The eukaryotic P loop NTPase Nbp35: an essential component of the cytosolic and nuclear iron-sulfur protein assembly machinery

doi:10.1073/pnas.0406447102

.2005年3月1日；102(9):3266-71.

doi:10.1073/pnas.0406447102。 Epub 2005年2月22日。

真核生物P环NTPase Nbp35：胞浆和核铁硫蛋白组装机制的重要组成部分

安贾·奥斯曼¹, Daili J Aguilar Netz公司, 詹妮克·巴尔克, 安东尼奥·皮尔里克, 乌尔里希·穆伦霍夫, 罗兰·里尔

附属公司

PMID： 15728363
预防性维修识别码：第52912页
内政部： 10.1073/pnas.0406447102

真核生物P环NTPase Nbp35：细胞溶质和核铁硫蛋白组装机器的重要组成部分

安贾·奥斯曼等。美国国家科学院程序. 2005.

.2005年3月1日；102(9):3266-71.

doi:10.1073/pnas.0406447102。 Epub 2005年2月22日。

作者

安贾·奥斯曼¹, Daili J Aguilar Netz公司, 詹妮克·巴尔克, 安东尼奥·皮尔里克, 乌尔里希·穆伦霍夫, 罗兰·里尔

附属

¹德国马尔堡，罗伯特·科赫大街6号，邮编：35033。

PMID： 15728363
预防性维修识别码：项目编号：C552912
内政部： 10.1073/pnas.0406447102

摘要

可溶性P环NTP酶是一个大蛋白家族，参与多种细胞功能。在此，我们对该家族Mrp/Nbp35亚分支的第一个成员，即酿酒酵母的必需Nbp35p进行了功能表征。该蛋白位于胞浆和细胞核中，在其N末端携带Fe/S簇。铁硫簇的组装需要线粒体铁硫簇（ISC）组装和出口机械。Nbp35p的耗尽会严重损害细胞溶质Fe/S蛋白、异丙基苹果酸异构酶（Leu1p）的活性，而线粒体Fe/S酶则不受影响。此外，在缺乏Nbp35p的情况下，观察到各种细胞溶质和核Fe/S蛋白的从头成熟缺陷，表明Nbp35p在线粒体外Fe/S蛋白质的生物发生中的功能参与。此外，Nbp35p与极为相似的P环NTPase、Cfd1p和类似氢化酶的Nar1p在基因上相互作用，这两种酶最近被证明在细胞溶质和核Fe/S蛋白的生物生成中发挥关键作用。因此，我们的研究表明，真核生物Nbp35 NTPases在Fe/S蛋白成熟中起作用。这些发现为存在一种高度保守的、用于组装胞浆和核Fe/S蛋白的基本机制提供了有力证据。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
Nbp35p N末端的Fe/S簇结合需要功能性线粒体ISC机制。(A类)在添加半乳糖（Gal）或葡萄糖（Glc）的铁粉最小培养基中培养16小时，野生型细胞从载体p426-NBP35-TAP过度产生TAP标记版本的Nbp35p（+）或Nbp35pΔ1-52（Δ1-62），以及携带质粒p426GPD（-）的对照细胞⁵⁵Fe处理4小时，并制备细胞裂解物。用IgG从裂解液中免疫沉淀TAP标记的Nbp35p蛋白，共免疫沉淀量⁵⁵铁通过液体闪烁计数定量。(B类)生长过度产生Nbp35p-TAP的Gal-NFS1和Gal-YAH1细胞A类分别允许或抑制，*NFS1型*和亚1表达式。随后，⁵⁵如上所述，研究了铁与Nbp35p-TAP的结合。(C类)将过度产生Nbp35p-TAP的Gal-ATM1细胞作为A类、和⁵⁵测定了铁与Nbp35p-TAP和内源性Leu1p的结合。插图显示细胞提取物中指示蛋白的免疫染色。

**图2。**
纯化Nbp35p是一种Fe/S蛋白质。用商用幻灯机照射3分钟，在（OX）和（DAF）光还原之前和之后，N-末端His-tagged Nbp35p（1.9 mg/ml/50 mM Tris·HCl，pH 8/1μM 5′-脱氮黄素）的UV-vis光谱。扣除了光还原前氧化的5′-脱氮黄素对光谱的贡献。插入显示了五个独立样品的比色铁和酸溶性硫化物测定结果。

**图3。**
的过度表达*国家统计局第35页*和*NAR1公司*抑制Cfd1p缺失的Gal-CFD1细胞的生长。(A类)用高拷贝质粒p424-NBP35和p426-CFD1-HA或空载体（-）转化Gal-NBP35细胞和Gal-CFD1细胞以过度表达*国家统计局第35页*和*CFD1公司*在*TDH3型*如图所示。将十倍系列稀释的细胞培养在添加半乳糖或葡萄糖的固体最小培养基上，在30°C下培养两次，共培养3天。(B类)用编码所示基因的高拷贝载体转化的Gal-CFD1细胞按照A类.

**图4。**
Nbp35p是细胞质和细胞核中Fe/S蛋白成熟所必需的，但线粒体中不需要(A类)在含有半乳糖（Gal）或葡萄糖（Glc）的铁-贫最小培养基中培养过度产生HA标记Rli1p和Nar1p的Gal-NBP35细胞。细胞被标记为⁵⁵铁和溶血，并使用抗HA或抗Leu1p抗体免疫沉淀放射性标记蛋白。共免疫沉淀⁵⁵铁通过液体闪烁计数定量。(B类和C类)野生型（WT+）和Gal-NBP35细胞过度产生HA-taged（HA）版本的Ntg2p(B类)或线粒体Bio2p(C类)和携带载体p426GPD的野生型细胞（WT-；B类)用无线电标记⁵⁵允许（Gal）和抑制（Glc）条件下的Fe。如上所述，通过免疫沉淀法测定与Ntg2p和Bio2p的铁结合。插图显示细胞提取物中指示蛋白的免疫染色。

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