Distinct iron-sulfur cluster assembly complexes exist in the cytosol and mitochondria of human cells

doi:10.1093/emboj/19.21.5692

.2000年11月1日；19（21）：5692-700。

doi:10.1093/emboj/19.21.5692。

人类细胞的胞浆和线粒体中存在独特的铁硫簇合物

W H动力钳¹, T鲁奥

附属公司

PMID： 11060020
预防性维修识别码：项目经理305809
内政部： 10.1093/emboj/19.21.5692

人类细胞的胞浆和线粒体中存在独特的铁硫簇合物

W H动力钳等。欧洲工商管理硕士J. 2000.

.2000年11月1日；19(21):5692-700.

doi:10.1093/emboj/19.21.5692。

作者

W H动力钳¹, T鲁奥

附属

¹美国马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所细胞生物学和代谢分所，邮编：20892。trou@helix.nih.gov

PMID： 11060020
预防性维修识别码：项目经理305809
内政部： 10.1093/emboj/19.21.5692

摘要

铁硫簇是存在于许多蛋白质中的辅因子，具有重要的氧化还原、催化或调节功能。在哺乳动物细胞中，几乎所有已知的Fe-S蛋白都存在于线粒体中，但至少有一种存在于胞质溶胶中。在这里，我们报道了对IscU和NifU的人类同源物的克隆，这两种铁结合蛋白在细菌的Fe-S簇组装中起着关键作用。在人类细胞中，常见前mRNA的选择性剪接导致两种蛋白质的合成，这两个蛋白质在N末端不同，并且定位于胞浆（IscU1）或线粒体（IscU 2）。生化分析表明，IscU蛋白与IscS特异性结合，IscS是一种半胱氨酸脱硫酶，被提议用于隔离无机硫以进行Fe-S簇合。线粒体和细胞质中都可以发现含有IscU和IscS的蛋白质复合物，这意味着Fe-S簇在哺乳动物细胞的多个亚细胞隔室中发生组装。本文讨论了IscU蛋白在哺乳动物细胞中的可能作用以及Fe-S簇合物分区的潜在意义。

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数字

**图1。**人的分子克隆和序列分析*iscU（国际标准化组织）*. (A类)与酵母Isu1和Isu2相比，两种人类IscU亚型的预测氨基酸序列。通过EST数据库分析和5′RACE实验获得了人缺血再灌注损伤的cDNA序列。对5′RACE产物、EST和基因组数据库的序列分析显示，IscU2 N端密码子7（G或F）和密码子12（V或A）存在多态性。这里只显示了一个变量。(B类)人类5′端基因组序列*iscU（国际标准化组织）*通过PCR和EST数据库分析获得。

**图2。**替代拼接*iscU（国际标准化组织）*前mRNA产生两种具有不同预测N末端序列的亚型。(A类)的示意图*iscU1*和*iscU2接口*5′cDNA末端。使用帽结合引物，结合*iscU（国际标准化组织）*基因特异性引物。序列分析表明*iscU1*和*iscU2接口*是替代拼接产品。(B类)使用外显子III内的3′引物与外显子IA或外显子IB特异性的5′引物组合进行5′RACE片段的巢式PCR。使用外显子IA、外显子IB或内含子IB探针进行Southern blot分析。箭头表示根据预期大小的条带*iscU1*和*iscU2接口*mRNA序列。星号表示包含内含子序列的带，由剪接中间产物衍生而来。(C类)poly（A）的Northern印迹分析⁺用外显子IA、外显子IB或内含子IB探针从RD4细胞和人心脏（Clontech）中提取RNA。箭头表示根据预期大小的条带*iscU1*和*iscU2型*mRNA序列。星号表示拼接中间产物。(D类)人类多组织北方印迹（Clontech）显示*iscU（国际标准化组织）*,*iscS公司*和*国际证券交易委员会*都主要在心脏和骨骼肌中表达。

**图3。**IscU1定位于胞浆和细胞核，而IscU2定位于线粒体。用单克隆抗HA抗体对转染HA标记IscUl的COS细胞进行染色，并用免疫荧光显微镜进行分析(A类)和相位对比显微镜(B类)。(C类)用单克隆抗myc抗体对转染myc标记的IscU2的COS细胞进行染色，并用免疫荧光显微镜进行分析。(D类)线粒体标记罗丹明123对转染COS细胞进行线粒体染色，如（C）所示。短箭头表示转染细胞，而长箭头表示未转染细胞。

**图4。**IscU2蛋白被快速处理，成熟后与～47kDa蛋白相关。(A类)全长IscU2结构和IscU1Δ35的示意图，该结构缺乏假定加工位点的序列5′。(B类)用编码全长myc标记的IscU2的构建物转染COS细胞，用脉冲标记[³⁵S] 甲硫氨酸3分钟，并分别追服0、15、60和300分钟。单克隆抗myc抗体的免疫沉淀表明IscU2蛋白的处理分两步进行。体外myc标记的IscU2Δ35的翻译产生一种蛋白，该蛋白与转染COS细胞中处理过的IscU2共同迁移。在60和300分钟的时间点，47kDa带（箭头）与缺血再灌注联合免疫沉淀。

**图5。**内源性IscU蛋白存在于RD4细胞的胞浆和线粒体中。(A类)免疫沉淀实验揭示了RD4细胞中多种形式的内源性IscU蛋白。使用亲和纯化的抗IscU肽抗体2934和2677进行免疫沉淀。为了进行比较，显示了重组IscU1（rIscU2Δ35）和重组IscUΔ35的Western blot分析。(B类)使用抗IscU 2934免疫沉淀RD4细胞裂解物不同亚细胞组分中的内源性IscU蛋白。(C类)RD4细胞裂解物不同亚细胞组分内源性IscU蛋白的Western blot分析。线粒体顺乌头酸酶和细胞溶质IRP1的Western blot分析用于比较。

**图6。**RD4细胞胞浆和线粒体中IscU和IscS蛋白的共免疫沉淀。(A类)RD4 Triton裂解物中线粒体IscS与IscU的共免疫沉淀。线粒体IscU–IscS复合物首先从[³⁵S] 使用α-IscS或α-IscU 2934的甲硫氨酸标记的RD4细胞裂解物。在用SDS-DTT将免疫沉淀物从抗体中分离出来并加热后，使用α-IscS进行第二次免疫沉淀（再捕获）。(B类)细胞溶质IscU1与一种细胞溶质IscS蛋白（IscS）共同免疫沉淀c（c）)以及线粒体IscU2与线粒体IscS（IscS米)在RD4细胞裂解物中（上面板）。下部面板显示了含有高对比度细胞溶质和膜细胞器组分的通道，以便更好地显示和对齐细胞溶质IscS带。

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1. Askwith C.和Kaplan，J.（1998）酵母中的铁和铜运输及其与人类疾病的相关性。生物化学趋势。科学。，23, 135–138.-公共医学
1. Babcock M.、de Silva，D.、Oaks，R.、Davis-Kaplan，S.、Jiralerspong，S.，Montermini，L.、Pandolfo，M.和Kaplan、J.（1997）Yfh1p对线粒体铁积累的调节，Yfh1是frataxin的假定同源物。《科学》，2761709-1712。-公共医学
1. Beinert H.和Holm，R.H.（1997）《铁-硫簇：自然界的模块化多用途结构》。科学，277653-659。-公共医学

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[10] Beinert H.和Holm，R.H.（1997）《铁-硫簇：自然界的模块化多用途结构》。科学，277653-659。-公共医学

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