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.2003年8月19日；100(17):9762-7.
doi:10.1073/pnas.1732541100。 Epub 2003年7月28日。

人Nfu（一种铁硫簇支架蛋白）的亚细胞分区及其组装[4Fe-4S]簇的能力

永亨通 1, 盖伊·N·L·詹姆逊, Boi Hanh Huynh公司, 特蕾西·鲁奥
附属公司

人Nfu（一种铁硫簇支架蛋白）的亚细胞分区及其组装[4Fe-4S]簇的能力

永亨通等。 美国国家科学院程序. .

摘要

铁硫（Fe-S）簇在许多具有重要氧化还原、催化和调节功能的蛋白质中充当辅因子。在细菌中，铁硫簇的生物生成是由isc和nif操纵子编码的多个基因产物介导的。特别是，遗传和生物化学研究表明，IscU、Nfu和IscA作为支架蛋白发挥作用，用于组装和传递基本的Fe-S簇到靶蛋白。在这里，我们报告了人类Nfu的特征。生化和光谱技术的结合，包括紫外可见吸收和57Fe Mössbauer光谱，已用于研究纯化的人Nfu组装Fe-S团簇的能力。结果表明，Nfu每两个Nfu单体可以组装大约一个活性[4Fe-4S]簇，并支持Nfu是一种用于组装簇的替代支架蛋白，随后用于靶向Fe-S蛋白的成熟。对基因组DNA、转录物和翻译产物的分析表明，常见前体mRNA的选择性剪接导致两种具有不同亚细胞定位的Nfu亚型的合成。异型体I定位于线粒体，而异型体II存在于细胞质和细胞核中。这些结果，再加上以前关于人IscS和IscU亚型在线粒体、细胞质和细胞核中的亚细胞分布的报道，表明Fe-S簇组装机制在高等真核生物中是分区的。

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数字

图1。
图1。
替代拼接核燃料元件前mRNA产生两种亚型不同的翻译起始点。(A类)预测的序列两种人类Nfu亚型。方框区域表示编码序列。请注意HIRIP5型先前报告于8月3日开始。这个星号表示火焰中的终止密码子仅存在于亚型II中成绩单。(B类)替代品使用机制示意图外显子I的5′剪接位点核燃料元件生成两种亚型不同的翻译起始位点（AUG1或AUG2）。(C)凝胶用两种方法获得的RT-PCR DNA片段的电泳分析不同的底漆组。箭头表示从亚型I扩增的片段，星号表示从亚型II扩增的片段。
图2。
图2。
Nfu亚型I定位于线粒体，而亚型II定位于线粒体到胞浆和细胞核。(A类)的示意图核燃料元件用于的构件在体外翻译和COS-7细胞转染。(B类)转染含有任一亚型的构建物的COS-7细胞用兔多克隆抗体对Nfu（α-Nfu）进行I或亚型II染色4333）和免疫荧光显微镜分析。箭头表示转染细胞。线粒体用MitoTracker 633染色，细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。
图3。
图3。
内源性Nfu蛋白存在于胞浆、线粒体和RD4细胞的细胞核。(A类)亚细胞蛋白质印迹分析使用α-Nfu 4333和α-Nfu-（MAP）的RD4细胞裂解产物的组分4337.核蛋白（Oct-1）和线粒体蛋白的分析包括（Mn-SOD）进行比较。(B类)蛋白质印迹分析使用α-Nfu 4333的RD4 triton裂解物（泳道1）。体外pcDNA翻译产物-核燃料元件亚型I，pcDNA-核燃料元件亚型II和对照构建体pPoly（a）-萤光素酶显示比较。（C） RD4细胞脉冲标记[35S] 蛋氨酸并在指定时间追赶。氚裂解物的免疫沉淀用α-Nfu 4333表示Nfu亚型I的两步加工。(D类)RD4裂解物中内源性Nfu的免疫沉淀免疫沉淀法在体外的翻译产品核燃料元件亚型I和II。正如预期，在体外翻译亚型I产生约28kDa的主要蛋白质，而亚型II产生约26 kDa的蛋白质。亚型II的较短产物（≈22 kDa）可能是在体外翻译开始于ATG3（图1A类).
图4。
图4。
Nfu（43μM）的紫外可见吸收光谱(A类)和之后(B类)在体外群集组件。
图5。
图5。
人类Nfu（430μM）的穆斯堡尔谱在体外Fe-S团簇的组装。光谱（阴影标记）记录在50 mT磁场中4.2 K(A类)或6吨(B类)平行应用于γ辐射。与实验光谱重叠的实线是使用两个重叠四极偶极子的理论模拟吗以下参数和假设抗磁性：δ=0.47 mm/s，ΔE类问=1.35 mm/s，且η=0.5（对于双峰1），δ=0.47 mm/s，ΔE类问=1.09 mm/s，η=双绞线2为0.7。
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