Depot醋酸甲羟孕酮（DMPA）增强了人源化小鼠对HIV-1的敏感性并增加了其易感性窗口

DMPA增加人源化小鼠HIV-1感染

除了对阴道屏障的影响外，DMPA还可能通过其他机制增强病毒感染¹³在我们的Hu-mouse模型中，如非人类灵长类动物（NHP）^21–23、和女性^10,11，我们观察到阴道内暴露后HIV-1获得增加¹⁴此外，我们之前的工作¹⁵发现靶细胞和接种剂量是HIV-1易感性的决定因素。因此，我们开始研究DMPA在这个Hu-mouse模型中如何影响阴道内HIV-1感染。我们的实验设计如补充图所示。¹.

简单地说，按照方法中的描述，用hCD34造血干细胞重建Hu-mice，并在90–120天后通过流式细胞术（补充图。²; 补充文件¹). 因为我们以前的工作¹⁵发现靶细胞是这些Hu-mice中HIV-1易感性的主要决定因素，Hu-mice具有> 外周血中10%的hCD45+细胞和< 外周血中10%的hCD45 hCD45+细胞均匀分布在我们的实验组（DMPA和间期）之间，并在阴道内用HIV-1 R5株（NLR4.3-Bal-Env）进行攻击。DMPA和间期Hu-mice的重组水平（“人源化”水平，肝内注射富含CD34的造血干细胞后90–120天外周血中的%hCD45）可在补充文件中找到¹当Hu-mice在发情周期的发情期（雌激素高）受到攻击时，在Hu-mice阴道内暴露后HIV-1感染的总比例为0/4（0%），在发情期的间期（孕酮高）受到挑战时为15/40（37.5%），在33/55（60.0%）当Hu-mice在皮下注射2 mg DMPA后1周受到激发时（图2A） ●●●●。感染人数受周期/激素状态的显著影响(对 = 0.013，方形）。在发情期（N = 4） ，双稳态（N = 11） 和DMPA（N = 11） ，暴露后3周（图2B） ●●●●。发情期受到攻击的Hu-mice没有感染，也没有检测到病毒滴度。在发情间期或服用DMPA后感染Hu-mice的患者在病毒脱落方面没有表现出任何显著差异（6.6 × 10⁴ ± 7.5 × 10^三与6.5相比 × 10⁴ ± 2.3 × 10⁴HIV-1拷贝/mL；对 = 0.12，Mann–Whitney）。由此我们得出结论，DMPA治疗的Hu-mice在感染后3周增加了对阴道内（IVAG）HIV-1的敏感性，但外周血中的病毒复制水平与间期感染的Hu-mic相似。

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图2

DMPA增加人源化小鼠的HIV-1感染。(A类)在发情期（N = 4） ，间期（N = 40）或收到DMPA（N）后1周 = 55). 用DMPA治疗的Hu小鼠感染HIV-1的数量（33/55（60.0%））明显多于在发情期（0/4（0%））或发情期（15/40（37.5%））受到攻击的Hu小鼠(对 = 0.013，方形）。(B类)在阴道内激发3周后，对Hu-mice的血液中的HIV-1滴度进行量化。发情时Hu-mice受到挑战（N = 4） 与那些在中间期受到攻击的人相比，没有感染，病毒滴度检测不到（N = 11） 或遵循DMPA（N = 11;对 = 0.0029，Kruskal–Wallis等级测试）*对 ≤ 0.05. **对 ≤ 0.01. 中的数据(A类)以比例（感染百分比）表示，数据以(B类)表示为平均值 ± 扫描电镜。DMPA公司去甲氧基孕酮醋酸酯，IVAG公司阴道内。

为了证实DMPA增加了IVAG暴露于HIV-1后的感染几率，使用单变量（未调整）和多变量（调整）广义线性模型估计了HIV-1暴露后Hu-mice中HIV-1感染与协变量之间的关系（表​（表1）。1). 在单变量分析中，Hu-mice用DMPA治疗（OR 2.50，95%CI 1.09–5.88；对 = 0.032），或> 10%循环hCD45+细胞（OR 2.92，95%CI 1.25-7.11；对 = 0.015），或受到高病毒剂量（10⁵)（比值比2.94，95%置信区间1.29–6.89；对 = 0.011）更有可能在IVAG HIV-1攻击后感染。在调整CD45和病毒剂量后，DMPA处理的Hu小鼠在IVAG暴露后感染HIV-1的可能性是在间突期间接种的小鼠的3.25倍（3.25 aOR，1.28–8.86 CI；对 = 0.016; N个 = 95; 55 DMPA，40间期）（表​（表1）。1). 在我们之前的研究中，血浆中hCD45+靶细胞的频率以及病毒接种剂量已被证明是HIV-1感染的决定因素(对 = 0.01537)¹⁵为了确保在月经间期发作的Hu-mice患者和DMPA后发作的Hu-mice患者的外周血目标细胞频率相等，对各组的平均重组（循环hCD45+细胞）进行了统计比较，未发现显著差异（10.8 ± 1.7%DMPA与12.5 ± 2.1%间期；对 = 0.5223 Mann–Whitney）。此外，我们观察到HIV-1靶细胞（hCD45+hCD3+）随时间推移在我们感染的Hu-mice中的典型丢失。无论Hu-mice是否接受过DMPA，在Hu-mice中都观察到了这一点，而在那些接受高（10⁵)或低（10^三)激发时的病毒剂量（补充文件²). 在阴道内HIV-1攻击后未感染的Hu-mice中未观察到hCD45+hCD3+细胞频率的降低（补充文件²)其中，在一些小鼠中，随着时间的推移，观察到这些细胞的频率增加，可能是因为在没有HIV-1感染的情况下，重组增加。因此，在受合成孕激素DMPA影响的Hu小鼠与处于发情周期的间挤/孕酮高阶段的Hu小鼠之间的直接比较中，发现DMPA在IVAG暴露后显著增强人源化小鼠的HIV-1感染（3.25aOR）。这表明DMPA增加了Hu-mice感染HIV-1的风险，甚至比发情周期中内源性孕酮增加的风险更大。

DMPA延长了人源化小鼠对HIV-1感染的易感性窗口

以前的研究表明，DMPA通过延长体内HSV-2的易感性而增加了病毒敏感性²⁴因此，我们接下来试图确定DMPA增加HIV-1易感性的机制之一是否是延长感染易感性的时间。如上所述，按照方法中所述，用hCD34造血干细胞重建Hu-mice，并在90–120天后通过流式细胞术（补充图。²; 补充文件¹). 我们皮下注射2 mg DMPA，并将Hu小鼠IVAG暴露于2（N = 4） ，3（N = 8） ，或4（N = 6） 给药后数周（补充图。¹)以确定小鼠对HIV-1保持敏感的时间长度。为了确保实验在生理上与血清中的激素水平相关，我们在IVAG激发时（DMPA给药后2、3和4周）对Hu-mice中DMPA的活性成分血清MPA进行了定量（图三A） ，正如我们之前的研究¹⁴在Hu-mice的所有组中，发现血清MPA水平与在女性循环MPA浓度的平台期观察到的水平相似¹³在DMPA治疗后2至4周内，治疗组小鼠的血清MPA水平显著降低，而对照组小鼠（未给予DMPA）未检测到MPA。当Hu-mice接种HIV-1（10⁵)在2（N = 4） 和3（N = 8） DMPA后几周，100%的Hu-mice患者易受感染（图三B） ，而在4（N = 6） DMPA后数周，83%的Hu-mice患者易感。从之前的实验来看，37.5%在月经间歇期被激发的Hu-mice易受HIV-1感染（图2A） ●●●●。这表明，与对照Hu小鼠相比，DMPA处理的Hu小鼠在很长一段时间内易受IVAG HIV-1感染，而对照Hu小鼠仅在间突期易受感染（图2A） 在小鼠生殖周期中持续2～3天。综上所述，这表明在服用DMPA后的4周内，Hu-mice对HIV-1持续敏感，而处于发情间期的小鼠只在发情周期的50%内敏感。

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图3

DMPA延长了人源化小鼠对HIV-1感染的易感性窗口。Hu-mice接受2mg皮下DMPA治疗，并在DMPA后2、3或4周接受HIV-1 IVAG激发（N = 18） 确定在DMPA治疗的Hu-mice中，HIV-1敏感性窗口是否比仅在月经间期对HIV-1敏感的循环Hu-mice延长(~ 发情周期的50%）。(A类)为了证实Hu-mice受到DMPA的影响，对DMPA中的活性成分MPA在血清中进行了定量。DMPA治疗后2至4周MPA下降，且DMPA治疗的Hu-mice的MPA量显著高于对照组（N = 4） 未收到DMPA（2.8 ± 2周时为0.6，1.4 ± 4周时为0.3，0.0 ± 对照组0.0 ng/mL；对<0.0001，单向方差分析）。(B类)根据补充图，Hu-mice在DMPA后2、3和4周用HIV-1感染IVAG。¹在2（N = 4） 和3（N = 8） DMPA后4周，100%的Hu-mice患者易感染HIV-1，而DMPA后第4周（N = 6） 83%的Hu-mice易感。相比之下，只有37.5%在间歇期受到攻击的Hu-mice易受HIV-1感染（图2). (C类)在激发后5周，比较各组之间的血浆病毒滴度，并且滴度没有显著差异。DMPA后2、3或4周攻击的Hu小鼠在感染后5周具有等效的HIV-1滴度（1.1 × 10⁵ ± 4 × 10⁴, 1.1 × 10⁵ ± 3.8 × 10⁴, 2.8 × 10⁴ ± 1.2 × 10⁴HIV-1 RNA拷贝数/mL；对 = 0.1497单向方差分析）*对 ≤ 0.05. ***对 ≤ 0.001. A和C中的数据表示为平均值 ± SEM，B中的数据以比例（感染百分比）表示。DMPA公司去甲氧基孕酮醋酸酯，IVAG公司阴道内，公共管理硕士醋酸甲羟孕酮（DMPA的有效成分）。

在激发后5周，用DMPA 2（N = 4） ，3（N = 8） ，或4（N = 6） 在HIV-1攻击前几周，没有观察到显著差异（1.1 × 10⁵ ± 4 × 10⁴, 1.1 × 10⁵ ± 3.8 × 10⁴, 2.8 × 10⁴ ± 1.2 × 10⁴HIV-1 RNA拷贝数/mL；对 = 0.1497单向方差分析）（图三C） 。因此，虽然DMPA延长了敏感性窗口，但它并不影响感染后5周的HIV-1血清滴度。

DMPA可降低阴道灌洗液中的HIV-1滴度，并增加人源化小鼠外周血中活化的靶细胞

在确定DMPA治疗的Hu小鼠感染HIV-1的几率高于在间挤期间受到攻击的Hu小鼠之后，我们试图确定阴道灌洗和/或外周血中的病毒脱落是否受到DMPA给药的影响。我们的实验设计如补充图所示。¹对感染10例HIV-1病毒的Hu-mice患者的阴道灌洗液和外周血中的病毒动力学进行跟踪（在感染HIV-1后1、3和5周）⁵（高剂量）HIV-1在间歇期（N = 14） 服用2 mg DMPA（N = 15） （图4A、 B）。DMPA治疗的感染HIV-1的Hu-mice在阴道灌洗液中的病毒滴度显著低于3（2.7 × 10⁴ ± 8.5 × 10^三DMPA与1.3 × 10⁶ ± 8.3 × 10⁵拷贝数/mL Diestrus；对 = 0.0005 Mann–Whitney）和5周（1.1 × 10⁴ ± 4.3 × 10^三DMPA与9.8 × 10⁴ ± 3.9 × 10⁴拷贝数/mL Diestrus；对 = 0.0420 Mann–Whitney）IVAG感染后比Hu-mice在月经间期感染（图4A） ●●●●。相反，IVAG HIV-1感染后1、3或5周，血浆滴度没有显著差异（图4B） ●●●●。为了确定DMPA治疗后感染的Hu小鼠中观察到的HIV-1抑制是否因感染时的病毒剂量而改变，在感染10^三（低剂量）HIV-1在间歇期（N = 8） 服用2 mg DMPA（N = 9） （图4C、 D）。与我们在DMPA治疗的Hu-mice感染10⁵HIV-1，DMPA治疗的Hu-mice感染10^三IVAG感染后3周，HIV-1在阴道灌洗中的病毒滴度显著低于间歇期感染的Hu-mice（3.5 × 10⁵ ± 2.3 × 10⁵DMPA与6.5 × 10⁶ ± 3.5 × 10⁶copies/mL间期；对 = 0.0109 Mann–Whitney）（图4C） 而血浆滴度保持不变（图4D） ●●●●。综上所述，这些结果表明，在DMPA治疗的Hu-mice早期感染期间，病毒滴度在阴道中受到抑制，而血浆滴度则不受影响。这些数据表明，尽管在DMPA的影响下，Hu-mice更容易感染HIV-1，但与间期感染的Hu-mice相比，他们最初（感染后1-3周）的阴道病毒滴度（病毒复制）较低。

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图4

DMPA可降低阴道灌洗液中的HIV-1滴度，并增加外周血中活化的靶细胞。(A类)通过临床实时PCR跟踪感染10例Hu-mice患者阴道灌洗过程中的病毒动力学⁵（高剂量）间突期HIV-1（N = 14） 或服用2 mg DMPA（N = 15). DMPA治疗的感染HIV-1的Hu-mice在阴道灌洗液中的病毒滴度显著低于3（2.7 × 10⁴ ± 8.5 × 10^三DMPA与1.3 × 10⁶ ± 8.3 × 10⁵拷贝数/mL Diestrus；对 = 0.0005曼-惠特尼）和5周（1.1 × 10⁴ ± 4.3 × 10^三DMPA与9.8 × 10⁴ ± 3.9 × 10⁴拷贝数/mL Diestrus；对 = 0.0420 Mann–Whitney）IVAG感染后比Hu-mice在月经间期感染。(B类)在10周后的第1、3或5周，未观察到血浆滴度的显著差异⁵间情期Hu-mice的IVAG HIV-1感染（N = 14） 或服用2 mg DMPA（N = 15). (C类)通过临床实时PCR跟踪感染10例Hu-mice患者阴道灌洗过程中的病毒动力学^三（低剂量）HIV-1在间歇期（N = 8） 或服用2 mg DMPA（N = 9). DMPA治疗的Hu-mice感染10^三HIV-1在阴道灌洗液中的病毒滴度在3（3.5）时显著降低 × 10⁵ ± 2.3 × 10⁵DMPA与6.5 × 10⁶ ± 3.5 × 10⁶拷贝数/mL Diestrus；对 = 0.0109 Mann–Whitney）在IVAG感染后的周数，而不是在间挤期间感染的Hu小鼠。(D类)在10周后的第1、3或5周，未观察到血浆滴度的显著差异^三间情期Hu-mice的IVAG HIV-1感染（N = 8） 或服用2 mg DMPA（N = 9). (E类)对未感染Hu-mice的外周血进行流式细胞术，以确定DMPA对活化的循环HIV-1靶细胞（hCD45+hCD3+hCD4+hCCR5+）的影响。在4周时，DMPA处理的Hu-mice中有更多活化的靶细胞（N = 7） 与DMPA后1周相比（N = 6） 或间期（N = 6) (66.9 ± DMPA后4周5.8%，而24.5周 ± DMPA后1周6.6%与20.1 ± 4.0%间期；对<0.0001单向方差分析）。1周的时间点对应于我们用HIV-1挑战Hu-mice的典型时间，而如果Hu-mice受到挑战和感染，则4周的时间点将对应于感染的第3周*对 ≤ 0.05. ***对 ≤ 0.001. 数据以平均值表示 ± 扫描电镜。DMPA公司仓库甲羟孕酮乙酸酯，Hu-mice公司人源化小鼠。

根据我们的滴度数据，我们推测，与间期感染的小鼠相比，DMPA治疗的Hu-mice可能会延迟病毒从阴道感染的初始点逃逸到体循环和外周组织。由于各组之间的血浆滴度没有显著差异，我们假设HIV-1可能会从阴道道逃逸，并在DMPA治疗的Hu-mice中更快传播，这可能是由于血液中HIV-1靶细胞增加所致。因此，我们对未感染Hu-mice的外周血进行流式细胞术，以确定DMPA对活化的循环HIV-1靶细胞（hCD45+hCD3+hCD4+hCCR5+）的影响（图4E） ●●●●。当未受感染的Hu-mice在间期外周血中的靶细胞（N = 6） 将其与未感染的Hu小鼠进行比较1周（对应于我们通常用HIV-1攻击Hu小鼠的时间；N = 6） 和4周（如果Hu-mice感染，则相当于感染的第3周；N = 7） DMPA治疗后4周，DMPA治疗的Hu-mice的外周血中hCD45+hCD3+hCD4+hCCR5+靶细胞明显多于DMPA或月经间期后1周（66.9 ± DMPA后4周5.8%，而24.5周 ± DMPA后1周6.6%，而不是20.1 ± 4.0%间期；对<0.0001单向方差分析）。这表明，在没有HIV-1感染的情况下，DMPA可增强给药4周后外周血中的循环HIV-1靶细胞。在存在HIV-1感染的情况下，我们观察到HIV-1病毒感染后阴道和外周血中hCD45+hCD3+hCD4+hCCR5+HIV-1靶细胞比例的典型下降（补充图。^三). 用流式细胞术定量阴道和外周血中hCD45+hCD3+hCD4+hCCR5+细胞的比例，阴道内感染HIV-1的Hu-mice阴道和外周血中hCD45+hCD3+hCD4+hCCR5+细胞的频率明显低于未感染Hu-mice（阴道：12.0 ± 阴道内感染HIV-1 5周后1.1%（N = 15） 与63.2相比 ± 未感染Hu-mice的5.5%（N = 23);对<0.0001 Mann–Whitney试验；外周血：12.0 ± 阴道内感染HIV-1 5周后1.1%（N = 15） 与63.2相比 ± 未感染Hu-mice的5.5%（N = 22);对<0.0001 Mann–Whitney试验）。

为了进一步支持我们的假设，即在DMPA治疗的Hu-mice中，与在月经间期感染的人相比，HIV-1从阴道道逃逸进入体循环的时间最初有所延迟，我们检测了病毒传播的程度。对间情期感染Hu-mice的匀浆（器官或组织）和体液（N = 4） 或使用DMPA（N = 4） 感染后1周和5周，如材料和方法（补充图。¹). 与DMPA治疗的Hu-mice相比，在月经间期感染的Hu-mic在感染后1周的病毒传播更广泛（补充图。⁴A、 B）。然而，在感染后5周，经DMPA治疗的Hu-mice与间情期感染的Hu-mic具有相似的病毒传播（补充图。⁴C、 D），可能是由于我们在外周血中观察到的hCD45+hCD3+hCD4+hCCR5+靶细胞增加（图4E） ●●●●。综上所述，我们的结果表明，DMPA最初抑制阴道道中HIV-1的局部滴度，并延缓病毒的全身传播。然而，在外周血中，DMPA似乎会随着时间的推移增加活化的靶细胞，这可能会使感染后5周内的病毒水平与间期感染的Hu-mice病毒水平相当。

DMPA不会改变Hu-mice阴道道中的炎性细胞因子

在确定DMPA与在间挤过程中用HIV-1攻击IVAG的Hu小鼠相比增加了感染，并且DMPA抑制了阴道冲洗液中的病毒滴度并最初减缓了病毒传播之后，我们想量化一组细胞因子和趋化因子在未感染的接受过DMPA或未接受DMPA的Hu-mice阴道匀浆中的含量。在未感染间期Hu-mice（N = 6） DMPA后1周（N = 6） 或DMPA后4周（N = 6; 如果Hu-mice感染，时间点将对应于感染后3周）。在23种量化的人类细胞因子/趋化因子中，有4种在间期Hu-mice与DMPA治疗的Hu-mice之间存在显著差异（图5)，与DMPA后4周相比，Hu小鼠间的差异最大。三种细胞因子，hIL12/p70（图5A；对 ≤ 0.0001单向方差分析），hTGF-α（图5B类；对 = 0.0003单向方差分析）和hVEGF-A（图5C类；对 = 0.0029单向方差分析），与DMPA后1周和月经间期患者相比，DMPA后4周Hu-mice患者明显更高，而一种细胞因子hFGF-2（图5D类；对 = 0.0125单向方差分析），与DMPA和间期后4周相比，DMPA后1周显著抑制。其他量化的细胞因子/趋化因子（包括hIL-1β）无显著差异(对 = 0.2427），hIL-4(对 = 0.1995），hIL-5(对 = 0.9854），hIL-6(对 = 0.1713），hIL-8(对 = 0.1146），hIL-9(对 = 0.9854），hIL-10(对 = 0.0655），hIL-13(对 = 0.5273），hTNF-α(对 = 0.2085），人干扰素-γ(对 = 0.0658），hMCP-1(对 = 0.3431），hMCP-3(对 = 0.3935），hGM-CSF(对 = 0.2697），hCX3CL(对 = 0.2720），hCXCL1(对 = 0.5866），hCCL22(对 = 0.3168），hsCD40L(对 = 0.0716）和hFlt-3L(对 = 0.1123）（补充图。⁵). 人IL-2低于检测限，无法在Hu-mouse阴道匀浆中定量。

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图5

DMPA改变Hu-mice的阴道细胞因子。在未感染（从未感染过HIV-1）的阴道匀浆中定量细胞因子 = 6） 1周时（N = 6） 或DMPA后4周（N = 6） 以确定DMPA是否改变了阴道细胞因子。1周的时间点对应于我们用HIV-1挑战Hu-mice的典型时间，而如果Hu-mice受到挑战和感染，则4周的时间点将对应于感染的第3周。(A类)hIL12/p70(对 ≤ 0.0001单向方差分析）(B类)hTGF-α(对 = 0.0003单向方差分析），以及(C类)人血管内皮生长因子-A(对 = 0.0029单因素方差分析）在DMPA后4周在Hu小鼠中显著高于DMPA和间挤后1周。(D类)hFGF-2型(对 = 0.0125单因素方差分析）在DMPA后1周显著抑制，而在DMPA和间期后4周显著抑制*对 ≤ 0.05. **对 ≤ 0.01. ***对 ≤ 0.001. ****对 ≤ 0.0001. 数据以平均值表示 ± 扫描电镜。DMPA公司去甲氧基孕酮醋酸盐。

我们还量化了未感染间期Hu-mice的阴道匀浆中的10种小鼠细胞因子/趋化因子（N = 6） DMPA后1周（N = 3） 或DMPA后4周（N = 三；如果Hu-mice感染，时间点将对应于感染后3周）。与DMPA治疗组相比，间期Hu-mice组的小鼠细胞因子/趋化因子定量值没有显著差异（补充图。⁶)对于mIL-1β(对 = 0.2479），mIL-2(对 = 0.8655），mIL-6(对 = 0.4051），mIL-10(对 = 0.4987），mIL-12/p70(对 = 0.5248），mGM-CSF(对 = 0.2909），mMCP-1(对 = 0.7291）或mTNF-α(对 = 0.4667). 小鼠IL-4和IFN-γ低于检测限，无法在Hu-mouse阴道匀浆中定量。

这些结果表明，DMPA对人类阴道细胞因子的最大影响发生在DMPA后4周，而不是DMPA后1周，并且我们量化的细胞因子/趋化因子很可能不会导致我们在本研究中看到的HIV-1感染增加，在给予DMPA的Hu-mice中（DMPA后一周感染）与间歇期的Hu-mice相比。

免疫荧光染色

实验设计如补充图所示。¹雌性C57BL/6小鼠（Charles River Laboratories，Constant，QC，Canada）通过将30µL PBS移液到阴道内外5–6次，并按照前面所述通过光学显微镜检查阴道细胞学来进行发情周期^34–37在发情期处死小鼠（N = 4） ，间期（N = 4） 或皮下注射2 mg DMPA（N = 4） （辉瑞公司，加拿大密西沙加），如Nguyen等人所述。将阴道组织嵌入OCT中并快速冷冻（Fisher Scientific，渥太华，安大略省，加拿大），并将5µm组织切片安装在载玻片上并固定在甲醇中。在3次PBS洗涤后，用10%的正常驴血清（Abcam，Cambridge MA）在4°C下培养切片1小时，然后用兔抗桥粒蛋白-1（克隆EPR6766（B））或单克隆兔IgG同型对照（克隆EPR15A，数据未显示）在室温下洗涤、培养过夜，用AlexaFluor 488标记的驴抗兔IgG（所有抗体Abcam）清洗并孵育1小时。所有抗体在PBS中用1%BSA和0.05%吐温20稀释。用DAPI对切片进行复染，并使用奥林巴斯IX81倒置显微镜（奥林巴斯，里士满山，加拿大）进行可视化。

体内阴道屏障通透性的功能评估

实验设计如补充图所示。¹通过量化穿过阴道上皮屏障进入血液的荧光素异硫氰酸盐葡聚糖（FITC-葡聚糖）的量，评估C57BL/6小鼠的阴道通透性。发情期小鼠（N = 4） ，间期（N = 4） 皮下注射2 mg DMPA（N = 4） 用氯胺酮麻醉，并用吸管将625µg FITC-右旋糖酐（加拿大安大略省奥克维尔Sigma-Aldrich）生理盐水注入阴道。4小时后，在牺牲时通过心脏穿刺收集血清。使用SpectraMax i3平板阅读器（美国加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件公司）测量荧光强度（激发，492 nm；发射，525 nm），并根据已知FITC-右旋糖酐浓度的板内标准曲线测定FITC的纯血清水平。FITC-右旋糖酐渗漏百分比是指血清中FITC-右旋糖酐与阴道内注射FITC-葡聚糖的比值，作为阴道屏障通透性的测量。

人源化小鼠

实验设计如补充图所示。¹。如前所述，生成了人源化小鼠（Hu-mice）¹⁵简而言之，经父母同意，从麦克马斯特大学医学中心出生的健康新生儿获得脐带血，并由RosetteSep脐带血前体增菌试剂盒（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市干细胞技术公司）处理，冷冻保存至需要时。四天大节点-Rag1^tm1毫米Il2rg公司^tm1Wjl公司对（NRG）小鼠进行亚致死性照射（γ射线，300 cGy），并在肝内注射1 × 10⁶至2 × 10⁶富含CD34的造血干细胞。注射后90–120天，通过定量外周血单个核细胞（PBMCs）中hCD45、hCD3、hCD4和小鼠CD45的表达，通过流式细胞术评估人类免疫细胞重建百分比，如Nguyen等人，2017。这些Hu-mice将人类细胞植入外周血和身体组织¹⁵。本文所述实验中使用的Hu-mice的平均人类免疫细胞重建是外周血中12%的hCD45+细胞（如补充图中的第一组门控策略所示）。¹，在第一个栅极中显示%hCD45）。本文实验中使用的Hu小鼠年龄在3个月至6个月之间。表中包括Hu-mice的重组水平、HIV-1剂量、外周血（PB）滴度、阴道灌洗（VL）滴量和感染状态​表11在补充文件中找到¹.

阴道内HIV-1挑战

实验设计如补充图所示。¹在HIV-1感染前一周，女性Hu-mice皮下注射2 mg DMPA（加拿大米西索加辉瑞公司）（N = 55-平均人类免疫重建：实验前外周血中有11%的hCD45+hCD3+hCD4+细胞）。其他雌性Hu小鼠按照Nguyen等人，2017进行发情周期分期，并在发情期（孕酮高）用HIV-1攻击（N = 40平均人类免疫重建：实验前外周血中有12%的hCD45+hCD3+hCD4+细胞）或发情期（雌激素高）（N = 4). 给Hu-mice注射IP麻醉剂（每公斤150毫克氯胺酮/10毫克甲苯噻嗪每毫升），置于仰卧位，用改良棉签轻轻擦洗阴道，轻轻清除阴道粘液（在所有小鼠中进行）。检查阴道拭子是否有血液污染，作为阴道外伤的迹象。在这些实验中，没有发现任何Hu-mice的阴道损伤迹象。Hu-mice阴道内接种25µL的10^三（低）至10⁵（高）TCID₅₀/mL NL4.3-Bal-Env HIV-1，使用移液管。接种后Hu-mice保持仰卧大约1小时。Nguyen等人，2017年描述了NL4.3-Bal-Env HIV-1的产生。另一组Hu-mice（N = 18） 在服用DMPA后2、3或4周接受激发，以检查DMPA对HIV-1易感性窗口的影响。

血清MPA定量

Hu-mice（N = 18） 根据制造商的方案，在DMPA后2、3或4周通过脸颊出血进行放血，以通过ELISA（EuroProxima，Arnhem，Netherlands）对血清中的MPA进行重复定量，并进行修改（Smith 2014）³⁸从NRG小鼠（N = 4） 从未作为阴性对照暴露于DMPA。检测的分析限为0.5 ng/mL。

HIV-1滴度的定量

在HIV-1感染后1、3和/或5周，通过面颊或眼眶出血，在血浆分离管（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）中采集外周血。全血以15000 RPM离心8分钟以分离血浆。血浆随后被冻结在− 80°C直到需要。在HIV-1感染后1周、3周和/或5周通过吸管收集阴道灌洗液2 × 30μL无菌PBS进出阴道3-4次。阴道灌洗液冻结在− 80°C直到需要。血浆和阴道冲洗液用干冰送至西奈山微生物实验室（加拿大安大略省多伦多），使用雅培实时HIV-1 m2000（美国伊利诺伊州雅培实验室）对HIV-1 RNA进行临床实时PCR定量。该方法的敏感性和特异性分别为91.8%和100%³⁹，检测限为40拷贝/mL（更多信息请参见：https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-dises/realtime-hiv-1-病毒载量).

IVAG HIV-1感染后1或5周收集组织（心脏、直肠、结肠、小肠、肾脏、肝脏、脾脏、肺、大脑、骨骼肌、骨髓、膀胱、胸腺、肠系膜淋巴结、阴道和子宫），并使用Gold BulletBlender（Next Advance，Averill Park，NY）在PBS中均质。离心匀浆（8000 RPM，5分钟），上清液储存在 80°C直到需要。组织上清液被送往西奈山微生物实验室（加拿大安大略省多伦多），用于HIV-1 RNA的临床实时PCR定量（补充图。⁴).

流式细胞术

通过脸颊出血（如上所述）或在实验终点通过心脏穿刺采集血液⁴⁰在ACK裂解缓冲液（2 mL，4 min；然后500μL，1 min）作用下从血液中回收PBMC，并用PBS中和。所得细胞制剂在血细胞仪上计数，再悬浮至最终浓度1-3 × 10⁶细胞/mL，并染色用于流式细胞术。

在冰上阻断Fc受体20分钟后，用抗体[hCD45-V450，hCD4-PerCP-Cy5.5，hCD8-PE-Cy7（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）；hCD3-BV605，hCCR5-AF647（Biolegend，San Diego，CA，US）；mCD45-AF700（eBioscision，San Disego，加利福尼亚州，US）]对PBMC染色30分钟。数据立即在BD LSRII流式细胞仪（加拿大BD Biosciences）上获得，并使用FlowJo软件（10.0.8版）（美国俄勒冈州阿什兰市Treestar）对结果进行分析。选通策略如补充图所示。².

阴道细胞因子定量

在终点，从未感染的间歇期Hu-mice（N = 6） DMPA后1周（N = 6） DMPA后4周（N = 6） 并如上所述在PBS中机械均质。对阴道匀浆进行离心，并使用人类细胞因子阵列聚焦13-plex（HDF13）和特征人类细胞因子/趋化因子阵列11-plex（HCYTP-11-34）（加拿大阿联酋卡尔加里Eve Technologies）在上清液中对总共23种独特的人类细胞因子／趋化因子进行重复量化。

小鼠细胞因子/趋化因子在未感染间期Hu-mice（N = 6） DMPA后1周（N = 3） DMPA后4周（N = 3） 使用鼠标聚焦10-plex（MDF10）发现分析（Eve Technologies）。

免疫组织化学

未感染Hu-mice（N = 5间挤，N = DMPA后1周6次，N = DMPA后第4周5次）固定在10%福尔马林中，处理后包埋在石蜡中。切片切割为4µm，脱蜡，然后用5%H封闭后染色₂O（运行）₂在TBS-T（20分钟）或Bond表位检索2系统（Leica Biosystems，Concord，ON，Canada）中用5%的正常山羊血清阻断。切片用（1）兔单克隆抗人CD3（ab16669，Abcam，Cambridge，MA，USA）培养，在PowerVision IHC Superblocking（徕卡生物系统）中稀释1:150；（2） 小鼠单克隆抗人CD4（徕卡生物系统），在PowerVision（徕卡生态系统）中稀释1:50；（3） 兔单克隆抗人CD11c（ab52632，Abcam），使用PBS中0.1%的BSA作为稀释剂以1:500稀释，以及（4）未稀释的鼠单克隆抗人类CD68（KP1，Dako Canada Inc.，Burlington，ON）。使用Bond Polymer Refine试剂盒（Leica Biosystems）对CD3（不包括初级后步骤）和Bond RX自动玻片染色器上的CD4染色进行检测（莱卡生物系统），而使用兔子和老鼠Vectastain ABC试剂盒（Vector Labs，加拿大安大略省伯灵顿市）对CD11c和CD68进行检测。所有载玻片均以DAB作为染色原进行染色，并用苏木精进行复染。使用奥林巴斯IX81倒置显微镜（奥林巴斯，里士满山，加拿大）对图像进行可视化，并使用Infinity相机（Lumenera Corp.，渥太华，加拿大）进行拍摄。

作者感谢Ana Aquino的技术支持。本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR运营拨款FRN#126019（C.K.））的资助；CIHR HIV疫苗开发粘膜免疫学研究小组拨款FRN#138657（C.K.）、安大略省HIV治疗网络（OHTN）应用HIV研究主席（C.K..）、安省大学理事会（COU）颁发的安大略妇女健康学者奖（J.M.W.）和加拿大卫生研究院奖学金（J.M.W）。