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.2005年12月；25(24):10833-41.
doi:10.1128/MCB.25.24.10833-10841.2005。

必需的WD40蛋白Cia1参与细胞溶质和核铁硫蛋白组装的后期步骤

詹妮克·巴尔克 1, Daili J Aguilar Netz公司, 凯萨琳娜·泰珀, 安东尼奥·皮尔里克, 罗兰·里尔
附属公司

必需的WD40蛋白Cia1参与细胞溶质和核铁硫蛋白组装的后期步骤

詹妮克·巴尔克等。 分子细胞生物学. 2005年12月.

摘要

酵母中细胞溶质和核铁硫（Fe/S）蛋白的组装依赖于线粒体中的铁硫簇组装和输出机制，以及最近发现的三种线粒体外蛋白，即P-loop NTPases Cfd1和Nbp35以及类似氢化酶的Nar1。然而，胞浆中铁/硫蛋白组装的分子机制尚不清楚，预计会有更多的组分参与这一过程。在这里，我们已经鉴定并功能表征了一种新的WD40重复蛋白，命名为Cia1，它是体内在细胞质和细胞核上组装Fe/S簇所需的基本成分，但不是线粒体的Fe/S蛋白。令人惊讶的是，Nbp35和Nar1本身就是Fe/S蛋白质，它们可以在没有Cia1的情况下组装Fe/S簇，这表明这些成分在Cia1之前起作用。因此，Cia1参与了铁/硫簇并入靶蛋白的后期步骤。免疫共沉淀分析显示Cia1和Nar1之间存在特异性相互作用。与主要为细胞溶质的Nar1相比，Cia1优先定位于细胞核，这表明Cia1具有额外的功能。总之，我们的结果表明，Cia1是细胞溶质Fe/S蛋白组装（CIA）机制的新成员，参与Nbp35和Nar1之后的步骤。

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数字

图1。
图1。
的示意图CFD1公司和CIA1公司基因酿酒酵母和S.pombe公司.一个蛋白质编码序列与酿酒酵母CFD1在中找到S.pombe公司作为带有C末端WD40重复域（系统名称，SPAC806.02公司).
图2。
图2。
必需的Cia1是细胞核和细胞质中的可溶性蛋白质。（A） Cia1缺失细胞的生长。携带半乳糖可调节（Gal）的Gal-CIA1细胞CIA1公司用载体p416转化基因，不带或带CIA1公司-HA融合基因。细胞培养2个 × 在含有补充有半乳糖（YPGal）或葡萄糖（YPD）的富培养基的琼脂平板上，在30°C下培养2天。显示了十倍系列稀释。（B） 亚细胞分离和免疫印迹分析。通过去除细胞壁并用Douncer在0.6 M山梨醇、20 mM HEPES-KOH、pH 7.4、1 mM二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂中均质，然后进行差速离心，可以破坏野生型细胞。丢弃含有未破碎细胞、细胞核和碎片的低速颗粒后，将细胞提取物（CE）以10000×克将可溶性蛋白质（S10）从富含细胞器的组分（P10）中分离出来，持续10分钟。在100000×克30分钟，从可溶性蛋白质（S100）中去除膜（P100）。使用Ficoll密度梯度（1）分别纯化细胞核（Nuc）。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质（20μg/条），进行印迹，并对细胞核（DNA聚合酶相关Pol30）、线粒体（Mge1）、内质网（转座子亚基Sec61）和细胞质醇（Leu1）的Cia1或标记蛋白进行免疫染色。（C） Cia1的原位定位。用含有CIA1公司与HA标签序列融合。对数期细胞用2.4%（wt/vol）甲醛固定，渗透，并用单克隆抗HA（α-HA）抗体标记，然后用荧光结合二级抗体标记。用DAPI（4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚）对DNA进行复染，以显示细胞核和线粒体的位置。
图3。
图3。
细胞溶质和核Fe/S蛋白子集的组装需要Cia1。Gal-CIA1细胞在添加半乳糖（Gal）或葡萄糖（Glc）的最小培养基中培养不同时间，以分别诱导或抑制CIA1公司（A）细胞提取物中乙醇脱氢酶（ADH）、异丙基苹果酸异构酶（Leu1）和亚硫酸盐还原酶（SiR）的酶活性与用半乳糖培养的野生型细胞的酶活性相关。通过免疫印迹分析（下部面板）显示Cia1和Leu1的蛋白质水平。（B）55Fe并入Leu1。Gal-CIA1细胞被标记为55Fe，并制备细胞裂解物，从中用特异性抗体免疫沉淀Leu1。共沉淀55铁通过闪烁计数定量。免疫前血清免疫沉淀（PIS）作为对照。Leu1蛋白的数量通过免疫印迹分析、化学发光和欠饱和胶片曝光密度测定进行量化。（C）55铁并入几个细胞溶质和核铁/硫蛋白。在B组中获得的数据表示为每种报告蛋白的葡萄糖生长（40 h）细胞与半乳糖生长细胞的比率，并根据背景进行校正。Rli1-HA、Ntg2-HA、Nbp35-TAP和Nar1分别从高拷贝数载体（p426）中表达，并用抗HA、免疫球蛋白G（IgG）和抗Nar1抗体进行免疫沉淀。不表达这些结构的细胞被用来确定免疫沉淀的背景水平55铁。右边的面板显示了每个指示蛋白质的免疫印迹分析示例。
图4。
图4。
线粒体Fe/S蛋白组装不需要Cia1。（A） 在最小培养基和葡萄糖中生长40 h后，野生型（WT）和Gal-CIA1细胞中乌头糖和琥珀酸脱氢酶（SDH）的酶活性。通过免疫印迹分析（插图）显示乌头糖（Aco1）和琥珀酸酯脱氢酶亚基2（Sdh2）的蛋白水平，使用相当于酶分析所用的线粒体蛋白量。（B）55Fe并入Fe/S蛋白Bio2和Yah1-HA。在添加半乳糖（Gal）或葡萄糖（Glc）的铁盐最低培养基中培养Gal-CIA1细胞，分别诱导或抑制CIA1公司使用高拷贝数载体p426过度生产Bio2和HA标记的Yah1。细胞被标记为55制备了铁和细胞裂解物，从中分别用抗Bio2或抗-HA特异性抗体免疫沉淀Bio2和Yah1。共沉淀55铁通过闪烁计数定量。以下金额55以不含过量生产的Bio2或Yah1-HA的细胞提取物中的铁免疫沉淀作为背景（Bg）。通过免疫印迹分析分析指示蛋白的水平。
图5。
图5。
在缺乏Cia1的情况下，正常的细胞和线粒体铁稳态。（A） 携带质粒p415-FET3-GFP的野生型Gal-CIA1和Gal-ATM1细胞在含有葡萄糖的最小培养基中培养24 h，稀释至600 nm处0.1的光密度，并补充0.1 mM FeCl三（Fe）或0.1 mM铁螯合剂-苯菲咯啉磺酸盐（BPS）。继续生长6小时场效应晶体管3通过记录细胞悬浮液在513nm处的荧光发射（在480nm处激发）来确定启动子。减去缺少质粒p415-FET3-GFP的细胞信号。A.U.，任意单位。（B） 野生型Gal-CIA1和Gal-ATM1细胞在含有半乳糖（Gal）或葡萄糖（Glc）的最小培养基中生长。通过差速离心纯化线粒体，并使用基于铁螯合物ferene的比色法测量总铁含量。
图6。
图6。
Cia1与Nar1发生蛋白质相互作用。在最小培养基中培养并收获产生所示HA标记蛋白的细胞，并制备细胞提取物。在4°C下添加HA-淀粉培养1h，并用缓冲液洗涤数次。对细胞提取物和洗净的HA-淀粉进行蛋白质印迹分析，以检测感兴趣的蛋白质。（A） 野生型（wt）或过度生产细胞提取物中HA标记的Cia1与Nar1的共免疫沉淀(↑) Nar1水平。另一种HA标记蛋白用作对照（X-HA，其中X代表Ymr134w）。通过蛋白质印迹分析在总细胞提取物（左侧面板）和免疫沉淀（抗-HA[α-HA]，右侧面板）中检测到指示的蛋白质。（B和C）如面板A所示，使用过度产生Cfd1、Nbp35或Cia1的细胞。在蛋白印迹分析之前，使用抗HA抗体免疫沉淀Cia1-HA（B）或Cfd1-HA（C）。
图7。
图7。
Cia1是从细胞核输出大核糖体亚单位所必需的。野生型和Gal-CIA1细胞表达RPL25-GFP型融合基因在添加葡萄糖的最小培养基中培养40h。通过荧光显微镜监测GFP的细胞分布。通过相控显微镜和DAPI（4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚）染色判断，Gal-CIA1细胞中累积的斑点GFP是细胞核（未显示；见参考文献16）。
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