L-半胱氨酸脱硫酶NFS1定位于细胞溶胶中，为人类钼辅因子的生物合成提供硫

HeLa细胞表达EYFP/ECFP融合蛋白的荧光显微镜观察

为了分析NFS1在HeLa细胞中的亚细胞定位，我们构建了与ECFP和EYFP的N端和C端融合蛋白。对于NFS1-EYFP或EYFP-NFS1Δ1-55与ISD11-ECFP或ECFP-MOCS3的共定位，相应的融合蛋白对在HeLa细胞中瞬时共表达，通过共焦荧光显微镜观察亚细胞定位，如图2和​和3。三通过合并EYFP和ECFP荧光显示蛋白质的Colocalization，导致黄色（参见图2和​和3），三)，并通过线条轮廓，沿合并图像中指示的箭头比较EYFP和ECFP的像素强度（参见中的右行图2和​和3）。三). 作为对照，ISD11、MOCS2A和MOCS3与ECFP或EYFP融合。此外，我们分析了NFS1的伴侣蛋白ISD11在线粒体中的定位。

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图2

荧光显微镜观察HeLa细胞中表达的EYFP/ECFP融合蛋白。

电子飞行计划(绿色假彩色)和ECFP标签(红色假彩色)对HeLa细胞中的蛋白质进行亚细胞定位和共定位（“合并“行导致黄色发生共定位时）。此外，还可以绘制线轮廓(正确的)显示了EYFP和ECFP沿“合并”图中显示的箭头（距离以µm为单位）的像素强度。A、，NFS1-EYFP和ISD11-ECFP（线粒体定位）；B类NFS1-EYFP（细胞溶质定位）和ISD11-ECFP（核定位）；C类、EYFP-NFS1Δ1-55和ISD11-ECFP；D类,E类NFS1-EYFP和ECFP-MOCS3；F类、EYFP-NFS1Δ1-55和ECFP-MOCS3。以下数字面板E是一个特写镜头图中所示区域（框）的图形面板D.标尺，20µm（除E、，为2µm）。

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图3

荧光显微镜观察HeLa细胞中表达的EYFP/ECFP融合蛋白。

EYFP公司(绿色假彩色)和ECFP标签(红色假彩色)对HeLa细胞中的蛋白质进行亚细胞定位和共定位（“合并“行导致黄色发生共定位时）。此外，还可以绘制线轮廓(正确的)显示了EYFP和ECFP沿“合并”图中显示的箭头（距离以µm为单位）的像素强度。A、，EYFP-MOCS2A和ECFP-MOCS3；B类、EYFP-MOCS2A和NFS1-ECFP；C类，EYFP-MOCS2A和ECFP-NFS1Δ1-55；D类、EYFP和ECFP。比例尺，20µm。

如所示图2A在同时表达NFS1-EYFP和ISD11-ECFP的细胞中，大多数NFS1-EYFP和ISD11-ECFP靶向线粒体，这两种蛋白在线粒体中共定位。线粒体中这两种蛋白的定位已被Mitotracker证实，并作为补充图S1作为补充数据发布在PloS ONE网站上。一般来说，当转染细胞和未转染细胞的显微增益增加时，细胞液中的荧光仅在表达NFS1-EYFP的转染细胞中可见(图2D和E，未显示未转染细胞的数据）。有趣的是，在不增加增益的情况下，只有一小部分荧光细胞（24%，N = 140），主要是邻近细胞，显示NFS1-EYFP靶向胞浆(图2B).

相反，在胞浆中未检测到ISD11-ECFP的荧光，这表明该细胞室中ISD11-EC FP的丰度较低或不存在。由于ISD11和NFS1在线粒体中共存，ISD11与NFS1Δ1-55形成复合物在体外 [31]，我们还期望在胞浆中实现共定位。因此，为了进一步分析这一点并增加胞浆中NFS1的浓度，我们分离了其线粒体靶向信号。我们用EYFP-NFS1Δ1-55和ISD11-ECFP共转染细胞，并分析ISD11定位的影响。不出所料，EYFP-NFS1Δ1-55主要在胞浆中检测到。相反，ISD11-ECFP仅在线粒体和细胞核中检测到(图2C). 此外，NFS1-EYFP和EYFP-NFS1Δ1-55在细胞核中显示定位(图2B和C). NFS1和ISD11的这种定位以前已经通过免疫检测报告过[5],[21],[33].

此外，我们用NFS1-EYFP或EYFP-NFS1Δ1-55分析了共转染后ECFP-MOCS3的定位(图2D-F). 与上述共定位一致，NFS1-EYFP主要定位于线粒体，但也定位于胞浆和细胞核。这表明共转染的蛋白质不影响NFS1的定位。ECFP-MOCS3主要定位于胞浆中。当细胞溶质形式EYFP-NFS1Δ1-55和ECFP-MOCS3共同转染时，细胞溶质中的共定位信号增加(图2F). 作为对照，我们证明EYFP-MOCS2A和ECFP-MOCS3在胞浆中有共定位，而MOCS2A也靶向细胞核(图3)，如前所述[26],[27].

总之，这些观察结果表明，NFS1和ISD11存在于线粒体和细胞核中，而NFS1还位于胞浆中，我们也在胞浆中检测到MOCS3。

检测体内使用分裂EGFP系统的蛋白质相互作用

为了分析NFS1和MOCS3在胞浆中的直接相互作用，我们使用了分裂增强绿色荧光蛋白（split-EGFP）互补分析。为此，我们将NFS1、NFS1Δ1-55、ISD11和MOCS3融合到EGFP的N端1–157氨基酸或C端158–238氨基酸上，并在HeLa细胞中共同转染相应的质粒(表1). 在这个系统中，只有当两个伙伴蛋白发生相互作用并且EGFP重组时，才能检测到EGFP荧光。

如所示图4，使用该系统，我们能够通过NFS1-EGFP获得EGFP荧光^158–238和ISD11-EGFP^1–157线粒体或NFS1-EGFP^158–238和MOCS3-EGFP^1–157在细胞溶质中(图4A和B). 当MOCS3-EGFP时，胞浆中的荧光更高^1–157和NFS1Δ1-55-EGFP^158–238被共同感染(图4C). 此外，当MOCS3-EGFP^1–157和MOCS3-EGFP^158–238或NFS1-EGFP^1–157和NFS1-EGFP^158–238共转染，表明这些蛋白在胞浆中形成同型二聚体(图4D和E). 使用线粒体追踪和DAPI染色，我们观察到线粒体或细胞核。当ISD11-EGFP^1–157和NFS1Δ1-55-EGFP^158–238共转染后，我们主要在细胞核中检测到EGFP荧光。与我们上面显示的共定位数据相反，我们也在一些细胞中观察到微弱的胞浆EGFP荧光。这表明当NFS1Δ1-55在胞浆中大量表达时，NFS1△1-55和ISD11在胞浆内相互作用(图4F). 然而，由于只有少数细胞显示这种荧光，ISD11是否定位于胞浆中还需要进一步确认。

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图4

利用分裂-EGFP系统分析HeLa细胞中NFS1和MOCS3的相互作用。

利用共焦荧光显微镜分析了HeLa细胞中不同裂解EGFP融合蛋白的亚细胞EGFP组装。在共转染（EGFP的组装）后，表达了以下融合蛋白^1–157和EGFP^158–238导致了绿色假彩色):A类，ISD11-EGFP^1–157和NFS1-EGFP^158–238;B类，MOCS3-EGFP^1–157和NFS1-EGFP^158–238;C类，MOCS3-EGFP^1–157和NFS1Δ1-55-EGFP^158–238;D类，MOCS3-EGFP^1–157和MOCS3-EGFP^158–238;E类、NFS1-EGFP^1–157和NFS1-EGFP^158–238;F类，ISD11-EGFP^1–157和NFS1Δ1-55-EGFP^158–238用MitoTracker®DeepRed观察HeLa细胞的线粒体(红色)或DAPI染色显示细胞核(品红色). 合并的图片显示在右侧（要么导致黄色的或白色). 比例尺，20µm；插图中的比例尺，2µm。

在我们的对照组中，当融合或未融合的EGFP片段共同或单独表达时，未检测到特定荧光（参见补充图S2). 这些结果表明NFS1在胞浆中与MOCS3相互作用。

通过测定ECFP供体寿命检测细胞蛋白质相互作用

此外，我们通过分析HeLa细胞中ECFP/EYFP融合蛋白之间的FRET，确定NFS1Δ1-55与MOCS3的相互作用。与上述荧光定位研究一样，使用了相同的NFS1Δ1-55和MOCS3的N末端标记ECFP/EYFP融合蛋白（另见表1). 通过测定ECFP供体寿命的减少来计算相互作用的FRET效率。使用时间选通FLIM在355nm处激发ECFP，并记录其在25 ns的总时间间隔内的荧光衰减，从而确定寿命。衰变曲线以双指数形式拟合，其长寿命成分为τ₁ = 3.5±0.3 ns，τ寿命短₂ = 1.5±0.3纳秒（牛顿 = 30). 此处使用HeLa细胞获得的值与COS细胞或HeLa电池中ECFP的值相当[34],[35].

在本实验中，EYFP-NFS1Δ1-55与ECFP-MOCS3或与MOCS3、MOCS3-MoeBD-ECFP和ECFP-MOCS3-RLD的独立结构域的相互作用分析与单独使用ECFP相同。作为阳性对照，使用ECFP和EYFP与肽连接物的蛋白融合，使长供体寿命成分减少到τ₁ = 2.9±0.2纳秒，而τ的短寿命分量₂ = 0.9±0.2纳秒也减少(图5A). 这对应于长寿命组件减少17%。如上所示，我们额外使用ECFP-MOCS3和EYFP-MOCS2A相互作用作为对照，在这里，长供体寿命成分减少了15%。这与之前研究的数据一致[26]相比之下，ECFP和EYFP的共表达并没有改变供体寿命（τ₁ = 3.5±0.2纳秒，τ₂ = 1.5±0.2纳秒；图5A).

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图5

ECFP供体荧光寿命的量化（τ₁)通过HeLa细胞中的时间分辨FRET。

在HeLa细胞中表达ECFP和EYFP标记蛋白后，通过FRET测量确定ECFP供体寿命，并显示双指数衰减ECFP的长寿命成分。A类ECFP供体对照，显示ECFP-EYFP融合蛋白、ECFP和EYFP、ECFP-MOCS3和EYPP-MOCS2A的表达。B类MOCS3-MoeBD-ECFP、ECFP-MOCS3-RLD、ECFP-MOCS3和ECFP-MOCS3/EYFP的ECFP供体寿命。C类显示了在EYFP-NFS1Δ1-55存在下MOCS3-MoeBD-ECFP、ECFP-MOCS3-RLD和ECFP-MOCS3融合的ECFP供体寿命。对于每个值N = 测量30–42个细胞（显示为平均值±标准偏差）。

共表达EYFP-NFS1Δ1-55和ECFP标记的MOCS3或单独的MOCS2域的细胞的ECFP供体寿命如所示图5B和C将蛋白粉MOCS3-MoeB-ECFP、ECFP-MOCS3-RLD、ECFP-MOCS3单独或联合转染为ECFP-MOCS3/EYFP，ECFP供体寿命约为τ₁ = 3.5±0.3纳秒(图5B). 共表达对ECFP-MOCS3-RLD/EYFP-NFS1Δ1-55和ECFP-MOS3/EYFP-NFSΔ1-56导致ECFP供体寿命τ₁ = 2.9±0.2 ns，约减少17%，与ECFP-EYFP融合结构相当(图5C). 相反，MOCS3 MoeBD ECFP/EYFP-NFS1Δ1-55对的ECFP供体寿命没有降低ECFP供体寿命，表明这些蛋白质不相互作用(图5C). 结果与上述数据一致，并证实了NFS1和MOCS3在HeLa细胞胞浆中的相互作用。此外，这些结果表明，相互作用位点是MOCS3的C端RLD体内.

SPR测量分析蛋白质相互作用

到目前为止，使用纯化的蛋白质，NFS1Δ1-55和单独表达的MOCS3-RLD之间显示出相互作用，因为此时不存在活性和稳定的MOCS3[31]在最近的一项研究中，我们成功地从Sf9细胞中纯化出活性MOCS3[26]为了分析NFS1Δ1-55和MOCS3的解离常数，利用SPR测量实时检测纯化蛋白的特定相互作用。

MOCS3和MOCS3-RLD通过胺偶联固定在CM5芯片上。我们使用纯化的NFS1Δ1-55、NFS1△1-55/ISD11和NFS1δ1-55作为结合伙伴^C381A型/ISD11。

变型NFS1Δ1-55^C381A型/ISD11显示为非活动状态。NFS1Δ1-55的表达式^C381A型不含ISD11的变体导致蛋白质沉淀，而不含ISD11的野生型在4°C下稳定两天（数据未显示）。

平均值K_D类蛋白质对的三个独立SPR测量值如下所示表2，而SPR结合曲线如图S3在补充信息中。数据表明，NFS1Δ1-55与固定化MOCS3与K相互作用_D类28.3±3.1 nM。当ISD11与NFS1Δ1-55复合时，对MOCS3的结合亲和力降低，显示K_D类值为119±4.7 nM。因此，ISD11和MOCS3可能在NFS1上具有重叠的结合位点。此外，K_D类MOCS3-RLD的值在相同范围内，表明NFS1可能与MOCS3的C端铑结构域相互作用。

平均值K_D类NFS1变量NFS1Δ1-55的值^C381A型/含MOCS3的ISD11为218.0±80.7 nM，含MOCS3-RLD的ISD1为241.0±35.5 nM。与NFS1Δ1-55/ISD11相比，平均K_D类数值仅略有下降。作为阴性对照，我们使用BSA和大肠杆菌IscS，显示与MOCS3无交互作用或大肠杆菌不能用1∶1结合模型评估的IscS结合曲线。这些使用在Sf9细胞中表达后纯化的MOCS3的结果证实了我们之前使用MOCS3-RLD和酵母Uba4发布的数据[31]，确认NFS1与MOCS3的C末端结构域的相互作用。

细胞培养维护

HeLa细胞在添加了10%胎牛血清（FBS，PAN-Biotech，德国）和谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM，PAN-Biotech，Germany）中培养。细胞培养物保持在37°C和5%CO的温度下₂大气。为了进行定位和FRET分析，HeLa细胞在转染前在聚赖氨酸涂层盖玻片上生长。

亚细胞分离和免疫印迹

为了分离可溶性蛋白和膜相关蛋白，HeLa细胞生长在至少6个75 cm²-大小的细胞培养瓶，直至80–90%汇合（至少50.4×10⁶细胞），通过胰蛋白酶收集，离心并用预先加热的PBS清洗一次。将新鲜收集的HeLa细胞重新悬浮并在4°C的冰镇细胞裂解缓冲液（10 mM Tris/HCl，pH 7.4，1.5 mM MgCl）中培养8分钟₂、10 mM KCl、250 mM蔗糖、1 mM DTT、1 mMEDTA、1 mM-EGTA、0.007%洋地黄素和蛋白酶抑制剂混合物），等于颗粒体积的30倍。将裂解液在1000×g和4°C下离心5 min。将对应于可溶性细胞溶质蛋白的裂解液上清液在100000×g下离心1 h和4°C，以去除残余膜，并将其指定为部分细胞溶质。使用10 kDa的分子量截止值，通过超滤将细胞溶质部分浓缩至少32倍。为了分离线粒体，按照Wieckowski的指示使用了HeLa细胞的优化方案等。 [63]为了获得核分数，我们遵循了Hinz的指示等。 [64].所有馏分在液氮中冷冻并储存在−80°C。

为了进行免疫印迹分析，在12%SDS-PAGE上分离组分的蛋白质并转移到PVDF膜上。用所示的一级抗体（1∶1000抗NFS1、1∶1000抗体MOCS3、1∶5000抗γ-肌动蛋白、1∶000抗ABCB7和1∶1000反柠檬酸合成酶）和过氧化物酶结合二级抗体（1:1000抗兔：Thermo；1∶5000抗鼠：Sigma）。使用增强化学发光（ECL）检测系统（Super Signal；Thermo，Pierce）开发印迹。以牛血清白蛋白（BSA）为标准物，用布拉德福德试剂测定样品中的蛋白质含量。

利用分裂EGFP系统研究亚细胞相互作用

利用pZM2、pZM4通过PCR扩增NFS1、NFS1Δ1-55、ISD11和MOCS3的编码区[31]和pZM13[26]作为模板，将获得的片段克隆到哺乳动物表达载体pEGFP中^1–157-N1和pEGFP^158–238-N1型[65]分别产生质粒pZM143、pZM44（MOCS3）、pZM145、pZM1046（NFS1）、pZM148（NFS1-Δ1-55）和pZM149（ISD11）(表1).

蛋白质C-末端融合到任一EGFP^1–157或EGFP^158–238并在HeLa细胞中表达。对于表达，HeLa细胞瞬时转染相应的质粒（参见表1)使用Lipofectamin®（Invitrogen）。线粒体和细胞核染色采用Mitotracker DeepRed®（Invitrogen）（1∶10000）和DAPI（Sigma）（1比1000）。转染后12 h，用4%多聚甲醛将细胞固定在PBS中40 min。用PBS清洗细胞两次，然后用Mowiol（Roth）将细胞固定到载玻片上。EGFP荧光图像使用共焦显微镜LSM710（德国耶拿卡尔蔡司显微镜）进行成像，该显微镜配备有EC Plan-Neofluar 40×Oil物镜，数值孔径（NA）为1.3。EGFP、DAPI和Mitotracker分别在488 nm、405 nm和633 nm处被顺序激发（多轨道模式）。分别在493–612 nm（EGFP）、413–560 nm（DAPI）和637–735 nm（Mitotracker）的发射光谱范围内以12位深度拍摄图像。成像软件ZEN2009用于操作系统和图像采集。使用ImageJ（MacBiophonics）程序进行处理。

亚细胞定位与FRET分析

对于Förster共振能量转移（FRET）分析和人类HeLa细胞与增强型黄色荧光蛋白（EYFP）或增强型青色荧光蛋白（ECFP）融合蛋白的细胞定位研究。利用pZM2、pZM4对NFS1、NFS1Δ1-55、ISD11、MOCS3、MOCS3-RLD和MOCS3-MoeB样结构域的编码区进行PCR扩增[31]，和pZM13作为模板，并克隆到哺乳动物表达载体pEYFP-N1、pECFP-N1，pEYFP-C1或pECFP-C1（克隆）中，用于FRET和亚细胞定位研究，分别得到相应的质粒pZM27（NFS1Δ1-55）、pZM30（NFS1）、pZM41（ISD11）、pZ M101（MOCS3-RLD）和pZ M154（MOCS3-4oeBD）(表1). 在pEYFP-C1中含有MOCS2A的质粒pMMC2如前所述[26]在定位研究中，如上所述对HeLa细胞进行染色和固定。使用PlanApo 1.4/63×Oil或EC Plan-Neofluar 1.3/40×Oil物镜，在共聚焦显微镜LSM710上拍摄图像。

EYFP和ECFP在514nm和458nm处依次被激发（多道模式）。在519–578 nm（EYFP）和462–510 nm（ECFP）的发射光谱范围内以12位深度拍摄图像。成像软件ZEN2009用于操作系统和图像采集。使用ImageJ（MacBiophonics）程序进行处理。

为了进行FRET分析，使用上文所述的改良磷酸钙方法瞬时转染HeLa细胞[26].FRET要求施主的发射光谱（此处为ECFP）和受主的吸收光谱（此处是EYFP）重叠。此外，FRET对必须具有紧密的空间邻近性和适当的方向。ECFP的施主荧光相对较暗，由于ECFP荧光的光谱渗出，受体的敏化发射很难检测到。因此，选择供体的荧光寿命作为监测FRET进行荧光寿命成像显微镜（FLIM）的参数。

对于FLIM，使用了基于倒置显微镜的Visitron Systems成像系统（Axio Observer Z1，Carl Zeiss Microscopy），该系统配备有Plan-NeoFluar 0.75/40×物镜。ECFP由带再生放大器（PL2201/TH，Ekspla）的锁模脉冲Nd-YAG激光器激励。第三个^第个355 nm和1 kHz重复频率下的谐波输出为30µJ/脉冲。Nd-YAG激光器的输出在没有准直光学的自由空间耦合到500µm石英纤维束中，然后耦合到显微镜中。在显微镜内，使用355nm二向色镜和400nm长通滤波器来分离激发光和荧光发射光。为了对ECFP和EYFP发射进行光谱分离，在探测器前面放置了一个双视图发射分离器（光度学），允许分析两个发射通道（485/30 nm、540/30 nm）。对于时间选通检测，使用了iCCD相机（Pimax2，普林斯顿仪器公司）。对于所有测量，采集了100帧，时间增量为0.25 ns，门宽为1.8 ns，以监测25 ns的总时间间隔。对于每个单帧，芯片上集成了250个脉冲。为了使iCCD相机与激光器同步，激光器的Q开关监视器输出用于触发CCD控制单元的TTL输入。

使用多点共焦扫描仪（Infinity 3，VisiTech）获取相应的参考图像，该扫描仪也连接到成像系统。样品用Ar-Kr离子激光器（Innova 70C，Coherent）在456nm（对于ECFP）或514nm（对于EYFP）激发，图像由CoolSnap HQ记录²CCD摄像机（光度学）。

使用WinView 2.5（Roper Scientific）和Metamorph 7.2（Molecular Devices）进行数据采集和处理。对于每个样品N = 测量30-42个细胞。FRET的效率是通过测量ECFP的荧光供体寿命（τ_D类)，并且在受体（τ_陆军部). 衰变曲线以双指数拟合，其中包含长寿命成分τ₁τ的短寿命₂两个τ的_D类和τ_陆军部（单位：ns）。

表面等离子体共振（SPR）测量

所有结合实验均在基于SPR的Biacore上进行^TM（TM）使用T200评估软件在25°C温度和30µL/min流量下在CM5传感器芯片上安装T200仪器（GE，Uppsala，瑞典）。在整个测量过程中，将装有样品的自动进样器支架冷却至8°C。三个独立实验中每个流动细胞固定蛋白质的响应单位（RU）在400-600之间。作为流动缓冲液，使用20 mM磷酸盐、150 mM氯化钠、0.005%（v/v）吐温20、pH 7.4。以30µL/min的流速注射浓度为0.31、0.63、1.25、2.5、5和10µM的NFS1Δ1-55和NFS1△1-55/ISD11变体4.5 min，然后使用kinject命令分离15 min，用20 mM HCl再生传感器表面1 min。作为对照，另外固定BSA并大肠杆菌使用IscS和BSA作为附加分析物。通过减去两个流动池的缓冲液注入曲线来校正结合曲线。

我们感谢Erik Lee Snapp和Patrick Lajoie，他们善意地提供了分裂的EGFP向量（美国纽约州阿尔伯特爱因斯坦学院）。我们感谢Ralph Gräf（波茨坦大学）在共焦荧光显微镜方面的帮助。ECFP-EYFP融合质粒由Sebastian Bandholtz（Charite Berlin）提供。我们感谢Ursula-Müller Theißen克隆质粒pUMT13。我们还感谢Angelika Lehmann（波茨坦）提供的技术援助。