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.2009年10月30日；284（44）：30200-8。
doi:10.1074/jbc。M109.034694。 Epub 2009年8月31日。

Nfs1的双重靶向性及其新型加工酶Icp55的发现

阿迪·纳马蒂 1, 内塔·雷杰夫·鲁兹基, 什洛米·加尔佩林, 罗兰·里尔, 欧弗利松树
附属公司

Nfs1的双重靶向性及其新型加工酶Icp55的发现

阿迪·纳马蒂等。 生物化学杂志. .

摘要

在真核生物中，每个亚细胞隔室都含有一组必须完成特定任务的特定蛋白质。Nfs1是一种高度保守的线粒体半胱氨酸脱硫酶，作为硫供体参与铁硫簇组装。先前在酿酒酵母中进行的遗传学研究表明，这种蛋白质分布在线粒体和细胞核之间，细胞核中的生化检测不到数量（称为“日蚀分布”）。在这里，我们使用α-补体和亚细胞分离为Nfs1核定位（除了线粒体）提供了直接证据。我们还证明线粒体和核Nfs1来自单个翻译产物。我们的数据表明，Nfs1的分布机制至少包括Nfs1前体部分进入线粒体，然后少量亚群（可能通过反向易位）进入胞浆，然后进入细胞核。为了进一步阐明Nfs1分布的机制，我们通过Edman降解测定了Nfs1的N端线粒体序列。这导致了一种新的线粒体加工酶Icp55的发现。该酶经线粒体加工肽酶裂解后，从Nfs1的N端去除三个氨基酸。有趣的是，Icp55蛋白酶（像它的底物Nfs1一样）似乎在细胞核和线粒体之间双重分布。

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数字

图1。
图1。
Nfs1的处理。 A类，野生型Nfs1 N端氨基酸序列。可作为潜在MPP识别元素的精氨酸表示为放大的R字母第条。箭头指示通过Edman降解确定的MPP和Icp55切割位点。B类，Nfs1在WT和Δ中的表达icp55用Nfs1抗血清进行Western blotting分析菌株。C类MPP对Nfs1突变蛋白的切割(左箭头)和Icp55(右箭头)由Edman退化决定。取代氨基酸是突出显示的，“X（X），“和灰色箭头表示部分解理。D类在没有或存在CCCP的情况下，对Nfs1-α和Nfs1-UP-α进行代谢标记。第页，前体；米，成熟。
图2。
图2。
Nfs1-α也定位于细胞核。 A类α-互补分析的说明：α-互补试验是基于β-半乳糖苷酶片段α和ω在同一隔室（线粒体）内的共同定位(中间面板)，或nucleus(右侧面板)). 酶活性可以通过生产蓝色X-gal平板上的菌落。如果这两块碎片在不同的隔间里白色菌落应该出现(左侧面板).塞浦路斯，胞浆；米特，线粒体；Nuc（数字），细胞核。B类,Tet-NFS1在存在或不存在四环素（Tet启动子的阻遏物）的情况下，在30°C下在YPD平板上生长48小时。C类表达Nfs1或Nfs1-α的酵母细胞的亚细胞分离。总数(T型)，胞浆(C类)和线粒体(M（M）)使用所示抗体通过Western blotting分析组分。对照：HxK1（己糖激酶1），一种胞质标志物，Aco1（乌头酶），一种线粒体标志物。D类共表达胞质ω（ω）的酵母培养物c（c）)，线粒体ω（ω米)，或核ω（ω荷兰统计局)与所示的Nfs1-α突变体一起生长在含有X-gal的半乳糖培养基上。蓝色菌落检测与所示ω片段相关的α片段。Nfs1号机组-ΔMTS公司-α是缺乏MTS的突变株，并且Nfs1-mutNLS号-α是NLS序列的四个氨基酸发生突变的突变体。对照：α荷兰统计局-α片段融合到SV40 T抗原的NLS，HxK1-α-（己糖激酶1），细胞溶质标记融合到α片段，Kgd2-α-线粒体标记融合到该α片段。
图3。
图3。
这个NFS1型基因编码单个基因产物。 A类在没有或存在CCCP（膜电位解偶联剂）的情况下，对表达Nfs1或Nfs1-α的野生型菌株进行代谢标记。第页，前体；米，成熟。B类，Nfs1突变体的示意图。灰色和黑匣子分别代表MTS和成熟序列，弯曲箭头代表潜在的翻译起始点。Nfs1-M85L突变蛋白包含一个错义突变，其中Met-85被改为Leu。Nfs1-Shift有一个额外的核苷酸(C类)插入第一个和第二个八月之间，导致从第一个八月开始的翻译提前终止。C类，的Tet-NFS1在有或无四环素的YPD平板上检测表达各种Nfs1突变蛋白的菌株的生长情况(泰特).D类，蛋白质印迹分析Tet-NFS1型表达上述突变蛋白的菌株。细胞在含有四环素的半乳糖培养基上生长8小时。使用Hsp60抗体控制等效负载。
图4。
图4。
未处理的Nfs1突变体在细胞核中不活跃。这个Tet-NFS1表达所示Nfs1突变蛋白的细胞在有或无四环素的YPD平板上生长(泰特).
图5。
图5。
所有Nfs1分子都在线粒体中加工。过度表达Nfs1-α的WT菌株的亚细胞分馏。总数的等分部分(T型)和核能(N个)通过Western blotting分析的分数。核分数的浓度大约是总分数的24倍。第页，前体；米，成熟。标记：Nfs1-α和Nfs1-UP-α。对照组：Hsp60（线粒体）、HxK1（胞浆）、组蛋白H4（细胞核）和Fum1（线粒体和胞浆）。
图6。
图6。
Icp55-α分布于线粒体和细胞核之间。 A类,蓝色菌落检测到细胞溶质、线粒体或细胞核中的α片段，如图2图例所示。对照组：线粒体Kgd2-α与ω共表达米（+）或ωc（c）(−).B类，推测的Icp55 NLS区域呈现带正电荷的氨基酸放大的和下划线的. The sequence between the两个箭头从Icp55-ΔNLS-α突变蛋白中删除。
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