人类的生殖周期称为月经周期，持续约28天，而啮齿类动物的这一周期称为发情周期，持续大约4-5天。所有哺乳动物的繁殖成功取决于下丘脑-垂体-性腺轴的功能。女性中隔区和下丘脑中的促性腺激素释放激素（GnRH）神经元将轴突发送至正中隆起。在那里释放的GnRH到达垂体前叶，在那里促性腺激素被刺激分泌黄体生成激素（LH）和卵泡刺激激素（FSH）。在外周循环中，这些激素刺激卵巢中的特定细胞，导致排卵。卵巢卵泡分泌雌激素（E2），到达下丘脑。大多数时候，E2的血浆浓度很低。然而，在排卵前期，E2分泌达到峰值，GnRH神经元受到刺激(Sarkar等人，1976年；弗里曼，1994年). E2似乎通过中间神经元间接调节GnRH神经元。然而，在这一领域有许多问题需要回答。重要的是，由于E2具有多种作用，不仅在神经内分泌领域提出了问题，而且在神经科学（例如突触可塑性、记忆和学习以及神经变性疾病）以及研究心脏和/或肾功能、钠和水平衡等领域也提出了问题。
短的周期长度使啮齿类动物成为研究繁殖周期中发生的变化的理想动物模型，历史上大鼠一直是被选择的模型。大鼠显示，大多数时间，周期规则；它们易于操作；即使在动物设施中有常规压力，循环也不会轻易中断。然而，随着小鼠品系的使用不断增加，对研究人员来说，了解小鼠的发情周期至关重要，事实上，许多基因敲除小鼠可能表现出青春期/生育能力的变化，而这些变化只会影响基因敲除品系的维持。很少有关于小鼠发情周期的研究发表。发情周期的各个阶段不像大鼠那样肉眼可见，处理老鼠需要更加小心，因为它们的攻击行为。许多涉及生殖和神经内分泌系统的研究已经在基因敲除小鼠中进行，而对照组通常涉及卵巢切除和卵巢类固醇替代模型。这个模型运行良好，可以回答许多问题，但在某些实验中，完整的动物可能是最佳选择。
在涉及生殖系统和发情周期对非生殖功能影响的研究中，阴道涂片细胞学用于确定发情周期的阶段(Long&Evans，1922年). 该方法根据阴道涂片中观察到的三种细胞类型（上皮细胞、角化细胞和白细胞）的比例预测发情周期。因此，本单元的目的是提供快速准确收集阴道涂片和测定小鼠发情周期阶段的方案(马可德斯，2002年).
本单元详细描述了小鼠发情周期的各个阶段（参见发情周期阶段和激素注意事项的描述）。因为涉及动情周期的实验是在青春期后的动物身上进行的，所以包括了确定阴道开口（VO）的程序（见基本方案1），然后描述了如何操纵雌性小鼠、获取阴道分泌物和确定动情周期阶段（见基本方案2）。
注：所有使用活动物的协议必须首先由机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准，并且必须遵循官方批准的实验动物护理和利用程序。
发情周期各阶段的描述和激素因素
小鼠和大鼠的完整发情周期发生在4或5天以上，可分为四个阶段。
1.发情期
在此阶段，有核上皮细胞占优势(). 这些细胞可以集群出现，也可以单独出现。有时，样品中可能会出现一些角化细胞。这一阶段对应于排卵前一天，此时E2增加(Walmer等人，1992年)因此，在夜间，LH和FSH激增并排卵(Parkening等人，1982年).
（A）发情前期小鼠未染色阴道分泌物的显微照片，主要由有核上皮细胞组成；（B） 发情期，无核角化细胞；（C） 发情期，由白细胞、角化细胞和有核上皮细胞三种类型的细胞组成；（D）间期，主要由白细胞组成。有核上皮细胞（N）、白细胞（L）、角化细胞（C）。
2.发情
这一阶段的显著特征是角化鳞状上皮细胞成簇出现(). 没有可见的细胞核；细胞质呈颗粒状；形状不规则。E2在整个上午都保持升高，下午又回到基本水平(Walmer等人，1992年).
3.气象
在这个阶段，有多种细胞类型，主要是白细胞和少数有核上皮和/或角质化鳞状上皮细胞(). 血浆E2浓度低(Walmer等人，1992年).
4.间期
这一阶段主要由白细胞组成(). 在此阶段，E2水平开始增加(Walmer等人，1992年).
在发情期、动情间期和发情间期，LH和FSH的血浆循环较低(Parkening等人，1982年).
注：因为动物可能会表现出最初的处理压力，所以在分析的前三天可能很难区分发情周期的阶段。在这段时间之后，动物们开始习惯于操作，因此材料的收集趋于改善。
基本方案1：评估小鼠阴道开口
阴道开口是一种凋亡介导的事件(罗德里格斯等人，1997年)用作青春期开始的外部指标。它是雌二醇分泌增加的结果，可以通过向未成熟小鼠或大鼠注射雌二醇来刺激(Ojeda和Urbancki，1994年). 虽然大鼠的阴道开口与第一次排卵同时发生，但小鼠的阴道开口可能发生在第一次阴道角化和发情周期开始前10天(Nelson等人，1982年).
从24天到30天每天早上监测小鼠，记录小鼠阴道开口的年龄。通常通过对外阴的简单目视检查来检测开口。在小鼠中，阴道开口发生在26天左右。
材料
选择一种方法来识别每种动物。通常使用耳塞和脚趾夹。正确处理老鼠对减少老鼠的压力，同时保护处理者免受伤害（如咬伤）至关重要。
用占优势的手抓住尾巴底部抬起老鼠；然后，用另一只手抓住颈部（拇指和食指之间）松弛的皮肤。抬起动物并用一只手约束。[通过抬起鼠标，让鼠标用前肢抓住金属丝笼顶部或其他表面，然后操作人员可以抓住颈背（颈背）区域的皮肤，这会变得更容易。]翻转鼠标，使鼠标的重量停留在手掌中。通过将尾巴放在处理者的第四和第五个手指之间来限制鼠标的下半部().
为分析阴道开口和收集阴道分泌物而采用的适当方法。用非惯用手抓住拇指和食指之间颈背松弛的皮肤，用一只手约束动物。然后将动物倒置在手掌中，并将尾巴放在处理者的第四个和第五个手指之间。
一旦用一只手抓住老鼠，用另一只手检查外阴，看看阴道是否完全打开(). 重要的是要确保没有分泌物堵塞阴道入口。因此，重要的是用一块蘸有生理盐水的棉花清洁外阴。
大约26天大的小鼠阴道开口，显示阴道腔闭合（A，B）和阴道腔开放（C，D）。
基本方案2：收集和分析阴道分泌物（“湿涂片”）
本方案描述了一种快速获取用于分析啮齿动物发情周期阶段的材料的方法。因为发情周期的某些阶段很短（例如，发情后期），所以每天在同一时间收集材料很重要。如果本研究的目的是在不同阶段使用骑自行车的小鼠或测试药物对骑自行车的影响，则在操作之前应至少记录两个连续的基线周期。
材料
识别并抑制小鼠（参见BASIC PROTOCOL 1，). 将充满PBS或生理盐水（～10μL）的塑料吸管尖端放入阴道。用相同的PBS/生理盐水轻轻冲洗阴道三到五次(). 收集移液管尖端的最终冲洗液。A类容量为10μL的生理盐水可以收集足够的材料用于阴道细胞学观察
收集小鼠阴道分泌物。用处理者的非支配手将雌性小鼠束缚住后，用支配手将充满0.9%生理盐水或PBS的塑料吸管（～5mm）尖端插入小鼠阴道（a，详见b），冲洗液体以收集样品。
将含有阴道液的最终冲洗液放在玻璃载玻片上。印刷幻灯片非常有用，因为它们有助于避免混合不同动物的样本(). 然而，常规细胞学玻片可以与每只动物的一张玻片一起使用。
塑料吸管内充满0.9%的生理盐水（a），带有尖端细节（b）。将阴道液放置在打印的载玻片（c）上，以便在显微镜上进行进一步分析。
用10倍物镜在光学显微镜下观察未染色材料。没有必要使用盖玻片。如果液滴变干，可以用另一个干净的移液管尖端添加更多的盐水（<10μl）来润湿。为了观察细胞，在显微镜中使用低照度，而不使用聚光镜来确保良好的对比度。
使用40倍物镜比使用10倍物镜更容易表征细胞类型。然而，发情周期阶段的确定是基于三种细胞类型之间的比例，如果使用10倍的目标，这更容易区分。
显示了小鼠发情周期四个阶段阴道分泌物中细胞的典型显微照片。尽管图片不是彩色的，但通过与经典染色技术（巴氏染色法和亚甲蓝染色法）进行比较，对大鼠进行的评估“湿涂片”可靠性的研究表明，直接检查（“湿涂膜”）技术也可以获得相同的结果。因此，没有必要使用耗时、不太实用和更昂贵的技术，如巴巴尼科劳或亚甲基蓝(Yener等人，2007年).
