Depot醋酸甲羟孕酮增加人阴道粘膜组织中的免疫细胞数量和激活标记物

摘要

介绍

D类环氧丙烷甲羟孕酮醋酸盐（DMPA，Depo-Provera）是世界上使用最广泛的避孕药具之一¹以及美国目前唯一可用的注射避孕药。²它是一种高效、长效、可逆的避孕药具，几乎没有绝对禁忌症。^三然而，有人担心DMPA对女性生殖道的影响，特别是对粘膜人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染的潜在促进作用。^4–7最近的一项研究再次引发了这一问题，该研究显示，使用DMPA的血清不一致的夫妇中，女性感染HIV-1的几率增加。⁸为了应对这场日益激烈的辩论，世界卫生组织召开了一次国际技术协商会议，以确定是否应更改避孕药具使用的医疗资格标准。发布了一份支持针对DMPA的MEC类别1的技术声明，但由于现有数据的不一致性，澄清了使用孕激素注射避孕法的妇女应强烈建议也使用避孕套和其他措施来防止HIV-1感染。⁹

因此，阐明外源性激素和粘膜对HIV-1易感性之间的相互作用至关重要，因为女性感染HIV-1的主要途径是通过异性性交。¹⁰在非洲和泰国进行的几项大型流行病学研究发现，与不使用激素避孕的女性相比，使用DMPA的女性感染HIV-1的可能性更大，即使控制了某些混杂变量，如性交频率、年龄和性伴侣数量。^8，11–14然而，与大多数观察性研究一样，并非所有的方法学考虑因素都能得到适当控制，例如持续使用避孕套或其他重要的未知混杂因素。¹⁵

关于外源性孕酮如何增加生殖器组织对HIV-1感染的敏感性的理论主要集中在上皮变薄和局部粘膜免疫的改变上。上皮细胞层数量或细胞间连接蛋白密度的减少可能会增加颈阴道粘膜靶细胞对HIV-1的暴露。在非人灵长类HIV感染模型中，孕酮和DMPA的使用会导致阴道上皮显著萎缩，DMPA（30 mg）通常用于提高猴免疫缺陷病毒（SIV）或HIV嵌合变异体（SHIV）阴道感染的效率。^16–21然而，关于外源性孕激素对人类阴道上皮厚度影响的数据喜忧参半，从无变化到增减厚度不等，^5，22–24短期（3-6个月）^5，22和长期（2-3年）²³DMPA用户。

DMPA还可以通过改变宫颈阴道粘膜免疫反应来影响粘膜对HIV-1感染的敏感性。虽然子宫颈和阴道可能是女性感染HIV-1的初始部位，但外源性雌激素和孕酮对下生殖道局部免疫环境的影响尚未明确阐明，^24–29大多数数据集中于子宫内膜内的生物学机制。³⁰

本研究的目的是比较正常月经周期和单次注射DMPA后3个月内女性的免疫细胞群和上皮完整性标志物，以确定外源性和内源性孕酮是否改变阴道粘膜的细胞免疫炎症状态。为此，我们检测了携带CD45、CD3、CD4、CD8、CD1a和CD68抗原的阴道白细胞，活化和增殖标记物，如HLA-DR、CCR5和Ki-67，以及上皮结合蛋白带状闭塞素1（ZO-1）和E-cadherin，特别是在撒哈拉以南非洲等高风险地区，迫切需要探索支持DMPA等有效避孕药物与HIV-1易感性增强之间关系的可能生物机制。

材料和方法

结果

在参与研究的20名女性中，最初报告的结果是16名女性完成了所有研究访问。⁵在这16名女性中，有15名女性的石蜡切片适合于本研究的分析。女性平均年龄35.9（±3.1）岁，体重158.5（±25.0）磅，平均月经周期29.0（±1.4）天。所有15名女性此前均怀孕，平均妊娠率为2.7（±1.1）。

我们发现对照月经周期黄体期和卵泡期组织中阴道免疫细胞数量、激活标记物、上皮连接蛋白、细胞层数或上皮厚度之间没有显著差异（全部第页>0.05).

表1显示了卵泡期和黄体期以及DMPA治疗后免疫细胞群中位数的差异。CD45、CD3、CD8、CD68、CCR5的中位数显著增加⁺，和HLA-DR⁺DMPA治疗后的免疫细胞与对照周期的卵泡期和/或黄体期进行比较。免疫细胞在上皮组织中呈随机分布，在月经周期的任何阶段或DMPA治疗后均未观察到聚集或差异定位。图1（点图）显示，与滤泡期相比，DMPA暴露后获得的组织中免疫细胞数量增加。它还显示了对DMPA反应的个体间差异，一些受试者的免疫细胞变化比其他受试者大。与黄体期样本相比，接触DMPA的阴道组织CD3密度增加⁺，CD8⁺和CCR5⁺免疫细胞。他们还显示HLA-DR增加⁺细胞，与滤泡期采集的组织相比，具有统计学意义。图2显示了卵泡期、黄体期和DMPA期阴道粘膜中这些细胞的合成图像。

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图1。

阴道免疫细胞群的个体变化，比较卵泡期和醋酸甲羟孕酮（DMPA）治疗后的个体变化。总细胞密度（细胞/mm²)为每个受试者绘制选定的免疫细胞标记。尽管个体反应存在显著差异，但大多数样本显示免疫细胞和激活标记物的数量增加。在某些情况下，增长幅度是原来的几倍。除CCR5外，所有上皮细胞均被定量⁺和CD4⁺细胞，仅在固有层中检测到。

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图2。

卵泡、黄体和DMPA治疗后的阴道免疫细胞。卵泡期阴道活检石蜡包埋组织块的免疫组织化学染色（A、D、G、J），黄体期（B、E、H、K），注射DMPA后3个月（C、F、I、L）暴露于DMPA的阴道组织CD3密度显著增加⁺ （A、B、C），CD8⁺ （D、E、F）和CCR5⁺ （G、H、I）细胞与黄体期相比，HLA-DR的表达更高⁺ （J、K、L）细胞与卵泡期相比。使用针对每种标记物的特异性单克隆抗体鉴定细胞表型，并用每平方毫米组织表达细胞密度（细胞/mm²).

值得注意的是，我们发现很少有CD4⁺只有三个阴道组织样本中的细胞（来自总共43个CD4可评价样本）。这些细胞仅局限于每个组织样本的固有层。CD4细胞⁺细胞计数为11.6个/mm²（一名处于卵泡期的受试者）和9.3和6.3个细胞/mm²（针对DMPA治疗后的两名受试者）。值得注意的是，在CD4⁺可见细胞，有炎症的组织学证据，白细胞数量增加。

就上皮完整性的测量而言，与卵泡期相比，黄体期和DMPA给药后的上皮厚度和细胞层数有下降的趋势，尽管没有统计学意义(表2). 事实上，Ki-67增加了⁺上皮细胞是细胞增殖的标志物，当比较DMPA治疗与卵泡期或黄体期基线时(表2). 各组上皮紧密连接和粘附蛋白（E-cadherin和ZO-1）的密度无差异(表2和图3).

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图3。

DMPA治疗不会改变上皮连接蛋白密度。上皮紧密连接蛋白E-cadherin的免疫标记（A–C）和粘附连接蛋白ZO-1（D–F）卵泡期阴道组织活检（A，D）和黄体期（B、E），以及DMPA给药后（C、F）。未观察到密度的统计显著差异。根据阳性染色颜色，使用每个区域的积分光密度（IOD）计算蛋白质表达。

讨论

与正常月经周期的卵泡期和黄体期相比，单剂量DMPA暴露会引起人类阴道粘膜免疫细胞群的变化。这些变化包括白细胞（CD45）数量增加⁺细胞）和携带CD3、CD8、CD68、CCR5和HLA-DR的免疫细胞⁺阴道组织活检中的细胞非常稀少，我们在任何采样时间都无法检测到该细胞亚群的统计显著差异。与粘膜免疫细胞群中观察到的变化相反，在上皮厚度、细胞层数或细胞间连接蛋白方面，我们没有发现有统计学意义的变化。

粘膜免疫系统的变化可能会增加感染HIV-1的风险，这是在某些流行病学研究中报告的，研究对象是使用DMPA和其他仅含孕激素的注射避孕药的妇女。^8，11–14CCR5表达细胞的扩增是阴道粘膜的关键变化之一，可能会增加对HIV-1感染的敏感性。我们发现DMPA治疗后，阴道组织中携带此标记的细胞显著增加。除了作为趋化因子CCL5（RANTES）的受体外，CCR5还是人类粘膜HIV-1感染的主要辅受体，被认为是病毒进入女性生殖道下部粘膜组织的主要靶点。^31–33人宫颈粘膜CD4⁺T细胞表达CCR5，通常与HIV-1进入的其他次级受体结合。^34，35此外，在人类和猕猴的下生殖道内，CCR5在粘膜树突状细胞和巨噬细胞上表达，它们也是HIV的主要靶细胞。虽然大多数研究组发现CCR5在上皮内CD1a上不表达⁺朗格汉斯细胞，有一些证据表明，这些细胞中也可能存在受体。^36–38我们的发现与在体外模型显示，黄体酮治疗外周血单核细胞（PBMC）可使CD14中CCR5的调节增加5至10倍⁺单核细胞/巨噬细胞。³⁹此外，研究发现处于各种孕酮显性状态的女性，表达CCR5的宫颈和阴道淋巴细胞表达增加。^39–41有趣的是，他们也被证明增加了获得HIV-1的敏感性。^42–45

已知CCR5由活化的淋巴细胞表达。⁴⁶淋巴细胞活化的另一个标志是组织相容性抗原HLA-DR⁺HIV-1感染早期存在T细胞^47–49并且被认为是导致HIV-1从粘膜门向引流淋巴结和远处传播的细胞群的主要原因。⁵⁰动物模型显示HLA-DR⁺-活化的T细胞和巨噬细胞在SIV/HIV感染的早期被有效感染，并构成病毒的主要靶点之一。^51，52

在我们的研究中，DMPA增加了CD3⁺T细胞与HLA-DR⁺细胞。我们的发现与一项大型纵向研究一致，该研究发现，在使用激素避孕的女性的宫颈阴道灌洗液（CVL）中，白细胞（WBCs）和多形核单核细胞（PMNs）增加。⁵³CD3细胞⁺据广泛报道，细胞是阴道的主要淋巴细胞群。^54–57虽然子宫颈和阴道中的CD3数量不如上生殖道中的多⁺尚不清楚T细胞群会受到月经周期激素波动的影响。^54，56CD3的两个主要子集⁺T细胞是CD4⁺和CD8⁺细胞^56，57; 然而，CD8⁺T细胞数量超过CD4⁺阴道上皮中的T细胞高达8:1。^58，59CD4细胞⁺T细胞是宫颈阴道粘膜HIV-1感染的关键靶点。³²女性生殖道下部的其他携带CD4的细胞是树突状细胞（DC）和巨噬细胞。³⁷ 体内和体外数据表明上皮内和粘膜下DCs和CD4⁺T淋巴细胞和巨噬细胞是HIV-1的第一批靶向细胞。^{32，50，60–63}我们检测到少量含有CD4的阴道组织活检⁺细胞，而观察到的细胞仅局限于固有层。值得注意的是，在CD4⁺检测细胞，观察到亚临床炎症。这与之前描述CD4数量和分布有限的报告一致⁺阴道上皮细胞，尤其是在没有感染或其他炎症的情况下。^{28，34，36，59，64}在这项研究中，STI或其他症状性阴道炎症感染（如细菌性阴道病或滴虫病）的存在是排除性的。我们发现CD4的数量和局限性相似⁺新鲜、无火焰阴道组织粘膜中的固有层细胞，取自接受前后手术修复的患者（数据未显示）。此外，使用淋巴结组织的平行阳性对照显示了CD4的稳健标记⁺细胞，表明我们的发现不是由于检测中的技术问题（数据未显示）。

CD4的存在⁺鉴于HIV传播的低发生率、HIV穿透完整上皮的能力以及CD4的增加，小部分活检组织中的细胞并不排除其在宫颈阴道获得HIV-1中的重要性⁺炎症粘膜部位的细胞数量。^65，66此外，在DMPA使用者的观察性研究中报告的HIV-1易感性的平均增加具有1.50（1.07–2.09）的近似平均调整HR。^{6，14，67，68}因此，艾滋病毒细胞靶点数量的增加，即使只存在于一小部分使用者中，也可以证明在DMPA使用者人群中获得感染的风险增加相对较小。在我们的研究中，尽管并非所有标记物都一致，但某些受试者的T细胞、巨噬细胞或活化免疫细胞（HLA-DR）显著增加⁺和CCR5⁺) (图2).

我们还发现CD8显著增加⁺DMPA治疗后阴道组织中的细胞，与之前对长期DMPA使用者的研究一致。²⁴CD8（CD8）⁺T细胞可以发挥细胞溶解或抑制功能。在整个月经周期中，宫颈和阴道都有细胞溶解活性。⁶⁹然而，阴道CD8⁺T细胞大部分缺乏TIA1，这是一种指示淋巴细胞细胞溶解功能的标记物。²⁶除了比CD4更流行之外⁺，第8区⁺宫颈阴道组织中的T细胞具有较高的激活标记表达和增强的效应记忆表型。⁷⁰CD8隔离人群⁺组织记忆T（T_{马来西亚令吉})细胞在皮肤和粘膜表面（包括阴道表面）似乎很常见，并且可以通过抗原特异性和抗原非特异性刺激进行回忆。^71，72尽管CD8的存在⁺阴道上皮中的T细胞似乎对各种病原体具有保护作用，⁷³CD8（CD8）⁺共表达转录因子Foxp3的T细胞也可以通过调节性T细胞表型（Treg）发挥抑制功能。⁷⁴孕酮及其衍生物甲羟孕酮与生殖道免疫抑制、抑制抗体生成、细胞介导免疫反应和先天免疫有关。⁷在月经周期的黄体期，先天性抗菌水平下降，外源性孕酮抑制阴道上皮细胞中人类β-防御素-2的生成。^75，76MPA还减少人和小鼠树突状细胞产生TLR9诱导的干扰素（IFN）-α，从而减弱潜在的抗病毒反应。⁷⁷DMPA可能通过CD8抑制粘膜抗病毒机制⁺T细胞。DMPA治疗刺激循环CD8⁺猕猴的Treg反应。⁷⁸因为我们只测量了CD8的密度⁺在本研究中，细胞无法进行功能测定或确定辅因子的表达，我们无法阐明这些细胞在阴道上皮中的免疫功能。

DMPA与阴道上皮变薄有关。²²与卵泡期相比，我们观察到黄体期和DMPA活检的上皮厚度有减少的趋势。然而，通过方差分析和配对分析，这种趋势在统计学上并不显著t吨三个采样间隔的比较测试。数据趋势表明，在比较卵泡期与黄体期或DMPA使用情况时，女性平均会失去细胞层，从而失去上皮厚度。然而，存在个体差异。例如，在比较卵泡期与DMPA治疗后或卵泡期到黄体期时，15名女性中有7名增加了阴道上皮细胞层的平均数。在之前对这些组织的分析中，用两种不同的方法测量了上皮厚度和细胞层数量，并注意到在测量中观察者之间的差异高达34%。⁵几个小组已经调查了服用DMPA后上皮厚度变化的问题，报告的不一致结果可能反映了测量方法、统计分析、观察者偏差、组织取样时间、药代动力学、，以及对DMPA生物反应的个体间差异。此外，在人类中施用DMPA似乎不会导致在猴子模型中观察到的一致且显著的上皮萎缩，尽管应该在猴子中进行更好的剂量-反应研究，以确定DMPA的剂量，从而导致与人类的药代动力学等效。

为了进一步研究上皮完整性问题，我们测量了细胞间粘附蛋白E-钙粘蛋白和ZO-1的密度，它们都定位在人类阴道和宫颈中，⁷⁹假设这些蛋白的减少会导致上皮细胞的通透性增强。此前已有研究表明，阴道雌激素会改变阴道上皮紧密连接处的浓度，⁸⁰但没有数据表明DMPA对上皮紧密连接蛋白的影响。我们发现，单次给予DMPA并没有显著改变阴道上皮中E-cadherin或ZO-1的密度。众所周知，细胞间黏附蛋白在阴道上皮顶部的浓度较低，因为这些上皮细胞失去了细胞间的黏附，最终脱落到腔中。⁷⁹我们还发现，与黄体期和卵泡期相比，DMPA给药后，Ki-67标记确定的上皮细胞增殖显著增加。然而，细胞层数或上皮细胞厚度的任何形态学变化均未反映出增殖的增加。本研究中的女性在服用DMPA后12周进行了活检，这是DMPA治疗的标准长度。我们发现上皮厚度和细胞层数量无统计学差异，Ki-67标记物显著增加，这也可能表明在12周时阴道组织可能处于恢复正常周期状态的初始过程，从而增加增殖、厚度、，和细胞连接完整性。在DMPA给药后或长期使用DMPA后，以较短的时间间隔检查上皮完整性将是理想的。此前有一组研究人员报道，长期使用DMPA后阴道上皮细胞增生。⁸¹总的来说，我们的数据并不表明DMPA在12周的采样间隔中导致显著的上皮变薄或破坏上皮完整性。尚不清楚上皮屏障厚度的相对较小的减少是否有助于病毒离子进入粘膜活化的HIV-1靶细胞

本报告中的数据代表了对存档组织进行的初步研究。由于HIV-1感染不是终点，我们的数据无法对DMPA的使用如何增加女性对HIV-1获得的易感性提供决定性的解释。然而，这些数据确实证明了外源性MPA对阴道内免疫细胞数量的显著影响。重要的是，他们显示了在单次注射DMPA后，已知参与HIV-1感染早期阶段的免疫细胞群发生了变化。由于缺乏功能终点和双标记物标记，我们无法确定这些变化是否与粘膜促炎或免疫抑制状态有关。然而，无论是通过增加激活的靶细胞数量还是减少抗病毒反应，DMPA可能与增加宫颈阴道粘膜对HIV-1感染的敏感性有关。

在最近的HIV-1预防试验中，这些发现更为关键。大多数这些试验要求登记的参与者进行有效避孕；例如，在CAPRISA 004试验中，80%的参与者使用注射用孕激素避孕，主要是DMPA。⁸²值得注意的是，目前尚不清楚我们的研究结果是否适用于其他广泛用作避孕药具的外源性孕激素。由于数以百万计的妇女需要双重保护，以防意外怀孕和HIV-1感染，因此有必要确定外源激素对粘膜对HIV-1敏感性的影响以及外源激素对杀微生物剂效果的影响。计划对大约70名选择联合口服避孕药或DMPA的女性进行前瞻性研究，以进一步阐明外源性激素对HIV-1粘膜易感性的影响。

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