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.2010年10月1日；19(19):3816-34.
doi:10.1093/hmg/ddq301。 Epub 2010年7月28日。

人HSC20是一种罕见的DnaJ III型蛋白，参与铁硫簇生物生成

赫尔格·乌里沙尔德 1, 阿纳米卡·辛格, 根纳迪·科夫图诺维奇, 马尼克·戈什, 特蕾西·鲁奥
附属公司

人HSC20是一种罕见的DnaJ III型蛋白，参与铁硫簇生物生成

海尔格·乌里沙德等。 人类分子遗传学. .

摘要

线粒体铁硫簇（ISC）生物生成对人类健康的重要性已得到充分证实，但这一关键途径的某些成分在哺乳动物中的作用仍不明确。其中包括人类热休克同源蛋白20（hHSC20），这是推测的DnaJ型共同伴侣的人类同源物，对细菌和真菌ISC组装至关重要。在这里，我们表明人类HSC20蛋白可以补充酵母中的对应物Jac1p，并与其提议的人类伙伴hISCU和hHSPA9相互作用。hHSC20在多种人体组织中表达，主要定位于HeLa细胞的线粒体。然而，少量也被超时空检测到。RNA干扰介导的hHSC20缺失可特异性降低线粒体和细胞溶质ISC相关酶的活性。氧化损伤hHSC20缺陷细胞后，失活ISC酶的恢复明显延迟。相反，hHSC20的过度表达实质上保护了细胞免受氧化损伤。这些结果表明，hHSC20是人类ISC生物合成机制的组成部分，在氧化应激条件下ISC的组装中尤为重要。研究发现，富含半胱氨酸的N末端结构域对人类共伴侣的完整性和功能很重要，它清楚地将hHSC20与真菌和大多数细菌的特异性DnaJ III型蛋白区分开来。

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数字

图1。
图1。
hHSC20和HscB的三级结构大肠杆菌高度相似，但hHSC20含有高度结构化的N-末端延伸。(A类)hHSC20（BVO3）（43）和HscB的晶体结构大肠杆菌（1fpo）（44）表明蛋白质的J端和C端结构域具有显著的结构相似性。被认为直接参与与HSP70伴侣相互作用的氨基酸，包括J结构域的HPD基序，或被认为对与支架蛋白ISCU相互作用重要的谷氨酸簇，在每个结构中进行标记和编号。人类结构中突出了一个独特的N末端金属结合域，这在大多数细菌和酵母的特征性共伴侣中是不存在的。(B类)与真菌和细菌物种相比，高等真核生物HSC20/HscB同源物的保守和独特N末端区域的多重序列比对。对不同物种的比较表明，在高等真核生物HSC20的N端、厌氧无丝分裂体的相应蛋白质中，一个双重复的金属配位CXXC基序高度保守，肠杆菌和阴道毛滴虫一些细菌对铁的需求异常高。几乎所有的真核生物代表（真菌蛋白除外）都对这个有趣的结构域进行了进化保护，这意味着这个结构域具有重要但尚未定义的功能。保守的半胱氨酸以三角形突出显示。一个假定的线粒体先导序列被装箱在人类蛋白质中；预测的线粒体分裂位点用箭头表示。hHSC20 N端的预测二级结构元素显示在序列上方。
图2。
图2。
WT-hHSC20高效互补Jac1p基因的表达酿酒酵母. (A类)A类JAC1公司洗牌菌株（24）与以下结构体共转化：YCplac22-GPDprom-JAC1（WTJAC1公司ORF），YCplac22-GPDprom-HSC20-3x标志（WT高铁C20cDNA），YCplac22-GPDprom-hHSC20TA-3x标记[高铁C20具有改变的J结构域的突变体，其中关键残基H102、P103和D104被丙氨酸（Triple A）]和YCplac22-GPDprom（空载体）取代。通过将5倍稀释的细胞在5µl体积的合成脱落（SD）培养基上电镀来分析转化物我-亮氨酸（-Leu）和我-色氨酸（−Trp；左面板）和不含Trp的SD补充有环己酰亚胺，以对抗覆盖质粒（右面板）。在拍照之前，将平板在30°C下培养4天。尽管酵母和人类蛋白的N末端存在显著差异，但hHSC20可以拯救Δjac1缺失菌株，清楚地表明hHSC20。相反，具有改变的J结构域的人类蛋白质的突变版本（hHSC20TA）并不能挽救。(B类)转化酵母中hHSC20WT和hHSC20 TA的稳态水平非常相似。WT hHSC20和hHSC20TA的表达水平非常相似，如（A）中来自每个转化酵母菌株的酵母总裂解物的蛋白质印迹所揭示的。(C类)一种hHSC20突变体，其中独特的N末端结构域的保守半胱氨酸被丝氨酸所取代，而丝氨酸只是Jac1p缺乏的较差补体。这个JAC1公司混洗菌株与以下构建体共转化：YCplac22-GPDprom-JAC1（WTJAC1公司ORF），YCplac22-GPDprom-HSC20-3x标志（WT高铁C20cDNA），YCplac22-GPDprom-hHSC20Ser-3x标记(高铁C20具有改变的N末端结构域的突变体，其中图1A中所示的四个高度保守的半胱氨酸被丝氨酸取代）和YCplac22-GPDprom-hHSC20TA-3xFlag(高铁C20J结构域改变的突变体）。如A所述，对转化物进行分析(D类)表明hHSC20独特的N末端结构域可能对其稳定性很重要。转化子中hHSC20WT和hHSC20 Ser的稳态水平存在显著差异，如代表三个独立实验的western blot所示。
图3。
图3。
hHSC20与预期的伙伴，即支架蛋白hISCU和HSP70蛋白hHSPA9相互作用。(A类)Y2H研究旨在调查hHSC20与其预期伴侣的潜在相互作用。hHSC20、hISCU和hHSPA9表达为与Gal4结合域（BD）或Gal4激活域（AD）的融合，没有N末端线粒体靶向序列（MTS）以最小化非特异性相互作用的风险。与编码已知相互作用物Rabex-5（对照AD）和Rabaptin-5（对照BD）（91）的载体共转化分别提供阳性和阴性对照。菌株被镀在SD上，缺乏我-亮氨酸和我-色氨酸（−亮氨酸/−色氨酸）我-组氨酸（+His）作为共同转化子负载和生长的控制。在缺少HIS3基因的SD板上电镀后，通过激活HIS3的基因转录来监测特定的相互作用我-组氨酸，我-亮氨酸和我-在HIS3蛋白竞争性抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）浓度增加的情况下，色氨酸（-His/−Leu/−Trp）。所有实验均一式三份。(B类)hHSC20与hISCU互动体内HeLa细胞，稳定转染pCMVHSC20-3xFLAG或空载体，与pISCUmyc（50）共转染。转染后36小时，将细胞总提取物与指示的琼脂糖珠结合抗体孵育。使用内源性hHSC20和hISCU抗体通过免疫印迹法检查提取物输入（顶部面板，占总输入的约5%）和免疫沉淀物洗脱液（底部面板）。
图4。
图4。
hHSC20主要定位于线粒体(A类)免疫荧光研究显示hHSC20在HeLa细胞中主要定位于线粒体。用抗hHSC20的亲和纯化抗血清和单克隆α-TOM20抗体处理细胞，然后用α-兔Alexa488和α-小鼠Cy3抗体进行免疫修饰。（一） 顶部，hHSC20；中间，TOM20（线粒体标记）；底部，顶部和中间面板的合并。（二） 用hHSC20特异性siRNA（oligo2）连续两次治疗后进行免疫标记。(B类)亚细胞分离证明存在hHSC20的胞外池。HeLa细胞被分为细胞溶质和线粒体部分。等量的蛋白质进行SDS-PAGE并通过免疫印迹分析。以IRP1和NFκB抗体、细胞溶质蛋白、hHSPA9、线粒体HSP70（也称为莫特林）和SOD2（线粒体基质的两种成分）作为对照。(C类)内源性HSC20物种与在体外蛋白质和RNAi处理细胞的翻译版本证实存在两种细胞溶质hHSC20。编码全长蛋白（HSC20FL）和起始于位置20Δ19M20的hHSC20的质粒用于在体外表达式。在连续两次使用非特异性控制siRNA（c-siRNA）或hHSC20特异性siRNA（oligo2）处理后，将所得蛋白与细胞胞浆富集组分中hHSC20-抗体检测到的内源性物种进行比较。(D类)如Ser-突变蛋白的类似分布所示，hHSC20 N端结构域中的半胱氨酸到丝氨酸突变不会干扰线粒体定位。用pCMVHSC20WT-3xFLAG或pCMVHSCSer-3xFLAG瞬时转染HeLa细胞。转染后24小时，用单克隆α-Flag抗体和多克隆α-TOM20抗体处理HeLa细胞，然后用α-小鼠Alexa488和α-兔Cy3抗体进行免疫修饰。（顶部）hHSC20WT-Flag（左侧）和hHSC20 Ser-Flag；（中间）TOM20（线粒体标记）和（底部）顶部和中部面板的合并。(E类)hHSC20 N末端结构域的半胱氨酸到丝氨酸突变导致突变蛋白的稳态水平显著降低。用pCMVHSC20WT-3xFLAG或pCMVHSCSer-3xFLAG瞬时转染HeLa细胞，并在转染后的指定时间收获。等量的蛋白质进行SDS-PAGE，并使用单克隆α-Flag抗体进行免疫印迹分析。具有代表性的污点(n个=3）重复完成。(F类)蛋白酶体的抑制不会导致hHSC20Ser的实质性保护。转染hHSC20Ser-Flag 12小时后，用蛋白酶体抑制剂MG-132（最终浓度为10µg/ml）处理HeLa细胞。在处理后12小时收集细胞，并对总裂解产物进行western印迹。HSP72的强烈诱导清楚地表明蛋白酶体受到抑制（92）。图中显示了重复进行的代表性斑点。(G公司)hHSC20蛋白在人体组织中广泛表达。人类多组织western blots用于确定分布。用亲和纯化的抗hHSC20抗血清探测商用膜（Imgenex，20µg蛋白质/车道）。hHSC20在组织中的表达基本上是普遍存在的，脑中低水平表达，肺中高水平表达。显示了相同印迹的（i）短暴露和（ii）长暴露。估计分子量：（a）27、（b）26、（c）29、（d）25、（e）34和（f）22kDa。
图5。
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hHSC20参与ISC的生物发生。(A类)基于RNAi的敲除导致无法检测到hHSC20蛋白水平。用两种hHSC20特异性siRNA（oligo1和oligo2）或对照siRNA（c-siRNA）单次或多次连续转染HeLa细胞（有关详细信息，请参阅材料和方法）。尽管hHSC20在三次转染后无法检测到，但肌动蛋白（对照）、其潜在伙伴hHSPA9和hISCU以及两种替代支架/载体蛋白hGLRX5和hNFU的稳态水平基本上保持不变。显示了至少三个重复独立实验的代表性斑点。(B类)第三轮转染后，hHSC20 mRNA水平显著降低。在第三轮转染后制备总RNA，并分别使用hHSC20或GAPDH基因特异性引物通过qRT-PCR进行分析。误差条代表三个独立实验的SD(***对< 0.001). (C类)基于RNAi的hHSC20沉默可特异性降低ISC依赖酶的活性。在第三轮转染后测定ISC依赖性酶乌头糖酶（Aco，代表线粒体和细胞溶质同工酶的联合活性）和SDH以及两种ISC依赖酶ICDH和CS的活性（有关详细信息，请参阅方法和材料）。未感染对照组的活性设置为100%。结果表示至少三个独立实验的平均值，重复进行±SD。(D类)hHSC20缺失导致线粒体和细胞溶质室中ISC依赖酶活性降低。每条泳道装载等量的蛋白质，并进行天然凝胶电泳。乌头酸酶活性通过凝胶内试验进行可视化（50）。在第三轮转染后，通过寡核苷酸1和寡核苷酸2处理，线粒体和细胞溶质顺乌头酸酶活性显著降低，但通过c-siRNA处理则没有显著降低（有关详细信息，请参阅材料和方法）。(E类)hHSC20敲除不会改变细胞溶质和线粒体乌头酸酶的蛋白水平。线粒体和细胞溶质乌头酸酶抗体显示hHSC20-缺失细胞中相应蛋白水平没有显著降低。β-肌动蛋白水平作为对照。显示了三个独立实验的代表性印迹。(F类)hHSC20耗竭激活IRP1并稳定TfR1。根据电迁移率变化分析（EMSA）测定，各种细胞裂解物中的IRE结合活性增加（82）。本文描述了该分析的背景。蛋白质印迹显示hHSC20-缺失HeLa细胞中的TfR1蛋白水平略有增加。
图6。
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在正常生长条件下，hHSC20缺失不会导致显著的生长缺陷，但氧化激发后乌头酶活性和活力的恢复受到损害。(A类)HeLa细胞按照材料和方法中的描述进行转染和传代。在指定的日期，测定了每个细胞的总蛋白浓度以及细胞生长的测量值。来自未转染细胞的值设置为100%，显示了重复进行的三个独立实验的平均值±SD。hHSC20特异性siRNA和非特异性对照siRNA对细胞生长的影响非常相似。这些结果表明，微小的生长缺陷是由转染试剂引起的，而不是由hHSC20缺失引起的。(B类)hHSC20沉默导致过氧化氢激发后线粒体和细胞溶质乌头酶活性恢复受损。第一次转染后第3天的细胞与500µ米第页，共页2O（运行）2在指定时间采集细胞，随后分析线粒体和细胞溶质乌头酶活性。装载等量的蛋白质。显示了三个类似独立实验的代表。(C类)hHSC20缺失导致对氧化应激的敏感性增加。为了研究hHSC20耗竭对氧化应激条件下细胞活力的影响，将HeLa细胞接种到24孔板中，并用所述的siRNA处理。第一次和第三次转染48小时后，细胞暴露于500µ米H（H）2O（运行）2用MTT法在治疗24小时后测量细胞存活率（见材料和方法）。根据只接受siRNA或Lipofectamine（模拟）处理的相应同时电镀培养物，对数值进行标准化，以揭示H的特异毒性2O（运行）2数据表示重复进行的三个实验的结果，表示为未转染对照±SD的平均百分比*对< 0.05; **对< 0.001.
图7。
图7。
hHSC20的过度表达通过延迟顺乌头酸酶的失活和增加活力增强了对百草枯毒性的抵抗力。(A类)接触百草枯后乌头酸酶失活的时间过程。在用50µ米百草枯。在指定的时间，收集细胞并快速冷冻。酶活性的测定如材料和方法所述。未经百草枯处理的相应培养物的活性设置为100%。尽管hHSC20的过度表达并不能完全阻止失活，但hHSC2O水平的适度升高明显导致总乌头酶活性的失活显著延迟（代表线粒体和细胞溶质亚型的联合活性）。即使在百草枯处理12 h后，ISC诱导的依赖性酶ICDH的活性在两种细胞系中仍然几乎不受影响[相应对照组中ICDH活性的91.3±4.4%（hHSC20Flag）和91.4±6.7%（空载体）]。结果表示至少三个独立实验的平均值，以三倍±标准偏差进行。过表达，平方；矢量控制，三角形。(B类)hHSC20的过度表达增加了对百草枯毒性的抵抗力。将稳定转染有pCMVHSC20WT-3xFLAG或空载体的HeLa细胞接种在12孔中，并暴露于0、25和50µ米百草枯。72 h后，测定总乌头酶（I）和ICDH（II）活性。用MTT法测定细胞活力（III）。未暴露于氧化应激的相应培养物的活性/吸光度设置为100%。与hHSC20对氧化应激不利影响的潜在有益作用一致，我们观察到过度表达hHSC20。所有数据均表示至少3次重复独立实验的结果，并表示为相应未处理对照±SD的平均百分比。白色条表示病媒控制；填充钢筋，pCMVHSC20WT-3xFLAG。
图8。
图8。
hHSC20水平随着长期百草枯处理而降低，但转录水平不变。western blotting显示，长时间服用百草枯（72 h）会导致hHSC20蛋白水平显著降低。(A类)代表性蛋白质印迹。β-肌动蛋白和SOD2水平作为对照。(B类)百草枯处理的细胞中hHSC20蛋白水平降低的定量。(C类)然而，如qRT-PCR所示，hHSC20转录水平几乎保持不变。β-肌动蛋白和转录水平用于归一化。数据表示至少三个独立实验的结果，至少重复进行，并表示为相应未处理对照的平均百分比±SD。白条，未处理，时间匹配的对照；填充钢筋，用50µ处理米百草枯72h。
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