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《公共科学图书馆·病理学》。2016年9月；12（9）：e1005885。
2016年9月22日在线发布。 数字对象标识：10.1371/日志.ppat.1005885
预防性维修识别码：项目编号：5033389
PMID：27658293

内源性或外源性孕激素增加促进非人类灵长类雌性生殖道内的病毒靶细胞相互作用

安·卡里亚斯，1 香农·A·艾伦，1 安吉拉·福特，2 卡塔琳娜·科特尼克·哈拉瓦蒂，1 米根·R·安德森，1 玛丽亚·希梅内兹，1 迈克尔·麦克拉文，1 凯西·乔亚，1 塔拉·R·海宁，三 埃伦·科尔什，三 詹姆斯·史密斯，三 劳拉·佩雷拉，三 凯瑟琳·巴特勒，三 S.珍妮特·麦克尼科尔，三 R.迈克尔·亨德利，三 帕特里克·F·基瑟，1 罗纳德·S·韦泽，4和托马斯·J·霍普1，*
吉多·西尔维斯特里，编辑器
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数据可用性声明

摘要

目前，有越来越多的数据表明，使用某些激素类避孕药可能会影响女性感染HIV-1。然而，在非人类灵长类动物模型中，内源性或外源性孕激素主导状态会增加获得。为了从机理上了解这种增加的获取，我们研究了在天然孕激素存在或注射大剂量DMPA后，粘膜屏障功能以及CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞密度和定位的变化。天然或注射的孕激素增加了病毒对柱状上皮的渗透，并使易感细胞渗入阴道穹窿变薄的鳞状上皮，增加了病毒与靶细胞相互作用的可能性。这些数据表明，增加内源性或外源性孕激素均可改变女性生殖道屏障特性，并为孕激素水平增加时增加HIV-1感染风险提供了可能的机制。

作者摘要

性传播占所有HIV-1感染的80%以上，其中一半的新感染发生在女性身上。流行病学研究表明，某些激素避孕药可能与HIV-1感染增加有关。利用各种非人类灵长类动物模型进行的研究支持了阴道HIV感染的激素影响，研究表明，阴道传播的敏感性受月经周期或外源性激素治疗的影响。然而，敏感性增加的机制尚不清楚。在这里，利用各种技术和非人类灵长类动物，我们说明了基于孕激素的避孕药，如Depo Provera和自然月经黄体期在这些模型系统中具有非常相似的影响。两者都会增加病毒流入子宫内膜并刺激鳞状上皮的靶细胞浸润。黄体酮显性状态下鳞状上皮表层死亡层的脱落使组织驻留细胞与腔中的病毒紧密接触，增加了相互作用和感染的可能性。在这些广泛使用的模型中，更好地了解阴道SIV/SHIV的获得对于解释激素避孕药使用期间HIV-1获得的临床试验结果至关重要。对艾滋病毒感染机制的进一步了解应有助于疫苗的开发。

介绍

全球范围内，男性对女性的粘膜传播占最近HIV-1感染的大多数（60%）[1]. 许多因素可能会增加女性感染HIV-1的风险，包括HIV-1感染的阶段和伴侣的病毒载量、性传播感染的合并感染、子宫颈异位症和年龄[2，三]. 目前，人们的共识是，激素波动和女性生殖道粘膜屏障（FRT）的变化是感染HIV-1的重要风险因素。[4–11]. 增加收购背后的潜在机制仍有待阐明。

在女性和猕猴的月经周期中，粘液和上皮的粘膜屏障都会因激素波动而改变。粘液是HIV-1在FRT中遇到的第一道屏障，众所周知，在月经周期和激素避孕药的存在下，粘液的水平和浓度都会发生变化[12]. 在猕猴模型中，阴道穹隆鳞状上皮屏障的厚度随着激素的变化而大幅波动[13，14]. 例如，在月经周期黄体期和大剂量注射避孕药库醋酸甲羟孕酮（DMPA）后，孕激素水平增加，导致鳞状上皮屏障变薄[15，16]. 女性是否也发生了类似的变化尚不清楚，目前仍有争议[17–21].

在猕猴模型中，DMPA治疗可诱导孕激素显性状态，已知这种状态可提高阴道暴露后SIV获取的效率[16，22]. 最近对猪尾猕猴的研究也表明，在月经周期的晚期黄体黄体酮占主导地位和月经期，病毒获得风险增加[23，24]. 直到最近，对女性的研究还不太确定，关于这个问题还有很多争论[5，7，8，25–27]. 然而，目前有两项独立研究的最新且令人信服的荟萃分析证据表明，DMPA增加了HIV-1的获得[28，29]. 重要的是，该领域要获得关于为什么孕激素显性状态下病毒获取增加的机制性见解。

在这里，我们利用两种猕猴阴道挑战模型来描述FRT粘膜屏障在月经周期和DMPA治疗后发生的变化。我们的第一个模型利用了在恒河猴无排卵季节，经DMPA治疗或未经治疗的恒河猴晚期尸检的生殖组织。我们的第二个模型通过在月经周期的不同阶段对感染SHIV（SF162p3）的动物进行尸检，或在服用DMPA后对猕猴进行SHIV感染和未感染阴道活组织检查，来评估尾猴的生殖组织。此外，使用9只SHIV阴性的尾尾猕猴动物进行粘液转运分析。我们认为，这两个广泛使用的模型的比较是本研究的一个优势，因为它确定了激素影响方面的相似性，并使此处获得的结果有助于解释绝大多数猕猴研究，以了解SIV/HIV-1的阴道获得。

我们研究的核心是利用检测组织中荧光HIV-1颗粒的能力，跟踪病毒颗粒与粘膜屏障的相互作用，从而直接观察粘膜屏障的变化如何影响病毒进入途径。[30]. 通过比较FRT的屏障功能和常驻靶细胞群，我们可以检测到孕激素显性状态下的情况，这可能会增加病毒到达管腔内靶细胞的可能性。此外，通过获取猪尾猕猴颈部粘液并进行粘液转运分析，我们能够评估DMPA治疗如何影响HIV-1流动性的粘液容许性。这些来自两种猕猴模型的机械性见解可以增加我们对激素变化如何增加女性感染HIV-1风险的理解。

结果

猕猴角质层厚度

众所周知，猕猴模型阴道穹隆鳞状上皮屏障的厚度会因激素信号而发生很大变化[13，31]. 初步研究表明，上皮厚度的变化主要是非角化鳞状上皮角质层（SC）厚度变化的结果。因此，我们在用E-cadherin抗粘附抗体进行免疫荧光染色后，通过确定棘突颗粒的边界来确定这一层的厚度。通过这些细胞连接的分布，我们可以区分非活性SC和有核地层，并使用先前报告的算法测量SC到管腔的厚度[21，32].

当比较高剂量DMPA治疗（30 mg）和未治疗的恒河猴时，大多数接受治疗的动物表现出缺乏外宫颈SC层，阴道SC厚度大幅下降(图1A和1B). 例外情况是两种DMPA处理的恒河猴HG60和N195。两种猕猴都保留了较厚的外颈SC，而N195也具有较厚的阴道SC(图1A和1B).

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恒河猴和猪尾猕猴子宫颈和阴道的平均角质层（SC）厚度。

月经周期阶段被指定为卵泡期（月经第1天到第14天）、中期（第14-16天）或黄体期（月经前17-天）。DMPA是指那些在献祭前4-5周（28-33天）预先肌肉注射30 mg Depo-provera的动物。误差条代表SEM（a）。黄体酮治疗和未治疗恒河猴外宫颈SC厚度。箭头代表SC不存在的动物。（b） ●●●●。黄体酮治疗和未治疗恒河猴阴道SC厚度。箭头代表SC不存在的动物。（c） 。通过月经周期阶段和DMPA治疗后，感染的尾尾猕猴外宫颈SC厚度。（d） ●●●●。通过月经周期阶段和DMPA治疗后（30mg）对感染的尾尾猕猴阴道SC厚度进行测量。（e） ●●●●。一只感染猪尾猕猴月经中期SC厚度的荧光反褶积图像（40x）。粘附接合处（红色）、DAPI（蓝色）、组织背景（绿色）。尺寸棒为40μm。（f） ●●●●。黄体月经周期阶段一只感染猪尾猕猴SC厚度的荧光反褶积图像（40x）。粘附接合处（红色）、DAPI（蓝色）、组织背景（绿色）。尺寸条为40μm。（g） ●●●●。DMPA治疗后一只感染猪尾猴SC厚度的荧光反褶积图像（40x）。粘附接合处（红色）、DAPI（蓝色）、组织背景（绿色）。尺寸条为40μm。组织层如图右侧所示。

同样，在孕激素显性黄体期或DMPA治疗后的尾尾猕猴中，观察到外宫颈和阴道SC厚度明显减少(图1C-1G在尾尾猕猴的黄体期，可以看到没有任何明显SC的区域，并且在DMPA处理后，棘粒细胞层可以薄到2-3个细胞层(图1F).

猕猴靶细胞分布

在初步分析期间，我们注意到DMPA治疗的恒河猴鳞状上皮内CD4+T细胞密度增加，这是意料之外的结果。接下来，我们量化了位于子宫颈外和阴道鳞状上皮的malpichii层内的CD68+和CD4+靶细胞的密度(图2，S1图，S2图). 在高剂量DMPA治疗的恒河猴中，在外宫颈表皮内发现CD4+和CD68+靶细胞密度较高（两者均为P≤0.001）和阴道(P（P）=0.034和P≤分别为0.001），与未经处理的猕猴相比(图2A和2B). 在阴道活检样本中，CD4+和CD68+靶细胞浸润的差异也很明显，这表明上皮内细胞迁移不是PA-GFP HIV-1给药的产物（两者都是P≤0.001). 在高剂量DMPA处理的猪尾中，无论SHIV感染状态如何，外宫颈和阴道样本中包含的上皮内CD4+和CD68+靶细胞数量均多于卵泡期和中期阶段的靶细胞数量（均为P（P）<0.001). 同样，与卵泡期和中期相比，在晚黄体期处死的猕猴含有更多的外宫颈和阴道上皮内CD4+和CD68+靶细胞（两者均为P≤0.001）(图2C，S1图，S2图). 该分析表明，所有处于孕激素显性状态的猕猴在外宫颈鳞状上皮中的CD4+和CD68+靶细胞密度都有统计学意义的升高。在SHIV和非感染动物中，在黄体晚期和高剂量DMPA治疗后，也观察到尾尾猕猴阴道组织中CD4+和CD68+靶细胞密度显著增加(图2C，S1图，S2图). 相反，在这些动物的月经周期中，对子宫内膜表面的CD4+和CD68+靶细胞密度的检测显示没有统计学上的显著差异(S3图).

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不同组织类型恒河猴和猪尾猕猴靶细胞密度的比较。

月经周期阶段被指定为卵泡期（月经第1天到第14天）、中期（第14-16天）或黄体期（月经前17-天）。DMPA是指那些在献祭前4-5周（28-33天）预先肌肉注射30 mg Depo-provera的动物。TCNumber/EpiArea是指靶细胞数量除以所分析上皮的面积。每个数据点表示来自40x面板图像的平均细胞密度。每只动物有10个面板图像，每个随机截面有一个面板，在可用时从多个块中按组织类型采集。误差条代表SEM（a）。分析未经治疗（n=4）和DMPA治疗的恒河猴（n=6）的CD4+T细胞密度，比较阴道组织活检和末端组织采集（子宫颈和阴道）。（b） ●●●●。分析未经治疗（n=4）和DMPA治疗的恒河猴（n=6）的CD68+巨噬细胞密度，比较阴道组织活检和末端组织采集（子宫颈和阴道）。（c） ●●●●。按月经周期阶段分析受感染的尾猕猴鳞状上皮中CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞密度，与DMPA治疗后28–33天SHIV感染和未感染动物阴道活检的比较：（左上）外宫颈CD4+T细胞密度，（右上）阴道内CD4+T细胞密度，（左下）宫颈外CD68+巨噬细胞密度，（右下）阴道内CD68+吞噬细胞密度。

DMPA处理猕猴FRT黏液中的颗粒扩散

接下来，我们测定了注射DMPA之前、期间和之后从猪尾猕猴收集的FRT粘液中病毒颗粒和纳米珠扩散的差异(图3). 追踪单个粒子的时间依赖性轨迹可以确定HIV和聚乙二醇纳米珠的均方位移（MSD）。MSD提供了不同条件下粒子扩散常数的相关信息。对于珠子，DMPA处理后的估计MSD最大（7.30μm2)与之前相比（5.24μm2，P（P）=0.030）和治疗期间（5.32μm2，P（P）=0.033) (图3A). 此外，在DMPA治疗期间，HIV-1的MSD估计值明显较高（4.20μm2，P（P）=0.04），与治疗前的艾滋病毒（2.31μm）相比2). 这些结果表明，在高剂量DMPA诱导的孕激素显性状态下，病毒更容易通过FRT黏液。

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给药前、中、后，HIV-1和200nm珠在尾猴粘液中扩散。

计算（a）的估计平均值和标准误差。服用DMPA之前（n=29）、期间（n=16）和之后（n=34）收集的每个粘液样品中所有颗粒类型的均方位移（MSD）值。（b） ●●●●。服用DMPA之前（n=29）、期间（n=16）和之后（n=34）收集的每个粘液样品中所有颗粒类型的α值。对于每个处理条件，运行广义线性混合模型来比较颗粒MSD和α的估计平均值。

为了更好地描述粒子迁移率的性质，我们将MSD作为滞后时间（Δt）的函数拟合为幂律，并获得α（α），即扩散指数。再次，计算DMPA处理之前、期间和之后收集的每个样品中两种颗粒类型的α值的估计平均值和标准误差。α值等于1表示自由扩散，而α值越低表示粒子运动受阻越大。珠粒流动性在所有条件下几乎不受阻碍，因此DMPA处理前、处理中和处理后的计算估计平均值分别为0.90、0.94和0.94。相比之下，与之前相比，DMPA治疗期间HIV-1的流动性显著提高（0.80）（0.59，P（P）=0.008）及之后（0.59，P（P）= 0.003) (图3B). 这些结果表明，DMPA治疗在1.5秒的时间尺度上增加了HIV-1的黏液容许流动性。

猕猴PA-GFP HIV-1组织相关性

为了评估体内病毒组织联合，除DMPA处理的尾尾猕猴外，所有猕猴均接种高滴度PA-GFP HIV-1，接种后4小时处死。在这些组织中，来自DMPA处理和未处理的恒河猴和循环尾猴的大多数样本都表现出与每种组织类型相关的PA-GFP病毒粒子，在上皮细胞之间，并穿透鳞状和柱状上皮屏障，深度可达50μm，可能在靶细胞群的范围内(表1，图4，S4图，S5图).

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在体内PA-HIV-1对恒河猴和猪尾猕猴生殖道的渗透。

显示的每个数据点代表一个穿透病毒的个体。对于每种组织类型的每个可用块，每只动物都有大约20张100倍的图像。误差条代表SEM（a）。（左）未经治疗的恒河猴雌性生殖道中的病毒渗透。（右）黄体酮治疗恒河猴雌性生殖道中的病毒渗透。（b） ●●●●。在月经周期的第二天，受感染的尾尾猕猴（n=8）的外宫颈被病毒渗透。（c） ●●●●。病毒在月经周期的第二天侵入受感染的尾尾猕猴的阴道。（d） ●●●●。在月经周期的第二天，感染猪尾猕猴的宫颈内病毒渗透。（e） ●●●●。病毒渗入宫颈外（b）和宫颈内（d）的结合。n=动物数量。

表1

不同月经周期阶段经DMPA治疗和未经DMPA处理的恒河猴和猪尾猴PA-GFP HIV-1的分析。
动物动物模型纸巾类型z扫描（z）病毒（v）伏/赫兹贯穿件（p）p/z（磅/平方英寸）平均深度（μm）最大深度（μm）
猕猴 PA-GFP HIV-1穿透：体内未经处理的恒河猴n=4 Ectocervix公司 5053560.701570.316.929.2
子宫内膜 54090.0250.0113.436.1
阴道 106711091.042940.2710.340.9
PA-GFP HIV-1穿透：体内DMPA治疗的恒河猴n=6 Ectocervix公司 10063430.341200.129.240.3
子宫内膜 759510.07310.049.931.3
阴道 10582940.281400.1310.547.1
猪尾巴猕猴 PA-GFP HIV-1穿透：体内辫子猕猴，毛囊n=2 Ectocervix公司 329940.29620.191329.2
子宫内膜 315150.050000
阴道 4461410.321010.2312.941.3
PA-GFP HIV-1穿透：体内猪尾猕猴，中期n=3 Ectocervix公司 522850.16640.1212.442.4
子宫内膜 517370.07200.041132.9
阴道 7051440.2860.1212.548.4
PA-GFP HIV-1穿透：体内黄体n=3的尾尾猕猴 Ectocervix公司 481170.0440.0112.125.5
子宫内膜 495620.13350.0712.845.2
阴道 610540.09260.048.418.4

在DMPA治疗和未治疗的恒河猴之间观察到病毒组织关联的差异(表1). 在未经治疗的恒河猴的子宫颈外，对505张z-stack图像的分析显示，356个PA-GFP HIV-1颗粒与该组织有关。在DMPA治疗的猕猴中，对1006个z堆栈图像的分析显示，只有343个PA-GFP HIV-1粒子与组织相互作用。尽管未经治疗的和经DMPA治疗的猕猴之间PA-GFP HIV-1的渗透性没有差异(P（P）=0.997），未经治疗的动物与外颈角质层表面相关的病毒数量略有增加(P（P）=0.296），尽管没有统计显著性。同样，在阴道中，病毒粒子与鳞状上皮的结合略有增加(P（P）= 0.127). 在分析1067个z堆栈后，发现未经处理的恒河猴中有1109个病毒粒子与鳞状上皮相互作用，而DMPA处理的恒河猴中1058个z堆栈中有294个病毒粒子相互作用。然而，与外宫颈不同的是，与接受DMPA治疗的动物相比，未经治疗的猕猴每次z扫描的穿透性病毒粒子数量显著增加(P（P）<0.001），结果表明外子宫颈和阴道的组织可能不像先前假设的那样相似。相反，与未经DMPA处理的猕猴相比，进入宫颈管并与简单柱状组织相互作用的病毒粒子数量显著增加(P（P）=0.003），尽管两组之间穿透病毒的数量没有差异(P（P）=0.212).

为了将这项工作扩展到解决月经周期中的自然激素变化，我们在体内辫子猕猴模型。然而，对这项特殊研究的一个警告是，我们只能接触到少量感染SHIV（SF162p3）的动物。因此，动物样本量较小，阻碍了统计分析，并在材料和方法中进行了更详细的描述。无论如何，与接受外源孕激素的恒河猴类似，处于高孕激素状态的辫尾猴在月经周期的晚黄体期表现出更多与宫颈管上皮相关的病毒(图4B-4E，表1). 在495张图像中，62个病毒粒子与单柱状病毒相关，其中57%(n个=35）具有穿透性(图4D). 然而，在315张图像中，没有发现病毒粒子穿透黄体酮低卵泡期的简单柱状体。有趣的是，在孕激素开始升高的中期，517张图像中的37个病毒粒子位于导管内。其中54%(n个=20） 穿透了简单的圆柱(图4D). 大多数穿透性病毒都是在一只动物身上发现的。此外，与DMPA治疗的恒河猴很相似，在黄体晚期，与外宫颈和阴道鳞状上皮相关的病毒也较少。相反，在孕激素水平较低的卵泡期和中期阶段，更多的病毒与这些猕猴的外宫颈和阴道鳞状上皮相互作用。在卵泡期，66%(n个=62）种已鉴定的病毒渗入外宫颈上皮(图4B)和72%(n个=101）穿透阴道上皮(图4C). 中期循环期间，75%(n个=64）种已鉴定的病毒渗入外宫颈上皮(图4B)和60%(n个=86）穿透阴道上皮(图4C).

讨论

本文提出的研究旨在获得猕猴模型中与阴道挑战相关的HIV-1获得增加的机制见解。FRT是一种对激素敏感的粘膜环境，粘膜屏障功能发生动态变化。猕猴模型表明，内源性和外源性孕激素主导的激素状态可以提高阴道激发后SIV/SHIV获得的效率[16]. HIV-1传播需要接种物中的病毒到达粘膜组织中的易感目标细胞。与低孕激素状态相比，我们观察到猕猴粘膜屏障中的两种孕激素显性状态变化，这将增加HIV-1与组织驻留靶细胞相互作用的可能性：增加病毒进入宫颈管的次数，增加病毒与浸润鳞状细胞的靶细胞的距离上皮细胞。

利用活尾猕猴挑战模型，我们发现在月经周期的卵泡期与柱状上皮相关的病毒缺乏。这同样适用于非季节性和非周期性的恒河猴，这种状态也由最低孕激素水平定义。相反，在孕激素显性状态下阴道激发后，我们观察到能够到达宫颈柱状上皮屏障的病毒粒子增加。在高剂量DMPA治疗后，恒河猴和猪尾猕猴进入月经周期黄体期时都注意到了这一点。

在孕激素显性状态下，病毒能够更好地到达宫颈柱状上皮，这可能是由于解剖结构的改变、粘液功能的改变或两者的结合所致[33，34]. 以孕激素为基础的避孕药，如DMPA，通过大幅减少分泌量和增加粘度来影响粘液，从而阻止精子进入宫颈管[35]. 对猪尾猕猴FRT黏液中HIV-1流动性的直接分析表明，在DMPA治疗期间，HIV-1通过FRT黏膜的扩散能力相对于聚乙二醇纳米珠的扩散能力增加(图3). 聚乙二醇化纳米珠被认为能够抵抗与粘液的基于电荷的相互作用（粘液粘附），而不是测量粘液的孔径[36]. 与影响病毒颗粒粘液粘附的激素变化一致，我们发现激素处理对珠子流动性的影响最小，珠子是非粘液粘附性的，大小与病毒颗粒相似。这些观察结果并不表明粘液通过简单的孔径变化来抑制HIV-1的流动性，但表明HIV-1的病毒特异性障碍在外源性孕激素的存在下显著消除。我们以前在人类颈阴道粘液中检测到这种活性[37]. 报道的pH值对病毒流动性的影响进一步支持了黏液粘附在该系统中的潜在作用[38–40].

结果显示于图3支持这种粘液粘附的激素调节。在激素治疗期间，在珠子流动性没有任何变化的情况下，HIV-1的MSD和α显著增加。在洗脱期，珠子的MSD显著增加，而HIV-1的MSD和α降低，这进一步支持了激素的影响。众所周知，粘液是高度糖基化的，这些糖基化变化受激素调节，这可能是将病原体锚定在粘液上的原因[41–43]. 例如，DMPA已被证明可以减少这些蛋白质上带负电荷唾液酸碳水化合物的表达；因此，HIV-1与粘液中这些碳水化合物之间可能存在天然排斥作用，为HIV-1的转运提供了有利条件。[43]. 重要的是，DMPA治疗后观察到的HIV-1通过粘液扩散的增加与孕激素显性状态下病毒进入宫颈管的增加有关。这种病毒进入宫颈管并到达柱状上皮屏障的能力增强可能是HIV-1在高致病环境中获得增加的机制的一部分(图5).

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HIV-1在月经周期不同阶段和/或与DMPA的使用如何与女性生殖道相互作用的机制模型。

（a） ●●●●。子宫内膜的简单柱状上皮：（左）随着中期进入黄体期，少量病毒粒子能够进入宫颈管，与子宫内膜的单一柱状上皮结合。（中）在黄体期和/或使用孕酮避孕药（如DMPA）时，病毒粒子更容易进入宫颈管，与子宫内膜的简单柱状上皮相互作用。（右）在滤泡期，病毒粒子很少进入宫颈管与宫颈单柱相互作用。组织层标记如下：C=简单柱状，LP=固有层。子宫颈和阴道的复层鳞状上皮：（左）在月经中期，鳞状上皮最厚，病毒可能穿透不存活的角质层。然而，靶细胞主要位于表皮以下，固有层；因此，病毒与目标细胞相互作用的可能性极小。（中）尽管由于黄体期缺乏角质层（或外源性孕酮治疗，如DMPA），几乎没有病毒粒子穿透分层鳞状上皮，但病毒更容易与腔表面附近浸润的上皮内靶细胞相互作用。（右）与中期周期一样，滤泡期鳞状上皮较厚，病毒粒子与不可存活的角质层相关。然而，靶细胞主要位于表皮以下，固有层；因此，病毒与靶细胞相互作用的可能性很小。组织层标记如下：SC=角质层，G=颗粒层，S=棘层，B=基底层，LP=固有层。

孕激素显性状态下阴道穹窿鳞状上皮的改变也增加了病毒可能遭遇并可能感染组织常驻靶细胞的可能性。鳞状上皮最明显的变化是自然或诱导孕激素显性状态下阴道穹隆上皮屏障厚度的减少(图1) [13–15，44]. HIV-1穿透鳞状上皮的能力似乎与上皮厚度的减少无关，但在较厚的SC中更容易观察到[30]. 这种现象在HG60的外宫颈和N195的外宫颈及阴道中尤其明显；两只经DMPA处理的恒河猴保留了厚厚的SC，并表现出大量穿透HIV-1病毒(图1，S5图). 然而，如果病毒能够进入未经治疗的动物体内发现的非活性假角化层，那么在该非活性层中没有靶细胞。因此，当孕激素影响最小时，厚厚的SC通过增加病毒粒子到达活目标细胞所需的距离，为HIV-1传播提供了部分屏障。

在孕激素占主导地位的状态下，鳞状上皮屏障厚度的减少与鳞状上皮内CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞数量的增加有关。先前的研究表明，在孕酮治疗的猕猴或在不同的月经周期阶段，靶细胞分布没有差异[45，46]. 然而，与这里的研究不同，他们没有严格关注表皮或只关注CD3+细胞[47]. 在这里，我们重点关注鳞状上皮内的靶细胞密度，并观察到在自然和DMPA诱导的孕激素显性状态下，上皮内CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞显著增加。此外，在DMPA处理的尾尾猕猴中，无论猕猴SHIV状态如何，上皮内靶细胞显著增加，结果表明靶细胞浸润是高黄体酮环境的产物，而非慢病毒感染(图2C). 有趣的是，我们观察到两种恒河猴（HG60和N195）表现出与未经治疗和DMPA治疗的恒河猴相似的特征。尽管这两种动物都用DMPA治疗，但宫颈外上皮（HG60和N195）和阴道鳞状上皮（仅N195）的SC仍然存在且较厚，类似于未治疗的猕猴。此外，在SC仍然较厚的组织中，两种恒河猴的鳞状上皮SC中都显示出大量病毒粒子“粘连”，上皮内靶细胞密度降低，这也反映了未治疗组的情况，并影响了DMPA联合治疗动物的总体统计数据(S1（第一阶段）和第5章图）。然而，这些猕猴也表明了病毒和宫颈内简单柱状上皮的联系，类似于在DMPA处理的猕猴中观察到的情况(S5图). 这些数据表明了两个结论：1）影响上皮内靶细胞浸润的是上皮生理学，它可以以多种方式表现（变薄、细胞连接改变等），而不是孕酮直接影响上皮内目标细胞浸润；2）孕酮仍然可以影响粘液渗透性。这表明FRT中的粘液功能变化与上皮生理学变化存在不同的孕激素影响途径。

值得注意的是，靶细胞渗入malpighii层会使其更接近管腔。在孕激素显性状态下，靠近管腔的靶细胞在鳞状上皮中突出。有趣的是，当比较经DMPA治疗的恒河猴和未经DMPA处理的恒河猕猴时，黄体酮显性状态下鳞状组织中的病毒渗透不太明显。这是由于可接触的靶细胞清除病毒还是被malpichii层的活角质形成细胞内吞所致尚不清楚。然而，这种潜在靶细胞到达病毒所在位置的情况，可能是孕激素显性状态下观察到的获取增加的机制。在猕猴模型中，CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞的分布以及病毒的渗透取决于上皮厚度，这表明HIV-1与FRT的相互作用可能在月经周期的黄体和卵泡期或仅使用孕酮避孕药物时有所不同(图5). 总的来说，本文的结果表明，高剂量DMPA模型和尾尾猕猴模型中的自然黄体期表现出普遍的相似性。

这两种猕猴模型的观察结果与女性获得性增加的潜在激素影响之间的关系尚待阐明。例如，很明显，这里使用的标准高剂量DMPA治疗远远高于女性使用的水平。最近有报道称，猪尾猕猴模型中的DMPA剂量与女性的剂量相似，对上皮厚度的影响要小得多[47]. 先前对鳞状上皮厚度的研究表明，外源性或内源性孕激素暴露妇女的FRT上皮厚度几乎没有变化[48，49]. 然而，其他研究表明可以检测到上皮厚度的差异[21]. 在鳞状上皮靶细胞密度方面也获得了类似的差异结果。一些女性临床研究表明靶细胞密度没有改变[18，49–51]而其他研究表明，接受DMPA注射的女性的阴道CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞数量显著增加[48，52]. 分析方法和取样时间的差异可能是造成这些差异的原因。

如果我们将猕猴研究推断为女性感染HIV-1，则表明HIV-1感染可能受月经周期和激素避孕药物的影响。为此，应该可以研究女性在月经周期和使用激素避孕药期间的上皮厚度、靶细胞定位和粘液屏障功能。考虑到DMPA可以增加女性HIV-1感染的共识，这里确定的一些机制似乎与较高的感染风险有关，包括在孕激素显性状态下，病毒与子宫内膜柱状屏障的结合增加，靶细胞浸润到鳞状上皮。这些研究提供了在与获得风险增加相关的各种激素条件下FRT生理参数变化的机制性见解，在开发新型HIV-1预防技术时应予以考虑。

材料和方法

研究设计

我们接触了8只感染非致病性SHIV株SF162p3的猪尾猕猴（疾病控制和预防中心），并在月经周期的三个不同阶段对动物进行了探索性研究。该研究是描述性的，因此没有动力。动物处理人员和进行化验的实验室工作人员都知道每只动物的月经周期，但样本被送往希望实验室进行盲法评估。对所有感染SHIV（SF162p3）的循环动物的组织进行上皮厚度、病毒渗透性和靶细胞密度检查。同样，在处死前4-5周（28-33天），对4只感染SHIV（SF162p3）的尾尾猕猴进行肌肉注射30 mg Depo-provera/DMPA的预处理。这些样本，以及来自2只DMPA治疗的未感染猪尾猕猴的阴道活检，也评估了上皮厚度和靶细胞密度。对10只恒河猴（杜兰国家灵长类研究中心）进行了补充研究，比较了DMPA治疗动物和对照动物。此外，还对9只SHIV阴性的猪尾猕猴进行了粘液研究；重点研究DMPA治疗和未治疗动物的病毒颗粒和纳米珠迁移率。所有动物实验均按照每个机构各自的动物护理与使用委员会（IACUC）指南进行。没有动物被排除在分析之外。

病毒的发展和特征

所有R5-HIV-1钡-LPA-GFP-Vpr病毒库的创建和特征如前所述[30].

道德声明

所有猕猴都被安置在杜兰国家灵长类动物研究中心（TNPRC）(猕猴)或疾病控制和预防中心（CDC）(长尾猴）均符合国际实验动物护理评估和认证协会标准。所有恒河猴研究均由杜兰大学动物护理和使用机构委员会审查并批准，研究方案编号为P0153。此外，疾病控制和预防中心机构动物护理和使用委员会根据2445、2009和2423号议定书审查并批准了所有尾尾猕猴研究。所有动物饲养和研究均严格按照美国国立卫生研究院（NIH，AAALAC#000594）或美国国家研究委员会（TNPRC）《实验动物护理和使用指南》中的建议进行《实验动物研究所（美国）实验动物护理和使用指南更新委员会》，美国国家科学院出版社（美国），《实验动物护理与使用指南》。第8版，华盛顿特区：国家学院出版社，2011年（CDC），均附有威瑟尔报告的建议；“在研究中使用非人类灵长类动物”。恒河猴可随意食用猴食（密苏里州圣路易斯市PMI营养国际实验室纤维+灵长类膳食-DT），并补充水果、维生素和诺伊斯的食物（新泽西州新不伦瑞克研究膳食）。猪尾猕猴被提供了各种食物选择，如水果、蔬菜或种子。所有临床程序均在实验动物兽医的指导下进行。所有手术均在氯胺酮麻醉下进行，通常与特拉唑联合使用，并尽一切努力减少压力，改善住房条件，并提供丰富的机会（例如，在笼子里操作物体、各种食物补充剂、觅食和任务导向的喂养方法、与护理人员和研究人员的互动）。按照美国兽医协会2013年《安乐死指南》的建议以及各机构的安乐死政策，以人道方式（静脉注射戊巴比妥）对所有猕猴实施安乐死。

猕猴

在病毒暴露前28–33天，对6只恒河猴进行肌肉注射30 mg去甲氧基孕酮醋酸盐（depo-provera/DMPA）的预处理，剩下4只恒河猕猴未经治疗。将约4mL高滴度PA-GFP HIV-1阴道内注射至所有麻醉动物，随后将其放回笼子中4小时。同样，在处死前4-5周（28-33天）或阴道活检前，分别对4只感染SHIV（SF162p3）和2只未感染猪尾猕猴进行肌肉注射30 mg Depo-provera/DMPA的预处理。SHIV（SF162p3）是一种非致病性病毒，其病毒载量非常低，并且不会导致CD4+T细胞群的永久性减少。在与月经周期相关的研究中，对8只感染SHIV（SF162p3）的尾尾猕猴进行了目测检查，以确定其会阴肿胀和月经开始，并进行了孕酮测量，如前所述，以确定接触HIV-1前的大致月经周期日数[24，53]. 在预定的月经周期天数/阶段，阴道内注射1mL PA-GFP HIV-1。阶段被指定为卵泡期（月经第1天到第14天）、周期中期（第14-16天）或黄体期（月经前17-天）。对所有猕猴实施安乐死，并切除接种了PA-GFP HIV-1的生殖道进行分析。倍数1cm三样本取自外宫颈、子宫内膜和阴道。组织样品保存在最佳切割温度（OCT）下，并保存在-80°C。

粘液采集

为了评估避孕药具对HIV-1在粘液中转运的影响，使用了另外9只SHIV阴性的尾尾猕猴[54]. 在整个研究过程中，每周收集一次所有动物的所有粘液样本。为了建立基线，在肌肉注射DMPA之前收集4-6周的粘液，从而构成“之前”状态。猕猴被分为3组，每组n=3，每4周接受一次0.5、1.5或2.5mg/kg剂量的DMPA，持续2个月。每周采集粘液，直到最后注射DMPA后4个月。从第一次注射到最后一次注射后一个月内收集的样品构成了“中间”状态。术后条件包括在最终注射DMPA后一个月至研究结束（约2个月）收集的所有样本。为了进行分析，将接受不同剂量DMPA的动物合并。

在采集过程中，使用阴道窥镜暴露宫颈，并使用无菌Aspirette（Cooper Surgical）将宫颈粘液插入宫颈口，大约1.5 cm或更小，施加负压。然后将宫颈分泌物放入一个无菌的1.5毫升Eppendorf O型环管（Fischer Scientific）中，放置在冰上，直到第二天运送到伊利诺伊州芝加哥进行成像。

HIV-1和纳米黏液转运分析

按照之前描述的既定方案进行颗粒扩散黏液转运分析[37]. 将浓缩R9 BaL Gag-cherry（HIV-1）和荧光聚苯乙烯200nm纳米珠以等浓度混合[37]. 用吸液管将吸入的猕猴阴道粘液（5μL）等份吸液到玻璃载玻片上，并粘贴双面胶单孔垫片。向粘液等分中心添加0.5μL HIV-1/微球混合物，并轻轻移液，直至达到均匀。盖玻片放在粘液上，并用指甲油固定。这两种粒子类型的电影都是在一个温度控制室中拍摄的，该室的温度保持在37°C，并配有一个EMCCD摄像机，该摄像机安装在反褶积显微镜上。成像发生在距离盖玻片30μm的地方，每150ms对每种类型的不少于100个颗粒进行成像，持续一分钟。使用基于二维自定义算法的粒子跟踪软件分析每种粒子类型的单个粒子位置。通过使用基于定制的粒子跟踪软件计算1.5秒（Δt为1.5s）时间尺度上的时间平均整体均方位移（MSD）来测量群体的流动性，以确定HIV和粘液惰性纳米颗粒的单个粒子位置[37，55].

免疫荧光

切片组织在PIPES缓冲液中用3.7%甲醛固定，染色前用正常驴血清封闭。利用HECD1（西北大学凯西·格林博士实验室的礼物）对猕猴组织中的粘附连接进行鉴定。为了确定靶细胞，用MCD1（Santa Cruz）CD4（Cell Marque）和CD68对恒河猴组织进行巨噬细胞（DakoCytomation）染色。其他抗体在简单柱状组织中显示细胞角蛋白-7（DakoCytomation）染色。为了确认所有PA-GFP荧光与病毒蛋白相关，使用p24（AG3.0美国国立卫生研究院艾滋病研究和参考试剂计划；Jonathon Allan）和p17（摩羯座）抗体[56]. 二级抗体罗丹明RedX（Jackson ImmunoResearch）和Cy5（JacksonImmunoresearch）也被使用。抗体特异性由相应同型对照抗体的阴性结果确定。采用Hoechst DAPI（Invitrogen）进行DNA染色，小麦胚芽凝集素（Invit罗gen）突出细胞糖蛋白。染色后，应用固定介质（DakoCytomation）和盖玻片，并用指甲油密封。

成像和图像分析

使用40倍或100倍油物镜，在数码相机（CoolSNAP HQ；Photometrics）上收集的DeltaVision RT系统上通过去卷积显微镜获得图像。为了评估恒河猴和猪尾猕猴的上皮厚度，我们对每只猕猴的每种组织类型进行了十次测量。通过使用抗粘附抗体，我们将每个样本的角质层与鳞状上皮的活性层区分开来。如前所述，我们使用IDL和专门创建的算法测量了角质层厚度[21].

对于病毒渗透分析，每个图像场在15μm以上收集100个Z扫描堆栈，并使用softWoRx软件（Applied Precision）进行图像分析。制定了几个标准来确保光激活病毒的可视化，包括光激活后强度至少增加2倍。使用softWoRx线谱软件测量光激活后GFP信号强度。穿透性病毒被定义为进入鳞状上皮或柱状上皮超过一微米的病毒，并使用softWoRx软件提供的测量工具进行测定。由于系统的分辨率，我们使用了1微米的截止值。对于小于1微米的测量，我们不能确定病毒粒子是在组织中还是在组织表面；因此，1微米及以上可以确保检测到的病毒粒子确实具有穿透性。对于每个组织块，从多个组织切片中随机选择位置获得20张图像。所有组合的组织块都覆盖了每只动物的整个子宫颈和阴道穹窿，确保安装过程中的任何变化都不会产生问题，并允许我们检测每种组织类型中的病毒颗粒。成像区域宽60μm，厚12μm。

为了确定猕猴的目标细胞密度，我们在多个组织块上对每只猕猴的每种组织类型进行了十次测量。采集的面板图像包括上皮和固有层。每张图像由缝合的面板组成，该面板由三张40倍的管腔图像和n个基底层40x图像，n个取决于每个样本的表皮厚度。使用SoftWorX软件，我们计算了牢固的上皮粘附连接的面积，并确定了每个样本的靶细胞密度。为了计算密度，每个样品中的靶细胞数除以HECD-1平均面积。使用softWoRx软件测量工具测量上皮内靶细胞到管腔的最短距离。

统计分析

所有病毒渗透数据均使用每张图像或每病毒粒子的数据进行分析，包括三个模型。这三种模型是：；负二项式广义估计方程（GEE）对组织中每幅图像上的病毒粒子数进行建模（每幅图像的所有观察结果），二项式GEE对每幅图像中穿透组织的病毒粒子比例进行logit链接建模（每张图像至少有一个病毒粒子的观察结果），以及每种病毒穿透深度的伽马GEE模型。该方法应用于两个数据集：1）猕猴体内检查DMPA治疗和组织类型的协变量(n个=84218张图片）和2）尾辫猕猴体内(n个=84420幅图像）检查月经期和组织类型的协变量。不幸的是，对于猪尾猕猴样本，数据太少，无法用组织类型（外宫颈、子宫内膜和阴道）、月经周期阶段（卵泡期、中期和黄体期）以及两个变量的相互作用来计算模型的主要影响。总的来说，GEE模型是过饱和的，广义Hessian矩阵不是正定的；因此，该模型将无法运行。

对多组间的靶细胞密度进行了所有比较。最初的数据集检测了DMPA和未经处理的恒河猴的上皮内细胞计数。随后的数据集包括尾尾猕猴数据，并根据激素环境详细检查了上皮内靶细胞密度：DMPA治疗和月经周期阶段。所有数据集均按组织类型分层。在适当的情况下，使用负二项或零膨胀负二项GEE在每个数据集中检查单位面积的目标细胞数。

采用伽玛GEE模型评估颗粒分散度（MSD）与时间之间的关系。时间包括治疗前、治疗中和治疗后，在每个时间段内几天内重复测量。“DMPA前”状态由初次注射DMPA前四至六周进行的样本采集表示。首次注射后一周和最终注射后一个月内，构成“DMPA期间”状态。最终条件“DMPA注射后”由最终DMPA注射一个月后发生的所有样品组成。分别为珠子和病毒颗粒建立模型。结果的潜在分布被假定为伽玛射线，说明猴子体内的重复测量。

所有分析均采用SAS 9.4进行，所有统计显著性限值均设置为p<0.05。

支持信息

S1图

猕猴个体不同组织类型靶细胞密度的比较。

DMPA指的是在处死前4-5周（28-33天）肌肉注射30 mg Depo证明剂进行预处理的动物。TCNumber/EpiArea是指靶细胞数量除以所分析上皮的面积。每个数据点代表40倍面板图像中的平均细胞密度。每只动物有10个面板图像，每个随机截面有一个面板，在可用时从多个块中按组织类型采集。误差条代表SEM（a）。分析未经治疗（n=4）和DMPA治疗的恒河猴（n=6）的CD4+T细胞密度，比较末端组织采集（子宫颈和阴道）和阴道组织活检。（b） ●●●●。未经治疗的恒河猴（n=4）和DMPA治疗的恒河猴（n=6）的CD68+T细胞密度分析，比较末端组织采集（Ectocervix和Vagina）和阴道组织活检。

（JPG）

S2图

猕猴靶细胞密度的定性分析。

各种猕猴样品的荧光反褶积图像（40x）。CD4+T细胞（红色）、DAPI（蓝色）、组织背景（绿色）。尺寸条为40μm.组织层标记如下：SC=角质层，G=颗粒层，S=棘层，B=基底层，LP=固有层。（a）。DMPA处理的恒河猴阴道上皮（30mg）。（b） ●●●●。DMPA处理的感染尾猴阴道上皮（30mg）。（c） ●●●●。未经处理的恒河猴阴道上皮。（d） ●●●●。感染猪尾猕猴月经中期的阴道上皮。（e） ●●●●。感染猪尾猕猴卵泡月经周期阶段的阴道上皮。（f） ●●●●。感染猪尾猕猴黄体月经周期阶段的阴道上皮。

（JPG）

S3图

周期性猪尾猕猴子宫颈组织靶细胞密度的比较。

月经周期阶段被指定为卵泡期（月经第1天到第14天）、中期（第14-16天）或黄体期（月经前17-天）。TCNumber/EpiArea是指靶细胞数量除以所分析上皮的面积。每个数据点代表40倍面板图像中的平均细胞密度。每只动物有10个面板图像，每个随机截面有一个面板，在可用时从多个块中按组织类型采集。误差条代表SEM。（a）。按月经周期分期分析感染的小尾猴单柱上皮CD4+T细胞密度。（b） ●●●●。按月经周期分期分析感染的尾尾猕猴单柱上皮CD68+巨噬细胞密度。

（JPG）

S4图

PA-GFP HIV-1进入猕猴阴道分层鳞状上皮。

猕猴阴道荧光反褶积图像（100x）。尺寸棒为20μm。（a） 光激活前的GFP信号，显示组织自体荧光（绿色）和DAPI（蓝色）。（b） 光活化后的GFP信号（伪彩色红色）和DAPI（蓝色）。（c） 光活化（B）前后GFP信号的叠加。显示已识别的病毒粒子（红色、白色箭头）、预光激活（绿色）和DAPI（蓝色）。（d） 识别的病毒粒子显示为（红色）、WGA（绿色）和DAPI（蓝色）。

（JPG）

S5图

病毒在恒河猴不同组织类型中渗透的比较。

DMPA是指那些在献祭前4-5周（28-33天）预先肌肉注射30 mg Depo-provera的动物。分析未经治疗（n=4）和DMPA治疗的恒河猴（n=6）中PA-GFP HIV-1病毒的渗透情况，比较末端组织采集（子宫颈外和阴道）和阴道组织活检。显示的每个数据点代表单个穿透病毒。对于每种组织类型的每个可用块，每只动物都有大约20张100倍的图像。误差条代表SEM。

（JPG）

致谢

作者感谢莫里斯·杜普兰蒂斯（Maurice Duplantis）对TNPRC的贡献，我们感谢疾病控制与预防中心（CDC）的詹姆斯·米切尔（James Mitchell）、利克雷西亚·詹金斯（Leecresia Jenkins）、沙农·埃利斯（Shanon Ellis）、弗兰克·德扬克斯（Frank Deyounks）和克里斯汀·凯利（Kristen Kelley）对动物技术援助的。我们还感谢James B.Pendleton慈善信托基金会对成像设备的支持。本报告中的发现和结论是作者的，并不一定代表疾病控制和预防中心的观点。

资金筹措表

这些研究部分得到了国家卫生研究所拨款U19AI03461（TJH）、R33 AI094584（TJH）和RO1 AI094595（TJ8）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

数据可用性

所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

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文章来自多囊卵巢综合征病原体由以下人员提供多环芳烃