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.2004年5月19日；23(10):2105-15.
doi:10.1038/sj.emboj.7600216。 Epub 2004年4月22日。

类氢化酶Nar1p对细胞溶质和核铁硫蛋白的成熟至关重要

詹妮克·巴尔克 1, 安东尼奥·皮尔里克, Daili J Aguilar Netz公司, 乌尔里希·穆伦霍夫, 罗兰·里尔
附属公司

类氢化酶Nar1p对细胞溶质和核铁硫蛋白的成熟至关重要

詹妮克·巴尔克等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

酿酒酵母的基因组编码基本蛋白Nar1p，该蛋白在几乎所有真核生物中都是保守的，与细菌的铁氢化酶具有惊人的序列相似性。之前研究表明，Nar1p的人类同源物在细胞核中结合了戊二醛化前胺A。然而，酵母既没有表现出氢化酶活性，也不包含核胺。在这里，我们证明Nar1p主要位于胞浆中，并包含两个相邻的铁硫（Fe/S）簇。其Fe/S簇的组装关键取决于线粒体Fe/S束生物合成装置的成分，如半胱氨酸脱硫酶Nfs1p、铁氧还蛋白Yah1p和ABC转运蛋白Atm1p。通过体内功能研究，我们发现Nar1p是细胞溶质和核成熟所必需的，而不是线粒体Fe/S蛋白的成熟所必需。缺乏Nar1p的细胞不会在线粒体中积累铁，从而将这些细胞与线粒体Fe/S簇生物合成装置组成部分的突变体区分开来。总之，Nar1p代表了新兴的细胞溶质Fe/S蛋白组装机制的一个关键的新组成部分，该组装机制可催化真核生物中一个重要而古老的过程。

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数字

图1
图1
Nar1p样蛋白和纯铁氢化酶的序列比对。Nar1p-like蛋白的多序列比对，脱硫弧菌HydA和HydC以及梭状芽孢杆菌CpI氢化酶是使用Multalin程序进行的（Corpet，1988）。保守的半胱氨酸残基以黄色和青色突出显示（氢化酶特异）。指示了铁氢化酶中与H簇配合的半胱氨酸残基（H）。生物体缩写：Sc，酿酒酵母; Sp中，葡萄裂殖酵母; Hs、，智人; 嗯，小家鼠; 在，拟南芥; 内容提供商；巴氏梭菌; 数字电视；普通脱硫弧菌.
图2
图2
纯化Nar1p的光谱分析。(A类)的吸收光谱斯特雷普-将Nar1p（1.6μM）标记为已分离，并在含有40μM脱硫生物素的缓冲液TNE（100 mM Tris–HCl，pH 8，150 mM NaCl，1 mM EDTA）中用1 mM连二亚硫酸钠还原后。(B类)在以下条件下记录重组Nar1p的EPR谱：微波频率9.460±0.001GHz；调制频率，100 kHz；调制幅度1.25 mT.（a）Nar1p（50μM）在缓冲液TNE中用5 mM连二亚硫酸钠和1 mM脱硫生物素（0.80 mW，10 K）降低。（b） 如（a）所示，但在200 mW，10 K下记录。（c）通过从a中减去适当的谱强度b而获得的尖锐菱形EPR信号。（d）谱c的理论模拟（Beinert和Albracht，1982）。模拟参数，克z（z）=2.022,克年=1.926和克x个=1.823; 线宽分别为2.5、3.0和3.1 mT。为了进行比较，添加了微量（e–h），并对Nar1p实验的微波频率进行了适当的磁场校正。（e） [2Fe–2S]1+还原菠菜叶铁氧还蛋白的聚类（Hagen和Albracht，1982）。（f） [4Fe–4S]1+部分连二亚硫酸钠诱导的异二硫还原酶中的簇马尔堡甲烷热杆菌（9.459 GHz，20 mW，30 K；由R Hedderich博士（马尔堡陆地微生物MPI）提供。（g） 两个相互作用的[4Fe–4S]1+全还原铁氧还蛋白中的簇发酵酸氨球菌（9.65 GHz，2 mW，12 K；Thamer等, 2003). （h） 经处理的硫堇中的氧化h-簇巴氏杆菌铁氢化酶CpI（9.23 GHz，10 mW，20 K；Adams，1987）。
图3
图3
酵母NAR1公司是一种基本基因，不能被其人类同源物取代。(A类)野生型（WT）和Gal-NAR1细胞在添加半乳糖（Gal）的富液培养基中生长，半乳糖是半乳糖和葡萄糖（Ga/Gl）或葡萄糖（Glu）的1:1混合物。使用抗Nar1p抗血清对碱解制备的总细胞提取物进行Nar1p免疫染色。57kDa的次要带可能代表成熟Nar1p的分解产物。(B类)将野生型和Gal-NAR1细胞在30°C下在含有补充有半乳糖（YPGal）或葡萄糖（YPD）的富培养基的琼脂平板上生长2×2天。显示了10倍的连续稀释。(C类)用质粒p416MET25转化Gal-NAR1细胞，该质粒不含插入物（−）、酵母NAR1公司基因，或人类的基因NARF公司和HPRN公司细胞在YPD培养基上生长2×2天，30°C（左）。用半乳糖培养的细胞携带（1）酵母质粒，通过RT-PCR检测人类基因的表达NAR1公司, (2)NARF公司和（3）HPRN公司基因。在没有逆转录酶的情况下进行对照反应。
图4
图4
Nar1p的亚细胞定位。(A类)现场Nar1p的本地化。用含有NAR1公司或者没有基因。对数期细胞用2.4%（w/v）甲醛固定，渗透并用纯化的抗Nar1p（αNar1p）或单克隆抗Pgk1p（γPgg1p）抗体标记，然后用荧光结合二级抗体（绿色）标记。DNA用DAPI复染，用红色表示NAR1公司插入低拷贝表达载体p416MET25。(B类)细胞组分中Nar1p的免疫印迹分析。对数期野生型细胞转化为球形体（Sph），进行Dounce匀浆，去除完整细胞和细胞碎片后，在12000℃离心10分钟，将提取物分离为线粒体后上清液（PMS）和粗线粒体（CM）克用从载体p426-NAR1过度产生Nar1p的细胞进行类似的分级。使用单独的野生型酵母培养物通过Ficoll梯度离心分离细胞核（Nuc）（Aris和Blobel，1991）。用SDS–PAGE分离等量的蛋白质（20μg/条），对Nar1p或已知细胞定位的标记蛋白进行印迹和免疫染色（左面板；胞浆磷酸甘油酸激酶Pgk1p；线粒体ATP/ADP载体Aac2p；内质网转座子亚基Sec61p；核DNA聚合酶相关Pol30p）。粗线粒体部分在Nycodenz分级颗粒上进一步分离为含有富集线粒体（Mit）和微粒体膜（Mem）的部分。样本通过免疫染色进行分析（右侧面板；Mge1p；线粒体基质）。
图5
图5
Nar1p上的Fe/S簇组装依赖于线粒体ISC机制。(A类)用质粒p426-NAR1（NAR1）转化野生型和半乳糖可调节的Gal-NFS1、Gal-YAH1和Gal-ATM1细胞↑) 或空矢量p426（−）。细胞在添加半乳糖（Gal）或葡萄糖（Glu）的铁盐培养基中生长24小时。细胞用放射标记55Fe，并被Triton X-100缓冲液中的玻璃珠打碎。通过免疫沉淀法从细胞提取物中分离出Nar1p55通过闪烁计数定量与Nar1p相关的铁。通过细胞提取物的免疫染色显示所示蛋白质。(B类)将指示的过度产生Nar1p的细胞生长40小时，并如（A）中所述分析细胞提取物。
图6
图6
Nar1p是胞质Fe/S蛋白成熟所必需的，而线粒体Fe/S蛋白质则不需要。(A类)野生型和Gal-NAR1细胞在添加半乳糖（Gal）或葡萄糖（Glu）的最小培养基中生长。在总细胞提取物中评估了细胞溶质苹果酸异丙酯异构酶（Leu1p）的酶活性。通过免疫印迹分析（inset）测定Gal-NAR1细胞中Leu1p和Nar1p的水平。(B类)Gal-NAR1细胞在添加半乳糖或葡萄糖的铁盐培养基中生长。用携带HA标记的细胞溶质Rli1p或线粒体Bio2p基因的高拷贝质粒转化细胞。放射性标签55如图5所示，进行铁、细胞提取物的制备和感兴趣的铁/硫蛋白的免疫沉淀。对于Leu1p，分析内源性蛋白质。结果显示为55Nar1p缺失（葡萄糖生长）细胞和Nar1p-表达（半乳糖生长）细胞中的Fe掺入，校正为小背景（小于半乳糖培养细胞总信号的2%）。通过免疫印迹分析（下面板）测定指示蛋白质的蛋白质水平，并通过密度测定法（上面板）量化。(C类)在含有半乳糖或乳酸（Lac）的最小培养基中生长后，从野生型或Gal-NAR1细胞分离的线粒体中测定顺乌头酸酶和琥珀酸脱氢酶（DH）的酶活性（单位：U/mg线粒体蛋白）。
图7
图7
核Fe/S蛋白Ntg2p的成熟依赖于Nar1p功能。野生型或Gal-NAR1细胞通过编码HA-taged版本Ntg2p的高拷贝质粒（p426-NTG2-HA）进行转化。(A类)如图4A所示，通过免疫荧光对过度产生的HA标记Ntg2p进行定位。(B类)细胞在半乳糖（Gal）或含葡萄糖（Glu）铁缺乏最小培养基中生长后，通过以下方法测量Ntg2p的成熟度55如图5A所示，通过免疫沉淀与抗HA抗体掺入Fe。用缺乏HA标记Ntg2p（−）的细胞进行对照免疫沉淀。插图显示Gal-NAR1细胞提取物中Ntg2p-HA和Nar1p的免疫染色。
图8
图8
Nar1p的耗尽不会导致线粒体中的铁蓄积。野生型Gal-NAR1和Gal-ATM1细胞在含有半乳糖（Gal）的最低培养基或乳酸培养基（Lac）中培养40小时。分离线粒体并测定总铁含量。
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