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.2006年1月11日；25（1）：174-83。
doi:10.1038/sj.emboj.7600905。 Epub 2005年12月8日。

Nfs1相互作用蛋白Isd11在线粒体Fe/S簇生物发生中起着重要作用

亚历山大·亚当 1, 卡斯滕·博恩霍夫（Carsten Bornhövd）, 霍尔格·普罗基什, 沃尔特·诺佩特, Kai地狱
附属公司

Nfs1相互作用蛋白Isd11在线粒体Fe/S簇生物发生中起着重要作用

亚历山大·亚当等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

铁/硫（Fe/S）簇的形成、蛋白质移位和蛋白质折叠是酿酒酵母线粒体的基本过程。在一种系统化方法中，我们鉴定了参与这些过程的必需蛋白质，并鉴定出线粒体基质的一种新的必需蛋白质。这种蛋白质从酵母到人类都高度保守，我们称之为Isd11。Isd11的耗尽导致Fe/S蛋白乌头酸酶和Rieske蛋白的水平显著降低，乌头酸酸酶和琥珀酸脱氢酶的酶活性显著降低。在没有Isd11的情况下，铁并入Fe/S蛋白Leu1和包含线粒体铁氧还蛋白Yah1完整形式的Fe/S簇的形成受到抑制。这强烈表明Isd11是Fe/S蛋白质组装所必需的。我们发现Isd11与Nfs1形成稳定的复合物，Nfs1是Fe/S簇组装线粒体机制的半胱氨酸脱硫酶。在没有Isd11的情况下，Nfs1容易聚合。我们认为Isd11与Nfs1在Fe/S蛋白生物生成的早期阶段共同作用。

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数字

图1
图1
Isd11是线粒体基质的一种蛋白质(A类)不同物种Isd11蛋白的序列比对。使用ClustalX（1.8）生成路线。至少四种对齐蛋白质中相同的氨基酸残基以黑色显示，类似残基以灰色显示：酿酒酵母(Sc公司),S.pombe公司(服务提供商),N.克拉萨(编号),智人(Hs公司)和D.黑腹果蝇(Dm公司). (B类)Isd11位于线粒体中。酵母细胞被亚分馏，等量的蛋白质被SDS–PAGE处理，并用Isd11、胞浆蛋白（Bmh2）、ER蛋白（Erp1）和线粒体蛋白（Mge1）抗体进行免疫修饰。(C类)Isd11位于线粒体基质中。分离的线粒体、通过渗透性休克制备的有丝分裂体和Triton固体化的线粒体分别用蛋白酶K（PK）或不用蛋白酶K处理。对线粒体进行碳酸盐提取，分离上清液（S）和沉淀（P）部分。样品通过SDS-PAGE分析，并使用针对所示蛋白的抗体进行免疫修饰。(D类)Isd11附着在内膜上。将WT线粒体重新悬浮在含有不同浓度KCl的缓冲液中，并通过超声波打开。含有可溶性蛋白质的上清液组分（Sup）和膜组分通过离心分离。通过TCA沉淀法收集上清液部分中的蛋白质。将Laemmli缓冲液添加到这两个组分中，并进行SDS-PAGE和免疫修饰，以获得针对Isd11、线粒体脱硫酶Nfs1、内膜蛋白（ADP/ATP载体，Aac2）和基质蛋白（Mge1）的抗体。(E类)Isd11以膜电位依赖的方式输入到分离的线粒体中。含网织红细胞裂解物35在存在或不存在膜电位ΔΨ的情况下，将S标记的Isd11与线粒体孵育。导入后，如图所示，在等渗或低渗肿胀（Sw）条件下分离线粒体并用PK或不用PK处理。样品通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。50%输入，每条车道使用的裂解液量的50%。
图2
图2
酵母细胞中Isd11的下调影响细胞生长，但不影响线粒体导入前蛋白的能力。(A类)携带国际标准D11受控制的基因镀锌10启动子和WT细胞在富含半乳糖（YP-Gal）或葡萄糖（YP-D）的培养基上培养2轮。(B类)GAL10-ISD11细胞和WT细胞首先在半乳糖上生长，然后在含有葡萄糖的培养基中培养指定时间。在时间零点，单元格编号设置为1。(C类)线粒体前体蛋白的进口不需要Isd11。TIM23复合途径（pSu9（1-69）DHFR）和TIM22复合途径（AAC）的放射性标记前体蛋白导入WT线粒体和Isd11（Isd11）缺失的线粒体↓) 针对不同的时间段。再次分离线粒体，进行PK或不进行PK治疗，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。在对线粒体进行PK处理后，对蛋白质的成熟形式进行定量。在最长时间点导入WT线粒体的量设定为100%（对照）。p、 前驱体形态；m、 成熟形式。
图3
图3
Isd11的下调影响含FeS簇蛋白的水平和活性。(A类)将GAL10-ISD11细胞转移至含葡萄糖培养基后，在30°C下培养12、18和24小时。从这些细胞和WT细胞中分离出的线粒体（100μg）的蛋白质水平通过SDS-PAGE和针对所示蛋白质的抗体的免疫修饰进行分析。(B类)从WT细胞和Isd11（Isd11）下调的细胞分离的线粒体中测定SDH和乌头糖（Aco）的活性↓) 对于指定的时间段。作为标准，测量非FeS簇合蛋白MDH。计算乌头酶和MDH或SDH和MDH的活性的比率，并将其表示为WT细胞中该比率的百分比。(C类)体内在没有Isd11的情况下，细胞质Leu1蛋白的Fe/S簇的组装受到抑制。GAL-Isd11细胞在含有葡萄糖的培养基中生长18 h，从而耗尽Isd11。这些细胞和WT细胞与55制备细胞裂解物，并用抗Leu1抗体进行免疫沉淀。合并55液体闪烁计数法测定Leu1中的铁。插图显示了这些细胞裂解物中存在的Leu1和Isd11的免疫染色。(D类)holoYah1的形成依赖于Isd11。这个35将Yah1的S标记前体蛋白导入WT和Isd11的线粒体↓ 电池在25°C下放置10分钟。通过添加安定霉素停止输入反应，并在指定的时间段（“阶段”）内进一步培养。取等分样品，用PK处理去除非进口前体蛋白。样品通过天然凝胶电泳和放射自显影术进行分析。在指定的时间点，对apo-和holoYah1的量进行量化，并将它们的比率表示为两种形式总和（总计）的holoYah百分比。(E类)测定从WT和Isd11下调细胞分离的100μg线粒体的铁含量。
图4
图4
Isd11存在于带有Nfs1的复合体中。(A类)Nfs1与His-tagged Isd11的共分离。用DDM溶解WT细胞或表达Isd11的细胞的分离线粒体，并用NiNTA珠培养。结合物通过SDS-PAGE和考马斯染色进行洗脱和分析。通过质谱鉴定Nfs1和Isd11。(B类)Nfs1与Isd11的铜提纯。用洋地黄素溶解WT菌株和携带三重HA标记Isd11菌株的线粒体。澄清旋转后，将上清液与与蛋白A-Sepharose珠结合的HA标签抗体孵育。收集珠子，清洗并用Laemmli缓冲液洗脱结合蛋白。通过SDS–PAGE和针对Nfs1和Isd11的抗体的免疫修饰对样品进行分析。总的来说，装载了10%的总量和上清液。f、 Nfs1片段。(C类)Isd11和Nfs1的共免疫沉淀。用DDM溶解WT线粒体。使用针对Nfs1或Isd11的抗体，按照（B）中的方法进行联合免疫沉淀并进行分析。(D类)Isd11和Nfs1在凝胶过滤柱上共分馏。线粒体膜在250 mM KCl存在下通过超声波打开。旋转澄清后，将上清液置于Superose-12凝胶过滤柱中。通过SDS-PAGE和抗Isd11和Nfs1抗体的免疫修饰分析组分。
图5
图5
Isd11缺失线粒体中的Nfs1具有脱硫酶活性，但容易聚集。(A类)线粒体（25、50、100μg）中Nfs1的蛋白质水平，从Isd11耗竭18小时的细胞（Isd11）中分离出来↓) 用SDS-PAGE和免疫印迹法对WT细胞进行分析。(B类)Nfs1在缺乏Isd11的细胞中聚集。将从WT和Isd11缺失细胞中分离的线粒体在0或37°C下培养20分钟。用0.5%Triton X-100溶解线粒体，并通过离心法造粒聚集材料。总级分和上清液级分（Sup）用TCA沉淀。样品通过SDS-PAGE和免疫修饰进行分析。(C类)在没有Isd11的情况下，Nfs1具有脱硫酶活性。WT和Isd11的线粒体（100μg）↓ 用0.2%DDM溶解细胞，然后在含有5 mM DTT和4 mM半胱氨酸的缓冲液中在30°C下培养30分钟。将产生的硫化物转化为亚甲基蓝，在667nm处测量其吸收。通过在不含半胱氨酸的情况下培养线粒体提取物来测定背景活性并减去。脱硫酶活性表示为WT线粒体中的活性百分比。
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