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.2008年9月；28(18):5569-82.
doi:10.128/MCB.00642-08。 Epub 2008年7月14日。

Dre2是一种保守的真核Fe/S簇合蛋白，在细胞溶质Fe/S蛋白生物生成中发挥作用

张燕（音译） 1, 伊丽莎·莱弗, 中村英子, Heeyong Yoon公司, 布米纳森·阿穆塔, 李东宇, 二飞碧, Tomoko Ohnishi先生, 费夫齐·达尔达尔, Debkumar疼痛, 安德鲁·丹奇斯
附属公司

Dre2是一种保守的真核Fe/S簇合蛋白，在细胞溶质Fe/S蛋白生物生成中发挥作用

张燕（音译）等。 摩尔细胞生物学. 2008年9月.

摘要

在酿酒酵母中与线粒体铁载体蛋白相互作用的正向遗传筛选中，发现必需DRE2基因的亚形态突变与德尔塔mrs3和德尔塔mrs4结合时具有致死性。dre2突变体或dre2缺失的细胞在维持线粒体Fe/S簇的同时，胞浆Fe/S簇蛋白活性不足。Dre2氨基酸序列在进化上是保守的，人类和酵母蛋白中的半胱氨酸基序（CX（2）CXC和孪生CX（2C））是完全一致的。人类Dre2同源物（与阻止凋亡有关，称为CIAPIN1或anamorsin）能够补充Deltadre2缺失菌株的非活性。带有三重血凝素标记的Dre2蛋白位于细胞质和线粒体膜间隙。从细菌中过度表达和纯化的酵母Dre2呈棕色，显示出特征吸收和电子顺磁共振光谱，表明存在[2Fe-2S]和[4Fe-4S]簇。因此，Dre2是一种重要的保守Fe/S簇蛋白，与线粒体外Fe/S团簇组装有关，类似于所谓的CIA（细胞质Fe/S集群组装）途径的其他成分，尽管部分位于线粒体膜间隙。

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数字

图1。
图1。
使用Δ进行合成致命性分段筛选3号夫人Δ4号mrs.（A）应变。母株96-47含有Δ3号夫人Δ4号mrsΔade2Δade3（ade3）突变和2μm质粒17-1MRS4、URA3、和ADE3型该菌株在低腺嘌呤的YPD上产生红色和白色扇区。（B） 突变体选择。紫外线诱变后，鉴定出一个名为J137的菌落/克隆，该克隆未能扇形并保持红色。（C） 质粒依赖性测试。将亲本96-47和突变株J137 97-19暴露于氟代甲酸（FOA）中，以对抗质粒进行反选择，从而使前者存活，而后者不存活。（D） 质粒交换。用质粒17-37 pRS318转化亲本和突变体-MRS4-LEU2-CHY2型，并且两者都具有FOA抗性（未显示）。用环己酰亚胺（CHX）处理以去除新引入的质粒导致了亲本的活性和突变株的不活性。（E） 遗传学。通过与Δ杂交分析J137（97-19）突变体3号夫人Δ4号mrsΔ阿德2Δ阿德3相反交配型菌株93-71。Δ的二倍体纯合子3号夫人Δ4号mrs但是杂合子dre2-137（图纸2-137）突变出现在FOA平板上。二倍体能够生长，表明J137的突变是隐性的。
图2。
图2。
合成致死突变体J137的进一步遗传分析。通过与质粒YCplac111中的基因组文库互补，克隆了J137中突变基因的野生型拷贝。除了两个单独的大的白色菌落外，转化子大部分形成了小的非分割的红色菌落。（第1行至第4行）互补质粒（第1和第2行）被挽救，通过缺失灭活YKR070W（第3行）或DRE2型（第4行）。只有17-59保留了互补活性，表明DRE2型是负责任的。（第5行）J137的基因组突变，称为dre2-137（图纸2-137），在扩增DRE2型开放阅读框和侧翼区域。出现了一个单一的A-T改变，将密码子26从赖氨酸改变为终止密码子。这个dre2-137（图纸2-137）该菌株名为97-55，在J137与亲本菌株84-9回交、产孢和四分体分离后恢复。该菌株生长缓慢，但有活力，对铁缺乏敏感。（第6行）通过二倍体中杂合子基因缺失，用表达Dre2的质粒与CYH2公司标记（18-39）和孢子形成。洗牌应变（101-19）和Δdre2型::kanMX（汉字）在用环己酰亚胺对质粒进行反选择后，Dre2质粒所覆盖的缺失完全无效。（第7行）相反，在YCplac22（质粒18-65）上重新插入的强GPD启动子控制下，具有Dre2的混洗菌株在环己酰亚胺上是可行的。（第8行）与从GPD启动子表达的人Dre2同源物相同的质粒（质粒B29-70）赋予了在放线菌酮上的混洗菌株强有力的生长。（第9行）YCplac22-GPD-Dre2质粒发生突变，引入dre2-137（图纸2-137）点突变（密码子26从赖氨酸变为stop），将该质粒（18-67）导入shuffle菌株，使放线菌亚胺能够存活生长。（第10行）将YCplac22-GPD-Dre2（1-25aa）质粒（19-13）转化到洗牌菌株，产生无法在环己酰亚胺平板上生长的转化子。（第11行和第12行）然而，含有N末端截断的Dre2形式的质粒，YCplac22-GPD-Dre2（Δ26）（第11列）和YCPlac 22-GPD-Dre2（△119）（第12列），能够在环己酰亚胺上生长。FOA，氟代甲酸。
图3。
图3。
序列比对和洗牌菌株互补。（A） 使用Clustal W 2.0对人类Dre2（Q6F181，也称为CIAPIN1或anamorsin）和酵母Dre2氨基酸序列进行比对。在对齐下面，星号代表相同的残留物，点或冒号代表较小程度的保守变化。半胱氨酸呈红色，九个半胱氨酸中有八个完全对齐。在序列上方，残基26上的黑色圆圈表示突变的位置dre2-137（图纸2-137）将K更改为停止。箭头表示面板B中使用的截断结构的平移起点（箭头1包括标记为Δ26的位置27到348；箭头2包括标记为△119的位置120到348）。上划线表示可能的功能域：氨基末端结构域（a）、酸性和富含丝氨酸的补片（B）、基本结构域（c）、CX2CXC域（d），双CX2C基序（e）和意义未知的氨基酸区（f）。（B） 洗牌菌株与各种Dre2结构体和人类同源物的互补。用Δ洗牌（应变101-19）数据记录设备::kanMX（汉字）删除内容包括DRE2型携带野生型的（质粒18-39）DRE2型和CYH2公司用携带在质粒YCplac22上并由GPD启动子驱动的各种Dre2构建物转化反选择标记。顶部面板中显示的YCplac22结构如下：Dre2（Δ26）（1和2）、Dre2，dre2-137（图纸2-137）（9） 和人类Dre2开放阅读框（10）。具有可反选Dre2的转化子-CYH2公司和测试Dre2-TRP1号机组生长并拍照（中面板）。然后通过在环己酰亚胺（CHX）上电镀去除覆盖质粒，只留下测试Dre2-TRP1号机组质粒（下图）。结果表明：DRE2型是生存所必需的，而缺失可以通过酵母野生型蛋白、人类同源物、点突变体的表达来挽救dre2-137（图纸2-137）或Δ26和Δ119截断，但不包括N末端氨基酸为1至25的片段。
图4。
图4。
使用Gal-Dre2综述合成相互作用。Gal-Dre2（98-67）与Δ交叉3号夫人Δ4号mrs菌株（87-13），产孢，在葡萄糖或半乳糖平板上解剖。（A） 图中所示为葡萄糖平板上分离的四分体孢子克隆。盒装四分体是一种具有指定基因型的四分型。第d行中的孢子克隆被认为代表Gal-Dre2Δ3号夫人Δ4号mrs显微镜下可见，在不到20个细胞处被捕。（B和C）从半乳糖平板中取出不同基因型的四分体克隆并用水稀释，在半乳糖板（B）或葡萄糖板（C）上发现系列稀释液。注意诱导Gal-Dre2Δ的轻微生长缺陷3号夫人Δ4号mrs在半乳糖平板上，表明了合成剂量效应。在葡萄糖平板上，三个突变体（被抑制的Gal-Dre2Δ3号夫人Δ4号mrs)比单个突变体Gal-Dre2或Δ3号夫人Δ4号mrs应变。
图5：。
图5：。
遗传相互作用表型。具有基因缺失或镀锌1启动子交换与具有Δ3号夫人Δ4号mrs删除。在孢子形成和分离后，对四分体克隆的菌落大小和基因型进行评估。对于Gal-Cfd1或Gal-Atm1（用星号表示），三个突变集落小于单个或双突变体，但对于Gal-Ssq1或Δisu1型（用数字符号表示）。WT，野生型。
图6。
图6。
突变体的铁依赖性生长。J137（97-19）与MRS3 MRS4对亲本菌株（84-9）进行孢子化，并对四分体进行解剖和分析，生成不同基因型的活克隆：野生型（97-53）、Δ第3/4夫人(97-52),dre2-137（图纸2-137）（97-55），以及dre2-137（图纸2-137）Δ第3/4夫人(97-54). 用水冲洗细胞，5×10的1:5系列稀释液5细胞被镀在铁锌缓冲板上。螯合板含有50 mM吗啉乙磺酸缓冲液，pH 6.1，1 mM铁螯合剂亚铁（A）或与20μM硫酸亚铁铵（B）、100μM硫酸亚铁铵（C）或350μM硫酸铁铵（D）相同的铁螯合物。与野生型相比，Δ第3/4夫人和dre2-137（图纸2-137）菌株表现出铁依赖性生长，三重突变体在低铁培养板上受损最严重。
图7。
图7。
野生型和野生型不同铁生长条件下的异源IRP1活性dre2-137（图纸2-137）突变菌株。CDV38a野生型（菌株84-1）和dre2-137（图纸2-137）用质粒（YCplac22-GPDprom-IRP1、质粒18-3）转化突变体（菌株97-55）以表达人胞质乌头酶IRP1。将细胞在限定的选择性葡萄糖培养基中生长至固定期以维持IRP1质粒，并稀释至OD600在相同成分的培养基中添加不同数量的铁作为硫酸亚铁铵。经过四次加倍后，收集细胞并用酶消化，用天然凝胶电泳分离100μg细胞裂解液。如前所述（2，43），通过凝胶内分析揭示了天然凝胶电泳分离的裂解液中乌头酶的活性。指出了内源性线粒体乌头酶活性（Aco1）和质粒表达的细胞质乌头酶活力（IRP1）的位置。通道1、2、3、4和5分别是生长在0、100 nM、1μM、10μM和20μM添加铁中的野生型裂解物。车道6、7、8、9和10为第2-137页菌株分别在添加铁的0、100 nM、1μM、10μM和20μM中生长的裂解产物。11号通道含有100μg纯化线粒体。
图8。
图8。
Dre2缺失细胞缺乏IRP1活性。用YCplac22-GPDprom-IRP1（质粒18-3）转化Gal-Dre2菌株（98-67）。细胞在半乳糖（含2%棉子糖和0.5%半乳糖的规定培养基）存在下生长，离心，并在无半乳糖情况下重新悬浮指定时间，从而耗尽Dre2。（A） 耗尽时间过程：在换班后立即收集细胞（零时间），并在换班2、4、6、8、10、12、14和16小时后收集细胞。酶解酶消化产生的裂解物通过天然凝胶电泳分离，并进行乌头酶的凝胶内分析。线粒体顺乌头酸酶活性（Aco1）和质粒表达的细胞质顺乌头酸酶活性（IRP1）均显示出来。最左边的通道（“mito”）含有100μg来自未转化亲本菌株YPH499的纯化线粒体。（B） IRP1蛋白的免疫印迹。通过SDS-PAGE分析未转化亲本菌株YPH499（第1道）的全细胞裂解物、诱导表达IRP1的Gal-Dre2（第2道）和生长16小时后未诱导表达IRP1的Gal-De2（第3道），并用抗IRP1或细胞质标记Pgk1进行免疫印迹作为对照（每道100μg蛋白质）。wt，野生型。
图9：。
图9：。
Dre2缺失细胞缺乏苹果酸异丙酯异构酶（Leu1）活性。带有质粒pRS426-Leu1-His的Gal-Dre2菌株6在含有半乳糖-棉子糖或棉子糖的选择性培养基中培养，以耗尽Dre2。（A） 苹果酸异丙酯异构酶（Leu1）活性记录为OD的降低235由Dre2诱导的（左图）或耗尽的（右图）部分纯化的裂解液中人工底物柠檬酸盐的异构化引起。在室温下记录示踪3分钟，并对每个10μl裂解液重复两次，相当于100μg蛋白质。（B） Leu1活性（OD减少235对于Dre2抑制（R）或诱导（I）裂解物，测量50、100或200μg细胞裂解物。试验进行了三次，结果相似，每种情况下抑制样品的活性可忽略不计。插图：用抗His抗体进行免疫印迹。在50至65%硫酸铵部分和100μg来自抑制和诱导样品的蛋白质中测量活性和蛋白质。
图10。
图10。
Dre2缺失细胞中核糖体蛋白的核滞留。质粒pRS316-Rpl25-eGFP转化为Gal-Dre2菌株。Dre2蛋白在含有棉籽糖-半乳糖或仅含棉籽糖的特定培养基中分别生长16小时后表达或耗尽。（A）显示了Gal-Dre2诱导（顶部）和Gal-Dre-2缺失（底部）细胞的DAPI和Rpl25-eGFP荧光图像。（B） Dre2耗竭后来自Gal-Dre2培养物的单个细胞，显示差异干扰对比度（DIC）（a）、DAPI（B）和Rpl25eGFP（c）图像。GFP荧光信号只有在Dre2耗尽的条件下才出现核积累。
图11：。
图11：。
Dre2-HA的细胞定位三（A）用SDS-PAGE从总细胞裂解物（T）、PMS、CM和GM中分离出等效蛋白量（100μg）并进行印迹，印迹用HA标签、Yfh1（线粒体）或Pgk1（细胞质）抗体形成。（B） 细胞组分在冰上用蛋白酶K处理30分钟，并通过HA印迹分析（左面板）。CM用蛋白酶K或胰蛋白酶处理，并用HA印迹法或抗Tom70或Yfh1的对照抗体进行分析（右表）。（C） CM接受低渗休克治疗，恢复IMS（分别为100、200或500μg，指定为1X、2X或5X）或有丝分裂体（100μg，标记为1X），并用HA、Ccp1或Yfh1抗体进行印迹分析。氨基黑色染色膜显示蛋白质模式。MP，有丝分裂体颗粒。
图12：。
图12：。
纯化Dre2的紫外可见光谱。德雷2-His6蛋白质在温和条件下快速纯化，最大限度地减少氧化剂损伤和空气暴露，脱气缓冲液中含有10%的甘油。提纯（蓝色示踪）和添加新制的10 mM连二亚硫酸钠（棕色示踪）或10分钟后（绿色示踪），立即记录光谱。空气氧化样品在314、420、458和500 nm处的峰随连二亚硫酸钠还原立即消失，而560 nm的峰消失得较慢。插图：纯化Dre2-His6与缓冲液（左侧）相比，蛋白质（13-mg/ml浓度）呈深棕色（右侧）。
图13。
图13。
EPR谱。纯化的Dre2蛋白在45 K和5 mW（A）以及6 K和5 m W（B）下的EPR谱。样品（13 mg/ml）在pH 7.5的50 mM Tris-HCl中，含有50 mM NaCl和10%甘油，用10 mM连二亚硫酸钠还原。EPR条件：微波频率，9.45GHz；调制幅度，8.034 G；调制频率，100 kHz；时间常数，82 ms，主要克显示值。
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