(Amano等人,1996年;Winter等人,2001年). 虽然我们无法在早期胚胎中获得高水平的活化Rho-激酶,可能是由于转基因的毒性,但晚期胚胎中活化Rho激酶(Rok CA)的表达导致大脑皮层Baz的丢失()(表达Rok CA的1/6胚胎具有皮层Baz定位,而野生型胚胎为7/7)。Rho激酶也将Baz从培养细胞的皮层中移出(). 当Baz与活化的Rho1-GTPase(RhoV14版本)Rho激酶上游激活物(). 总之,这些结果表明Rho激酶是必要的,足以将Baz从皮层中排除,这与调节Baz定位的指导作用一致。
Rho激酶调节Baz/Par-3 C末端结构域与皮层的联系(A–E)果蝇属表达Baz的S2R+细胞:仅表达Venus(绿色,A)或具有Rho激酶激活版本(Rok CA红色,B)、Rho1 GTPase(Rho第14版红色,C),肌球蛋白调节轻链(sqhE20、E21红色,D)或Lim激酶(limKE591型亚型C红,E)。Baz:没有Rok CA(n=216)的78%细胞中,Venus是皮层细胞,而Rok CA的这一比例为5%(n=284)。Rho的表达V14版本,但不是sqhE20、E21或limKE591型导致大脑皮层失去Baz。
(F–K)表达Baz的细胞:仅表达Venus变体的细胞(绿色、F、H、J)或表达Rok CA的细胞(红色、G、I、K)。(F,G)Baz C末端足以进行皮层定位(F),并被Rok CA(G)从皮层中移出。Baz 1097-1464在99%无Rok CA的细胞中为皮层细胞(n=190),而Rok CA为2%(n=178)。(H,I)Baz C末端的缺失(BazΔ1097–1464)消除了Rok CA缺失或存在时Baz皮质的定位。(J,K)Baz C-末端的邻近区域(Baz 905–1221)不受Rok CA的影响。Baz 905-1221在91%的无Rok CA细胞中为皮质(n=137),而Rok CA为97%(n=208)。
(L,M)表达GFP:Baz变体的细胞,其中C末端被异源PH域取代。BazΔ1107–1464PHP定位于皮层(L),但未被Rok CA(M)有效取代。GFP:Rok CA将Baz皮质定位从94%降低5.5倍至17%。GFP:BazΔ1107–1464PHP皮质定位从74%降低1.4倍至54%(n=183–257个细胞/条件)。比例尺=5μm。请参见图S5,6.
Rho激酶对Baz的调节可能是直接的,也可能通过替代Rho酶效应器间接发生。为了区分这些可能性,我们询问Baz定位是否受到Rho激酶的两种已知底物,肌球蛋白II和Lim激酶的影响。肌球蛋白调节轻链磷酸类似物的表达可以绕过某些细胞类型对Rho激酶的需求(Winter等人,2001年;Dean and Spudich,2006年;Monier等人,2010年). 然而,激活的肌球蛋白调节轻链(平方英寸E20,E21)没有破坏培养细胞中Baz皮层的定位()并且没有挽救Y-27632注射液对Baz定位的影响体内(未显示数据)。类似地,激活的Lim激酶(limK(限制K)E591型亚型C)并没有破坏培养细胞中Baz皮层的定位,尽管对肌动蛋白细胞骨架的影响表明该蛋白是活性的(和数据未显示)。这些结果表明,Rho激酶对Baz的调节不太可能通过肌球蛋白II或Lim激酶发生,尽管这些或其他Rho激酶底物可能有助于Baz的定位体内.
Baz/Par-3平面极性需要C末端结构域,该结构域被Rho激酶磷酸化在体外
Rho激酶可以磷酸化aPKC结合域中Thr833的哺乳动物Par-3,破坏其与aPKC的关联(Nakayama等人,2008年). 这种残留物在果蝇属或秀丽线虫提出了这是否是Par-3调节的保守机制的问题。问Rho激酶是否调节Baz与aPKC的相互作用果蝇属,我们用Baz和aPKC与活化Rho激酶或不活化Rho-激酶共同转染S2R+细胞。我们发现在有或无活化Rho激酶的情况下,Baz与aPKC共免疫沉淀(图S5)表明Rho激酶不足以破坏Baz-aPKC相互作用。
Baz C末端结构域中的一个保守区域通过与磷脂酰肌醇膜脂的直接相互作用介导Baz皮质结合(Krahn等人,2010年). 缺乏C末端结构域的Baz不能定位于皮层,而仅C末端结构就足以与皮层结合() (Krahn等人,2010年). 我们发现,Baz的C末端结构域(氨基酸1097–1464)被Rho激酶有效地从皮层中排除,并残留在富含肌动蛋白的膜泡中(). 这种效应是特定的,因为Rho激酶不会干扰包含aPKC结合基序和部分C末端结构域(氨基酸905-1221)的重叠Baz片段的皮层定位(). 这些结果表明Rho激酶作用于Baz C末端结构域,抑制其与细胞皮层的联系。
因为哺乳动物Par-3是Rho激酶的底物(Nakayama等人,2008年),我们问这种相互作用在果蝇属。我们测试了在体外人类Rho激酶2的激酶活性,与果蝇属激酶结构域中的Rho激酶,来自大肠杆菌Baz的C末端区域(氨基酸1125–1464),与线圈结构域具有同源性(Nishimura等人,2005年)被Rho激酶(Baz N4,). 包含PDZ结构域的Baz N2片段(氨基酸281-736)和包含aPKC结合区域的Baz N3片段(氨基酸737-1124)也在该分析中被弱磷酸化().
Baz/Par-3 C端结构域对于Baz平面极性是必要的(A–C)GST-Baz片段与活化的Rho激酶(Rok-CA)和γ-32P-ATP。(A) 每个片段中的域。(B) 考马斯染色定量总蛋白。kD分子量标记(从上到下):100、75、50和37。(C) 通过放射自显影术检测磷酸化蛋白。箭头表示Rok CA,它显示出微弱的自磷酸化。星号表示GST-Baz片段、野生型鸡肌球蛋白调节轻链(MRLC)(阳性对照)和不可磷酸化鸡MRLC T19A、S20A(阴性对照)。
(D–K)GFP-Baz转基因在7期胚胎中的定位。内源性巴兹用dsRNA注射敲除胚胎,用GFP(绿色)和β-连环蛋白(红色)抗体标记胚胎。(D,E)全长GFP-Baz显示野生型平面极性(5个胚胎)。(F,G)GFP-BazΔ1325-1464定位于皮层,但未能不对称定位(4个胚胎,P(P)<0.001). (H,I)GFP-BazΔ1097–1464缺乏C末端较大区域,表明皮质结合减少,未能不对称定位(3个胚胎,P(P)<0.001). (J,K)GFP-BazΔ1107–1464:PHP,其中Baz的C末端358个氨基酸被异源PH域取代,恢复了皮层定位,但未能不对称定位(6个胚胎,P(P)<0.001). 比例尺=10μm。请参见图S6.
测试Baz C末端结构域的作用体内,我们在插入细胞中表达截断的Baz蛋白。因为Baz可以通过其N末端结构域进行齐聚(本顿和圣约翰斯顿,2003年;Mizuno等人,2003年),内源性Baz水平通过注射与巴兹5’非翻译区,在转基因中不存在。全长Baz正确定位到DV边缘()(11/11个胚胎显示GFP-Baz平面极性)。相比之下,缺失C-末端140氨基酸的缺失结构消除了Baz平面极性()(0/11个胚胎显示GFP-BazΔ1325–1464平面极性)但保留了先前报道的皮层定位(Krahn等人,2010年). 对于去除Baz C末端结构域较大区域的构建体,也获得了类似的结果(1/7胚胎显示GFP-BazΔ1222-1464平面极性)。缺失整个C末端结构域的缺失结构显示皮质定位降低(Krahn等人,2010年)到达皮层的残余蛋白质未能不对称定位()(0/5个胚胎显示GFP-BazΔ1097–1464平面极性)。这些结果表明C端畴对于Baz平面极性是必要的体内.
Baz C末端直接与磷脂酰肌醇膜脂质结合,用人磷脂酶Cδ中的异源磷脂结合蛋白同源(PH)结构域替换该结构域足以恢复Baz皮层定位(Krahn等人,2010年). 我们发现,在培养的细胞中,这种Baz变体不会被Rho激酶从皮层中转移出来()并且没有实现平面极化分布体内()(0/7个胚胎显示GFP-BazΔ1107–1464PHP平面极性)。这些结果表明,Rho激酶通过抑制Baz C末端结构域与细胞皮层的结合来调节Baz平面极性。与此一致,Rho激酶抑制Baz C末端结构域结合磷脂酰肌醇膜脂的能力在体外(图S6). 在没有Rho激酶的情况下,Baz C末端片段(氨基酸1125-1464)与PIP、PIP结合2、PIP三和磷脂酸。Rho激酶的磷酸化有效地破坏了这种结合,对PIP的影响最强2和PIP三这种作用被Y-27632 Rho激酶抑制剂逆转。总之,这些结果表明C末端结构域对Baz平面极性是必要的,并表明Rho激酶通过降低Baz C末端结构区对磷脂酰肌醇膜脂的亲和力来调节Baz皮层定位。
实验程序
蝇类和遗传学
胚胎在20°C下生成。野生型是y、 w个除非另有说明。Alleles是巴兹FA50型,巴兹GD21公司(N.Denef和T.Schüpbach的礼物),臂043年06月(托文斯基和维肖,2001年),DRok公司1,DRok公司2(Winter等人,2001年)、和平方小时1(Karess等人,1991年). 表达UASp-Venus的胚胎:RokK116A型(这项工作),UASp HA:Rok(Wang和Riechmann,2007年)、UASp-Baz:GFP(本顿和圣约翰斯顿,2003年)或Baz转基因(Krahn等人,2010年)为UASp雄性x matαtub67的F2代;15只雌性(D.St.Johnston赠送)。使用FLP-DFS系统生成生殖系克隆卵圆第1页FRT101标准(周和佩里蒙,1996年),卵圆D2类FRT19A(N.Tolwinski的礼物)或卵圆D2类FRT18D标准。
这个巴兹通过PCR扩增FM7、Kr-Gal4、UAS-GFP杂合雌性和FM7、Kr-Gal5、UAS-GFP雄性的GFP阴性幼虫后代的所有外显子和剪接连接,对等位基因进行测序,并在不同幼虫的独立PCR反应中进行确认。这个巴兹GD21公司等位基因在开放阅读框中包含一个nt793-796的4-nt缺失,引入一个移码,预计在1464个氨基酸中的264个氨基酸后截断该蛋白,删除PDZ结构域、aPKC结合区域和C末端结构域。这个巴兹FA50型等位基因包含一个nt2463-2470的8-nt缺失,引入了一个移码,预计在1461个氨基酸中的821个氨基酸后截断该蛋白,删除了aPKC结合区和C末端结构域。
转基因系
UASp-Venus:RokK116A型是通过克隆全长生成的DRok公司cDNA导入pENTR/D TOPO克隆载体,将Venus克隆到AscI位点,然后进行定点突变(Stratagene Quik-Change系统)。克隆通过网关系统(Invitrogen)重组为pUASp-w-attB(Mike Buszczak的礼物)。pUASp-HA:Rok-CA是通过扩增DRok公司pUASp-HA:Rok的cDNA和HA(Wang和Riechmann,2007年)并子克隆到pUASp中。转基因被插入染色体II上的attP40位点(遗传服务)。
免疫组织化学
对于Arm/β-catenin、Baz、HA和肌球蛋白抗体,胚胎在0.03%Triton X-100/0.4%NaCl中煮沸10 s,在冰上冷却,并在庚烷:甲醇中脱碲。对于GFP抗体,胚胎在PBS/庚烷中的4%PFA(EMS)中固定20分钟,并在庚烷:甲醇中脱蛋氨酸。对于阴茎倍体蛋白,胚胎在PBS/庚烷中的4%PFA中固定1小时,并手动去黄化。抗体的使用浓度如下:小鼠抗臂抗体(1:50,发育研究杂交瘤库,DSHB),豚鼠抗Baz抗体(1:500,由JAZ制成,如Wodarz等人,2000年)、大鼠抗DE-卡德林(1:100,DSHB)、兔抗GFP(1:100)、鼠抗HA(1:500,罗氏)和兔抗肌球蛋白II重链(拉链,1:1250,C.Field赠送)。以1:500使用与Alexa-488、Alexa-568或Alexa-647(分子探针)结合的二级抗体。以1:1000的比例使用罗丹明缀合的鬼笔肽(Molecular Probes)。将胚胎安装在Longing Gold(Molecular Probes)中,并用PlanNeo 40×/1.3NA物镜在蔡司LSM510 META共焦显微镜上成像。以0.5μm步长获得1.0μm Z切片。分析了根尖交界区2–3μm的最大强度投影。
时间推移成像
使用以下标记物进行时间推移成像:GFP:Spider和GFP:Resille(Alain Debec的礼物),ubi-DE-cadherin:GFP(Oda和Tsukita,2001年),平方米-平方米:GFP(Royou等人,2004年)、UASp-Baz:GFP(本顿和圣约翰斯顿,2003年),平方-平方:mCherry(Martin等人,2009年)和GFP插入内源性巴兹基因(捕蝇器)。胚胎在50%漂白剂中脱胆碱1分钟,用水冲洗,用卤代烃油27(Sigma)安装在YSI膜上,并在Perkin Elmer RS5旋转圆盘上与蔡司PlanNeo 40×/1.3NA物镜共聚焦成像。Z堆栈以1μm的步长和15 s的间隔采集。分析了根尖交界区2–3μm的最大强度投影。
极性测量
使用用户绘制的50μm×50μm区域内所有边缘的3像素宽线来计算每个边缘的平均像素强度和方向。使用自定义Matlab软件减去背景(定义为质膜上≥1μm细胞质像素的平均值)后,对15°角箱中所有边缘的强度进行平均。将每个箱子中的平均强度值归一化为与AP轴平行(0-15°)或垂直(75-90°)的边缘的平均强度。每个实验都会对代表性的图像子集进行量化。获得了每个胚胎的平均值,误差条表示所有图中的标准偏差。通过比较突变胚胎和对照胚胎0–30°或60–90°角范围内边缘的归一化平均强度,以及F检验和适当的t检验,计算P值。
药物注射
将7/8期胚胎脱绒毛,粘在盖玻片上,脱水5分钟,用1:1的卤代烃油27/700覆盖,并在腹侧卵黄周腔注射100-200 pl的10-100 mM Rho-激酶抑制剂Y-27632(TOCRIS)于水中或10 mM Latrunculin B(Sigma)于DMSO中。对照胚胎注射水或二甲基亚砜。药物在胚胎中稀释约50倍。为了进行免疫染色,胚胎在注射后5–10分钟用庚烷从盖玻片上洗掉,在PBS/庚烷中的4%PFA中固定1小时,然后手动去碲化。
致谢
我们感谢Andreas Wodarz在出版前分享信息和试剂,感谢Natalie Denef和Trudi Schüpbach巴兹等位基因,Nick Tolwinski卵圆D2类FRT19A型stock和Mike Buszczak用于pUASp-w-attB质粒。我们感谢Justina Sanny和Leah Greenspan提供的出色技术援助,以及Emily Marcinkevicius、Athea Vichas、Frederik Wirtz Peitz和Richard Zallen对手稿的有益讨论和评论。这项工作得到了葡萄牙科学技术基金会(Fundação para a Ciência e Tecnologia,Portugal to SS)的博士后研究金和巴勒斯-威康基金会生物医学科学职业奖、迪梅斯·巴西尔·奥康纳初级学者奖、塞尔学者奖、W·M·凯克基金会医学研究杰出青年学者奖,NIH/NIGMS R01向JAZ授予GM079340。JAZ是霍华德·休斯医学研究所的早期职业科学家。
脚注
出版商免责声明:这是一份未经编辑的手稿的PDF文件,已被接受出版。作为对客户的服务,我们提供这份手稿的早期版本。手稿在以最终可引用的形式出版之前,将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意,在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误,适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
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