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Dis模型机械。2019年10月1日；12（10）：dmm039669。
2019年10月23日在线发布。 数字对象标识：10.1242/dmm.039669
预防性维修识别码：PMC6826019型
PMID：31537512

醋酸甲羟孕酮改变女性阴道微生物群和微环境，并增加人源化小鼠对HIV-1的敏感性

Jocelyn M.Wessels公司，1,2 朱莉·拉朱伊，3中，4 梅夫·海·库珀，1,2 肯尼思·奥莫洛，4 艾利森·费尔克，1,2 丹妮尔·维塔利，1,2 黑莉·A·杜邦，1,2 菲利普·V·阮，1,2 克里斯汀·米勒，1,2 法特梅赫·瓦赫迪，1,2 约书亚·基马尼，3中，4,5 朱利叶斯·奥尤吉，4 朱莉安娜·切鲁约，5 约翰·蒙盖，5 亚历山大·德谢尔，6,7 米歇尔·特伦布雷，6,7 托尼·马祖利，8,9,10 詹妮弗·斯坦恩斯，11 阿里·阿什卡尔，1,2 基思·福克，3中，4 迈克尔·苏雷特，11,12,13和查鲁·考希奇1,2,13,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

激素避孕药醋酸甲羟孕酮（MPA）通过不完全了解的机制与人类免疫缺陷病毒（HIV）风险增加相关。阴道微生物群多样性增加调节生殖器炎症，并与HIV-1感染增加相关。然而，MPA对阴道菌群多样性的影响相对未知。在肯尼亚女性性工作者队列中，性传播感染（STI）阴性，Nugent得分<7(N个在筛选出的370个样本中，MPA与16S rRNA基因测序评估的阴道微生物群多样性显著增加相关。MPA还与血浆中雌激素水平降低、阴道糖原和α-淀粉酶水平降低显著相关，这些因素与乳酸杆菌在阴道定植有关，而乳酸杆菌被认为可以预防性传播感染。在人源化小鼠模型中，MPA治疗与低血清雌激素、低糖原和HIV-1敏感性增强有关。MPA介导的阴道微生物群变化可能导致人类对HIV-1的敏感性，其机制似乎独立于炎症细胞因子和/或活化的T细胞。总之，这些结果表明MPA诱导的低雌激素血症可能改变某些细菌（包括乳酸杆菌）在阴道定植所必需的关键代谢成分，并使阴道微生物群中的细菌多样性更大。

本文对论文第一作者进行了相关的第一人称访谈.

关键词：DMPA、糖原、淀粉酶、多微生物阴道微生物群、人源化小鼠

总结：MPA可能通过抑制内源性雌激素、降低阴道糖原和α-淀粉酶水平，增加性工作者对HIV-1的敏感性，从而增加细菌多样性，可能减少乳酸杆菌等保护性细菌种类。

简介

荟萃分析表明，以孕激素为基础的注射避孕药库醋酸甲羟孕酮（DMPA）可使异性获得人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的几率增加1.4倍(Polis等人，2016年)一项前瞻性研究报告称，与未使用长期激素避孕药的女性相比，使用注射孕激素的女性感染HIV的风险增加了3.5倍(Byrne等人，2016年). 这些数据尤其令人不安，因为DMPA是非洲流行的避孕药(罗斯和阿格旺达，2012年)，其中HIV-1流行率最高。研究表明，DMPA可能通过多种生物机制，包括低雌激素，提高对HIV-1和其他性传播感染（STI）的易感性(Hapgood等人，2018年). 然而，很少(Borgdorff等人，2015年；Brooks等人，2017年；Jespers等人，2017年；Kazi等人，2012年；Mitchell等人，2014年；Roxby等人，2016年)检查激素避孕药与阴道微生物群（VMB）之间的关系，尽管VMB多样，但在乳酸杆菌物种，感染HIV-1的风险增加4倍(Gosmann等人，2017年). 在此，我们确定了MPA（DMPA的活性成分）对肯尼亚性工作者阴道微环境中几个因素的影响，包括VMB的多样性。

VMB是阴道上皮细胞排列的细菌群落(Ravel等人，2011年). 与多样的肠道微生物群不同，VMB的多样性通常较低，有五种群落状态类型，包括四种主要由乳酸杆菌物种，已被描述(Ravel等人，2011年). 维持阴道乳酸杆菌生长的两个因素是糖原，糖原储存在上皮细胞中，并在阴道液中以游离糖原的形式存在(Gregoire等人，1971年；Mirmonsef等人，2014年；Nasioudis等人，2015年)α-淀粉酶，一种分解糖原供乳酸杆菌和其他细菌使用的酶(Macklaim等人，2013年)与肠道相似，VMB可以调节免疫力。VMB改变女性生殖道炎症(Anahtar等人，2015年)与生殖健康和疾病有关。包括种族在内的几个因素(Ravel等人，2011年)、性传播感染(Borgdorff等人，2014年)、细菌性阴道病（BV）(Gajer等人，2012年；Srinivasan等人，2012年)和性工作(Wessels等人，2017年)已报告影响VMB组成。本研究旨在检测激素避孕药对健康、无症状的肯尼亚性工作者VMB的影响，以确定DMPA是否与VMB和阴道微环境的变化有关，这些变化可能会影响他们对HIV-1的敏感性。重要的是，我们选择排除患有BV的女性，因为据报道，这是一种严重掩盖了激素对宫颈阴道灌洗（CVL）中微生物健康的阴道生物标记物（糖苷酶、凝集素）的影响的临床情况(Moncla等人，2016年，2015). 此外，我们(Wessels等人，2017年)和其他(Gajer等人，2012年；Srinivasan等人，2012年)已经通过16S核糖体RNA（rRNA）基因测序证明，通过Nugent评分诊断为BV的女性具有不同的VMB，但具有高多样性VMB的女性并不总是具有指示BV的Nugent评分(McKinnon等人，2019年；Wessels等人，2017年). 因此，由于症状性BV是一种可能混淆DMPA和VMB多样性之间关系的临床条件，并改变微生物健康的阴道生物标记物，因此本研究排除了Nugent评分为7-10的女性，Nugent得分用于诊断临床BV。

荟萃分析发现DMPA与女性HIV-1易感性增加相关(Polis等人，2016年)VMB多样的女性对HIV-1的易感性增加(Gosmann等人，2017年). 基于这些观察结果，我们假设MPA将增加VMB的多样性，进而通过影响炎症细胞因子和HIV-1靶细胞影响HIV-1风险。在这里，我们研究了MPA对健康、无症状的肯尼亚性工作者的VMB、阴道糖原和阴道α-淀粉酶的影响。我们还探讨了细菌多样性、阴道细胞因子和HIV-1靶细胞之间的关系。我们的总体目标是对使用DMPA、口服避孕药（OCP）或不使用激素避孕药（NH；月经周期增殖期）的性工作者的VMB进行细菌16S rRNA基因测序，并评估激素避孕药对阴道微环境和VMB多样性的影响，因为它们与HIV-1易感性有关。我们发现，使用DMPA与血浆雌激素水平降低、VMB多样性增加有关，并且使用DMPA的性工作者的阴道糖原和α-淀粉酶较低。我们通过实验总结了我们在人源化小鼠中的一些临床研究结果，并证明DMPA增强了HIV-1敏感性。结果表明，MPA诱导的低雌激素血症改变了关键的代谢产物（即糖原和α-淀粉酶），这些代谢产物对乳酸杆菌等保护性细菌在阴道定植很重要，底物的改变可能导致细菌多样性增加。然而，与我们的假设相反，DMPA介导的阴道微生物群变化可能影响Nugent评分<7的肯尼亚性工作者队列中HIV-1易感性的机制似乎与炎症细胞因子和/或活化T细胞无关，与BV女性患者的结果不同。

结果

DMPA与健康无症状肯尼亚性工作者阴道微生物多样性相关

我们的主要目标是研究DMPA对VMB多样性的影响。我们根据严格的入选/排除标准（见材料和方法）招募了一组肯尼亚性工作者。由于包括性传播感染和BV在内的多个因素影响了VMB的多样性，因此排除了患有性传播感染或BV的女性。五十八(N个=58）女性符合研究标准(图1).

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实验设计。流程图描述了为临床研究提供样本的肯尼亚性工作者的实验设计、筛选和登记过程。

我们试图确定激素避孕药对VMB多样性的影响。在OCP上评估性工作者的α-多样性(N个=14, 5-10 从开始新一包药片起的几天内），在DMPA上(N个=22, 3-4 最后一次注射后数周）和NH女性(N个=22）根据观察到的物种（丰富度）、Chao1（丰富性）和Shannon多样性指数（均匀度和丰度）。虽然观察到的物种存在显著差异(图2A） 最初在Kruskal–Wallis测试中观察到，但在事后测试中未发现显著差异。尽管Chao1丰富(图2B） 服用DMPA的性工作者的VMB显著高于服用OCP的性工作者，NH女性和服用DMPA的女性之间没有观察到显著差异。然而，DMPA上性工作者的VMB明显比NH更具多样性(图2C、 D）和OCP女性(图2C） 如香农多样性稀疏曲线所示。为了排除与DMPA相关的细菌多样性可能是由于Nugent评分中等（4-6）的女性人数不成比例，将这一组从分析中删除，并在Nugent评分0-3的女性中绘制Shannon多样性图(图S1; NH、，N个=18; OCP、，N个=13; DMPA、，N个=17). 即使在这个亚组中，DMPA上的性工作者的Shannon多样性指数也显著高于NH，这表明DMPA与健康无症状肯尼亚性工作者VMB中细菌多样性的增强有关。总之，我们的结果表明，DMPA与健康无症状肯尼亚性工作者的VMB多样性呈正相关。

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肯尼亚性工作者中DMPA与阴道细菌多样性相关。（A-D）使用三个α多样性指标来比较未使用激素避孕药的肯尼亚性工作者阴道微生物群中的细菌丰富度和均匀度（月经周期增殖期，N个=22），关于口服避孕药(N个=14）和DMPA(N个=22），来自同一地理区域。最初在Kruskal–Wallis试验中观察到观察到的物种存在显著差异，但随后在事后试验中没有发现显著差异（A）。DMPA上性工作者的VMB中Chao1丰富度显著高于OCP上的性工作者(P（P）≤0.05; Kruskal–Wallis测试），但NH性工作者和DMPA性工作者之间没有观察到显著差异（B）。DMPA上的性工作者在所有稀少程度上具有最大的细菌多样性(P（P）≤0.05; Kruskal–Wallis测试），其次是未服用激素避孕药的女性，以及服用口服避孕药的妇女（C）。服用DMPA的性工作者阴道微生物群中的细菌多样性明显高于未服用激素类避孕药的性工作者，且在所有程度上都很稀少(P（P）≤0.05; 曼·惠特尼U型-测试）（D）。ns，不显著*P（P）≤0.05, **P（P）≤0.01. 数据为平均值±标准误差。

健康无症状肯尼亚性工作者的细菌多样性与阴道炎性细胞因子或HIV-1靶细胞无关

在确定DMPA与阴道内细菌多样性增加相关后，我们试图确定VMB多样性与性工作者阴道细胞因子和/或HIV-1靶细胞之间是否存在关系。在CVL中定量细胞因子[IL-1α、IL-1RA（也称为IL1R1）、IL-1β、IL-8（CXCL8）、IL-10、IFN-γ、MIP-1α（CCL3）、MIP-β（CCL4）、MIG-3（CXCL9）、IP-10（CXCL10）和MCP-1（CCL2）](N个=58），并绘制线性回归图。VMB多样性（香农多样性指数12744读数）和上述任何细胞因子之间均未观察到显著相关性(图S2).

随后，我们试图评估VMB多样性与宫颈HIV-1靶细胞（CD4）之间的关系+CCR5号机组+T细胞）。百分比之间没有显著关系(图S3A；P（P）=0.496,R（右）2=0.009）或计数（N）(图S3B；P（P）=0.079,R（右）2=0.06）宫颈CD4+CCR5号机组+T细胞和VMB多样性（香农多样性指数为12744）。VMB多样性（12744读数的香农多样性指数）与CD4上CCR5表达的平均荧光强度（MFI）显著正相关+子宫颈的T细胞(图S3C；P（P）=0.009,R（右）2=0.12); 然而，如果没有任何其他支持相关性，0.12的相关性可能不支持这两个因素之间具有生物学意义的关系。因此，在Nugent评分<7的肯尼亚性工作者中，VMB的总体多样性似乎与宫颈细胞因子或HIV-1靶细胞无关。

DMPA降低了乳酸杆菌-健康、无症状的肯尼亚性工作者中占主导地位的VMB

通常，HIV-1感染风险的降低与低多样性有关，乳酸杆菌-主导VMB(Borgdorff等人，2014年；Gosmann等人，2017；Klatt等人，2017年). 因此，我们研究了激素避孕药是否影响性工作者中乳酸杆菌-占主导地位的VMB。通过避孕方法绘制了前20个细菌属的分类类群条形图(图3A） ●●●●。避孕药具的类型显示出一种趋势，但并没有显著改变性工作者中乳酸杆菌-当我们使用50-95%的相对丰度作为临界值时，占主导地位的VMB(表1). 然而，当我们为乳酸杆菌显性（≥98%相对丰度）避孕类型确实显著改变了性工作者中乳酸杆菌-占主导地位的VMB。有更多的女性乳酸杆菌-与服用DMPA的女性相比，NH（月经周期增殖期）和OCP组中占主导地位的VMB，这表明正常/高雌激素状态与乳酸杆菌更丰富相关，支持我们的结果，表明服用DMPA女性的香农多样性增强(图2C、 D）。

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避孕药和乳酸杆菌优势和集群。（A） 阴道微生物群中的前20个细菌属以相对丰度作为类群柱状图绘制，并在未服用激素避孕药的性工作者之间进行比较（月经周期的增殖期，N个=22），关于口服避孕药(N个=14）或DMPA(N个=22). 每个条形图代表一名女性的阴道微生物群。如图所示，每种颜色代表不同的细菌属。的种类乳酸杆菌以灰色/图案表示。阴道微生物群按相对丰度从左到右的降序排列乳酸杆菌.女性乳酸杆菌-利用相对丰度的几个不同切点评估各组间的优势VMB(表1). 在所选的最高截止时间（≥98%乳酸杆菌），有明显更多的女性患有乳酸杆菌-NH（增殖期）和OCP组中占优势的VMB多于DMPA组，这表明雌激素水平高与乳酸杆菌的大量存在相关，支持我们的结果，即DMPA组女性香农多样性增强(图1C、 D）。星号表示已解决到家庭级别。（B） PCoA根据Bray–Curtis差异矩阵证明了阴道微生物群在操作分类单元（OTU）水平上的β多样性。阴道微生物群不是通过避孕方法进行聚类，而是根据前面描述的CST进行聚类(Ravel等人，2011年)，由于乳酸杆菌阴道微生物群中。性工作者占主导地位克氏乳杆菌（CST I）用蓝色圈出，以内陆乳杆菌（CST II）为黄色，阴道菌群高度多样的女性（CST IV）为绿色圆圈。轴代表特征值，这是一个度量，其大小表示PCoA轴中捕获的变化量。（C） 根据Bray–Curtis差异计算聚类树状图，并用于可视化阴道微生物群的聚类。使用间隙统计观察到三个簇(图S5A)通常，前面描述的CST在树状图中聚集在一起。CST I（蓝色），克氏乳杆菌优势；CST II（黄色），内陆乳杆菌优势；CST IV（绿色），高度多样化。星号表示已分解为细菌属。

表1。

女性中乳酸杆菌-阴道优势菌群因避孕方法的不同而存在显著差异，以98%的相对丰度为界

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在我们的分析中乳酸杆菌各组之间没有差异(表2；P（P）=0.737;χ2)和按社区状态类型（CST）群集的VMB(Ravel等人，2011年)而不是避孕方法(图3B、 C）在主坐标分析（PCoA）和聚类树状图中。差距统计(图S4A)显示PCoA中的三个集群。PCoA排序和Bray–Curtis相异距离被用于构建热图，该热图还证明了基于CST而非激素避孕药类型的聚类(图S4B). 结果表明，在这组相对健康、没有BV的性工作者中，DMPA上的女性比例乳酸杆菌-显性VMB（≥98%）显著降低。换句话说，这些女性的VMB中细菌的多样性更大。

表2。

肯尼亚性工作者阴道微生物群中的细菌物种优势度与避孕方法无差异

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服用DMPA的健康无症状肯尼亚性工作者阴道糖原和α-淀粉酶较低

对研究参与者的循环MPA、雌二醇和孕酮进行量化(图4A-C）。如前所述，使用DMPA与低雌激素相关(Bahamondes等人，2014年；Hapgood等人，2018；Miller等人，2000年); 与NH女性相比，DMPA性工作者的循环雌二醇水平显著降低(图4B） ●●●●。我们还发现，与NH性工作者和OCP上的性工作者相比，DMPA与循环孕酮水平显著降低有关(图4C） ●●●●。

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服用DMPA的性工作者雌激素、阴道糖原和α-淀粉酶水平较低。（A） 为了确保服用DMPA的性工作者在循环中检测到MPA，使用ELISA对所有研究参与者的血浆MPA进行定量。DMPA组性工作者的MPA显著高于OCP组和无激素组（Kruskal–Wallis检验；P（P）≤0.0001). （B） 服用DMPA的性工作者的循环雌二醇显著低于未服用激素避孕药的性工作者（单因素方差分析；P（P）≤0.05). （C） 服用DMPA的性工作者的循环黄体酮水平也显著低于服用OCP的性工作者，而服用激素避孕药的性工作者则没有（Kruskal–Wallis试验；P（P）≤0.05). （D-G）由于不同的阴道菌群会强烈影响CVL中的阴道碳水化合物，并掩盖激素对这些参数的影响(Moncla等人，2016年，2015)，我们将阴道糖原和α-淀粉酶的分析仅限于Nugent评分≤3的性工作者。（D） 使用DMPA进行性工作者阴道灌洗时，阴道糖原显著降低(N个=16）与未服用激素避孕药（月经周期增殖期，N个=18; 未成对的t吨-测试；P（P）=0.043). （E） 类似地，α-淀粉酶的含量明显较少（Mann-Whitney；P（P）=0.0095）在使用DMPA的性工作者阴道灌洗中(N个=16）与未服用激素避孕药的性工作者（月经周期增殖期，N个=16). （F） OCP上的性工作者的游离阴道糖原水平最高，且游离阴道糖元显著高于DMPA上的性工作人员(N个分别=13、16；P（P）=0.008). （G） OCP和DMPA上性工作者CVL上清液中α-淀粉酶的数量接近显著水平(N个分别=13、16；P（P）=0.11). *P（P）≤0.05, **P（P）≤0.01, ****P（P）≤0.0001. 数据为平均值±标准误差。

据信，促进和维持阴道内乳酸杆菌生长的一个因素是糖原，糖原储存在阴道上皮细胞中，并以游离糖原形式存在于阴道液中(Gregoire等人，1971年；Mirmonsef等人，2014年；Nasioudis等人，2015年). 糖原是一种由α-淀粉酶转化为双糖的葡萄糖聚合物，可被乳酸杆菌和其他细菌利用(Macklaim等人，2013年)作为一种能源。雌激素被认为可以增强人类阴道上皮中的糖原(Cruickshank and Sharman，1934年；法拉奇和迈巴赫，2006年)经雌激素处理的仓鼠和非人类灵长类动物阴道组织中的糖原在实验中得到增强(Gregoire和Parakkal，1972年；Gregoire和Richardson，1970年). 因为DMPA具有强大的抗雌激素作用(Hapgood等人，2018年)，我们研究了与NH女性（使用内源性激素）或使用含雌激素的OCPs的女性相比，DMPA是否与阴道微环境中游离糖原和α-淀粉酶水平较低有关。正如其他人所证明的那样，不同的阴道菌群可以掩盖激素对阴道糖苷酶和凝集素的影响(Moncla等人，2016年，2015)，我们将此分析仅限于Nugent得分≤3的女性。阴道糖原[图4D类；N个=16（DMPA），18（NH）；P（P）=0.043]和α-淀粉酶[图4E；N个=16（DMPA），16（NH）；P（P）=0.0095]与NH女性相比，DMPA上性工作者的CVL上清液中的含量显著降低（2.04±0.42 vs.5.98±1.72 mg/ml；和3.91±1.32对16.90±3.78 分别为mU/ml）。此外，服用含雌激素OCP的性工作者的游离阴道糖原最高，并且阴道糖原显著高于服用DMPA的女性[图4F；N个=16（DMPA），13（OCP）；P（P）=0.008]，支持雌激素与阴道糖原增加有关的概念。DMPA和OCP上的女性α-淀粉酶无显著差异[图4G；N个=16（DMPA），13（OCP）；P（P）=0.1066].

由于糖原被认为可以维持阴道内的乳酸杆菌，我们评估了游离糖原与乳酸杆菌丰富多彩。CVL中的游离糖原与乳酸杆菌VMB中的物种(图S5A；N个=54; 线性回归；P（P）=0.046,R（右）2=0.07），而α-淀粉酶与乳酸杆菌接近重要性(图S5B；N个=48; 线性回归；P（P）=0.148,R（右）2=0.04). 此外，我们观察到细菌多样性与阴道糖原呈负相关(图S5C；N个=54；P（P）=0.0015,R（右）2=0.18），细菌多样性与α-淀粉酶呈负相关(图S5D；N个=55；P（P）=0.05,R（右）2=0.07). 总之，结果表明DMPA对性工作者的阴道糖原和α-淀粉酶有负面影响，这两个因素被认为是乳酸杆菌在阴道定植的重要因素(Gregoire等人，1971年；Mirmonsef等人，2014年，2015；Nasioudis等人，2015年).

DMPA与人源化小鼠阴道糖原低相关

鉴于很难从机械上评估DMPA对人类阴道微环境和HIV-1易感性的影响，我们试图确定在实验控制系统中是否观察到类似的影响。我们最近优化了一种用人类免疫细胞重建的人源化小鼠模型，该模型证明了阴道内攻击后的HIV-1感染（人源化NRG小鼠；Nguyen等人，2017年). 为了确保皮下注射DMPA可诱导循环浓度与女性相似，我们给药1或2 给NRG小鼠服用mg DMPA或生理盐水，并采集血液1或3 几周后。血清中MPA定量为两份(图5A） ●●●●。我们使用了2 后续实验中的mg剂量，因为循环MPA的变异性低于1 周与1相比 mg剂量，因为出现了与女性相似的峰值和平台期(Hapgood等人，2018年).

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DMPA与人源化小鼠阴道糖原降低和HIV-1敏感性增加有关。（A） 为了确定在小鼠颈部颈部皮下注射DMPA是否会导致循环浓度与在女性中观察到的浓度相似，我们给小鼠注射1(N个=7）或2 毫克(N个=8）的DMPA或生理盐水（对照，N个=5）至NRG小鼠（人源化小鼠的背景菌株），通过心脏穿刺1或3收集外周血 周后，用ELISA定量血清中的MPA。（B） 在人源化小鼠（对照组，无激素治疗，N个=10）和接受DMPA治疗的患者(N个=8). 在接受DMPA治疗的人源化小鼠中，阴道糖原显著降低（Mann–WhitneyU型-测试；P（P）=0.017). （C） 对照人源化小鼠（无激素治疗，N个=20）和给予2只人源化小鼠 毫克DMPA(N个=22）接受HIV-1阴道内激发。DMPA处理的人源化小鼠的感染率（77%）高于未处理的对照人源化小鼠的感染率（35%）(χ2；P（P）=0.014). （D） 经DMPA治疗的人源化小鼠感染HIV-1的比例明显更高(χ2；P（P）=0.014）比未经治疗的对照人源化小鼠在阴道内激发后感染的比例高。不适用*P（P）≤0.05, **P（P）≤0.01, ***P（P）≤0.001. 数据为平均值±标准误差。

由于雌二醇被认为可以增加阴道上皮中的糖原，而DMPA是低雌激素的，因此我们推测，我们会看到DMPA对人源化小鼠中糖原的类似影响，就像我们在肯尼亚性工作者队列中看到的那样。对接受或未接受DMPA（无激素治疗）的人源化小鼠阴道匀浆中的糖原进行定量。与未感染未经治疗的对照小鼠相比，未感染DMPA的人源化小鼠的阴道糖原显著降低[图5B类；1.5×10−3±9.0×10−4与1.1×10相比−2±3.0×10−3 mg/ml；N个=10（未处理），8（DMPA处理）；P（P）=0.017]. 因此，DMPA抑制人源化小鼠的阴道糖原，与我们在性工作者中观察到的相关性类似。

DMPA增强人源化小鼠对HIV-1的敏感性

DMPA与女性对HIV-1的易感性增加有关(Polis等人，2016年)VMB多样性高的女性更容易感染HIV-1(Gosmann等人，2017). 在这里，我们证明DMPA与肯尼亚性工作者队列中的VMB多样性相关，这可能会增加HIV-1风险。没有研究表明DMPA与人源化小鼠对HIV-1的敏感性增强之间存在直接联系。因此，我们通过实验评估了在病毒传播的异性恋模型中，DMPA处理的人源化小鼠是否更容易感染HIV-1(Nguyen等人，2017)与未经治疗、对照的人源化小鼠相比。人源化小鼠（对照组，无激素治疗，N个=20）和DMPA处理的人源化小鼠(N个=22）阴道内注射105TCID50/ml NL4.3-Bal-Env HIV-1(Nguyen等人，2017年；Platt等人，2009年). 通过临床RT-PCR 3-5定量外周血中的HIV-1病毒载量 挑战后数周(Nguyen等人，2017年). 感染DMPA治疗的人源化小鼠的比例明显较高（17/22，77%，P（P）=0.014）比未接受DMPA的患者（7/20，35%）(图5C、 D）。这些结果表明，在实验模型中，DMPA治疗显著增强了阴道内病毒暴露后的HIV-1感染。

讨论

这项研究提供了令人信服的临床证据，将阴道细菌多样性和健康无症状肯尼亚性工作者使用激素避孕药DMPA联系起来。我们还证明，服用DMPA的性工作者的血浆雌二醇、阴道糖原和α-淀粉酶水平较低。我们在一个实验模型中总结了其中的一些结果，在该模型中，DMPA处理的人源化小鼠阴道糖原较少，并且在阴道内激发后对HIV-1的敏感性增加。基于这些结果，我们提出了一个潜在的模型，将DMPA诱导的低雌激素与VMB和微环境中可能影响HIV-1易感性的变化联系起来(图6). 然而，这种机制似乎并不包括炎症细胞因子或活化T细胞的上调。这些结果表明，在了解无临床BV的性工作者中MPA、阴道微环境和HIV-1易感性之间的生物学联系方面取得了进展。

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肯尼亚性工作者阴道微环境变化和HIV-1易感性与DMPA相关的拟议机制。综上所述，我们的结果表明雌激素（内源性或口服避孕药）与阴道糖原和α-淀粉酶的大量增加以及性工作者阴道微生物群中细菌多样性的最小化有关。这种稳定、均匀的微生物群与HIV-1的易感性无关，尽管其机制尚不完全清楚。相反，使用MPA导致的低雌激素血症降低了某些保护性细菌物种可以使用的关键代谢产物（即糖原和α-淀粉酶），底物的变化允许其他细菌在阴道微生物群中定植，实际上增加了细菌的多样性。阴道微生物群的多样性可能通过一种不依赖炎症细胞因子和/或增强T细胞的未知机制，增加性工作者对HIV-1的敏感性。

低多样性乳酸杆菌-占主导地位的VMB被认为可以保护女性免受HIV-1感染(Gosmann等人，2017年；Nunn等人，2015年). 乳酸杆菌似乎通过产生乳酸、过氧化氢和抗菌细菌素，并通过提供物理/中和屏障来抑制其他细菌/病原体，从而对多种病原体提供非特异性防御(Hapgood等人，2018年). 目前对阴道细菌与HIV-1易感性之间关系的理解主要来源于BV文献。Nugent得分≥7的女性被诊断为临床BV。历史上，BV与HIV-1风险增加相关(Atashili等人，2008年；Cohen等人，2012年；Low等人，2011年). 在使用高分辨率测序的早期研究中，BV女性也被发现有多微生物群，这与炎症和HIV-1靶细胞增加有关(Masson等人，2015年；瑟曼等人，2015年). 因此，许多研究认为BV相当于高度的细菌多样性。然而，现在越来越清楚的是，这两者不一定重叠(麦金农等人，2019；Wessels等人，2017年)16S rRNA基因测序测定的VMB多样性高的女性子集没有临床BV（根据Nugent评分评估）。越来越清楚的是，即使没有临床BV，细菌多样性也可能导致对HIV-1的更高敏感性(Gosmann等人，2017年；Low等人，2011年)，因为在荟萃分析中，阴道菌群处于中间的女性感染HIV-1的风险仍增加1.5倍(Low等人，2011年). 在这里，我们表明，MPA与肯尼亚性工作者的VMB多样性相关，这些性工作者的Nugent分数较低，没有BV(Jespers等人，2017)在Nugent评分<7的女性中使用16S rRNA基因测序发现了这种关联，值得注意的是，激素避孕药（DMPA和OCP）通常与BV降低有关，正如Nugent得分评估的那样(van de Wijgert等人，2013年). 然而，Nugent评分基于三种细菌形态类型丰度的微观可视化，并不意味着与16S rRNA基因测序计算的α多样性指标相比评估细菌多样性。由于BV掩盖了激素对CVL中微生物健康的阴道生物标志物（糖苷酶、凝集素）的影响(Moncla等人，2016年，2015)，因为BV已经与HIV-1风险增加相关(Atashili等人，2008年)，我们选择排除Nugent得分为7-10的女性，并重点了解DMPA和VMB在没有BV的情况下的多样性如何影响肯尼亚性工作者对HIV-1的易感性。

我们还发现肯尼亚性工作者在DMPA上的阴道糖原和α-淀粉酶较低。糖原是一种葡萄糖聚合物，可以被α-淀粉酶转化为双糖，并被乳酸杆菌等细菌用作能源(Macklaim等人，2013年). 这两个因素被认为是乳酸杆菌-人体阴道中占主导地位的微生物群，对许多性传播感染具有保护作用(Gregoire等人，1971年；Mirmonsef等人，2014年，2015；Nasioudis等人，2015年). 雌激素被认为能增加阴道糖原(Cruickshank and Sharman，1934年；法拉奇和迈巴赫，2006年；Gregoire和Parakkal，1972年；Gregoire和Richardson，1970年)通过不完全理解的机制。因此，在NH和OCP女性中观察到的正常/高雌激素和糖原状态，预计会导致代谢糖原的乳酸杆菌数量增加。当我们使用乳酸杆菌相对丰度≥98%的截止值时，这种关联很明显(表1). 这表明与DMPA相关的低雌激素血症(图4B） 可能会改变阴道中的碳水化合物资源，并对保护性细菌产生负面影响，从而使其他不那么依赖糖原的物种定居，从而增强细菌的多样性。这在性工作者群体中尤其如此，因为与非性工作者的女性相比，女性可能有更多的性行为、多个伴侣和不同的性行为，因此她们更容易接触到各种细菌。重要的是，在人源化小鼠中，MPA也与低阴道糖原有关。这表明，无论宿主种类如何，MPA都会影响阴道微环境中的碳水化合物资源，能够进入阴道并在新条件下茁壮成长的细菌种类也会做出相应的反应。

尽管DMPA与肯尼亚性工作者阴道内细菌多样性增加、阴道糖原和α-淀粉酶降低有关，但我们想确定MPA是否会增加人源化小鼠对HIV-1的敏感性。我们用HIV-1对人源化小鼠进行阴道内注射，DMPA处理的小鼠比对照组更容易感染（77%对35%，P（P）=0.014). 这是DMPA增强人源化小鼠HIV-1感染的首次报道，该模型为发现、开发和测试干预措施提供了一个新平台，以减轻DMPA对HIV-1敏感性的影响，这将最终推动该领域的研究向前发展。我们假设VMB的多样性与增强的炎性细胞因子和/或T细胞相关，最终增强对HIV-1的敏感性，因为激活了宫颈HIV-1靶细胞（CD4）+CCR5号机组+CD25型+)长期服用孕激素类避孕药（DMPA，炔诺酮对映体）的女性增加(Byrne等人，2016年)活化的宫颈靶细胞（CD4）增加17倍+CCR5号机组+CD38型+人类白细胞抗原–博士+)据报道，在具有高度多样性的女性中(Gosmann等人，2017年). 此外，VMB多样性高的女性炎症细胞因子（IL-1β、IL-1α和IL-8）升高(Masson等人，2014年)阴道细菌影响女性生殖道的炎症反应和屏障功能(Anahtar等人，2015年；Birse等人，2017年；Doerflinger等人，2014年；Lennard等人，2017年). 也有证据表明，DMPA通过炎症途径增加了非人类灵长类动物对猴免疫缺陷病毒的敏感性(Li等人，2009年). 然而，在Nugent评分<7分的肯尼亚性工作者中，我们没有观察到炎症细胞因子（IL-1α、IL-1RA、IL-1β、IL-8、IL-10、IFN-γ、MIP-1α、MIP-2β、MIG-3、IP-10或MCP-1）或T细胞的改变，这表明阴道微生物群可能导致该队列中HIV-1易感性的机制与这些因素无关。值得注意的是，我们没有评估其他HIV-1靶细胞（树突状细胞、巨噬细胞），性工作者的宫颈炎症有所缓解(Lajoie等人，2014年；迈凯轮等，2010年). 我们也没有评估细菌多样性和阴道上皮完整性之间的关系，这也可能影响对HIV-1的敏感性。

我们并不是唯一一个研究DMPA对VMB多样性影响的小组。Birse等人（2017）在非性工作者中，发现DMPA和细菌多样性（香农多样性指数）之间没有显著关联，但未排除BV女性(Birse等人，2017年). 本研究的结果支持Jespers等人（2017），他们证明注射用孕激素（包括DMPA）与非洲女性VMB多样性和乳酸杆菌浓度降低相关(Jespers等人，2017年). 尽管另一项研究包括不同种族的非性工作者，并包括BV，但服用OCP或不服用激素避孕药的女性的细菌多样性（以Simpson指数的倒数表示）显著低于服用DMPA的女性，尽管没有统计学意义，服用DMPA的女性比未服用激素避孕药的女性具有更大的细菌多样性(Brooks等人，2017年). 这些研究支持在我们的研究中观察到的健康、无症状的肯尼亚性工作者中MPA和VMB多样性之间的关联。

我们的研究并非没有局限性。本研究中的CVL在收集后以低速短暂离心，以沉淀出细胞碎片，并在CVL上清液上进行VMB分析，而不是在细胞沉淀上。这是基于这样的假设，即从阴道腔获得的CVL中可检测到的细菌反映了VMB的总体组成，而细胞颗粒可能富含粘附细菌，比较了不同的采样方法（阴道拭子、CVL细胞颗粒和CVL上清液），发现所有三种方法都产生了可比较的VMB曲线(施密特等人，2019年). 然而，由于我们的分析是在CVL上清液而不是细胞相关颗粒上进行的，因此，由于这些技术限制，我们可能错过了VMB中存在的某些粘附细菌物种或群落。此外，种族、文化背景和阴道冲洗等因素也会影响VMB(Borgdorff等人，2014年；Chaban等人，2014年；Eschenbach等人，2000年；Gajer等人，2012年；Ravel等人，2011年；Schwebke等人，1999年；Srinivasan等人，2012年). 因此，我们招募了相同种族和地理区域的性工作者，以尽量减少混淆。虽然我们收集了阴道灌洗的信息，但我们没有与VMB多样性相关的阴道内干燥实践的信息(Birse等人，2017年). 然而，由于我们没有发现性工作者进行阴道冲洗的比例有显著差异，我们预计按避孕方法分类的女性进行阴道干燥的比例不会有差异。我们临床研究的一个局限性是，无法从力学上检测DMPA以及阴道微生物群和微环境中的相关变化如何影响对HIV-1的敏感性。为了弥补这一不足，我们以可控的方式对人源化小鼠的一些临床研究结果进行了实验总结，并且重要的是，与未经治疗的小鼠相比，经DMPA治疗的人源化鼠确实更容易感染HIV-1。在本研究中，我们在月经周期的第5-10天从NH女性采集样本，以最小化周期变异性并标准化周期阶段。然而，这一阶段是月经周期的雌激素高水平阶段，由于我们没有在孕酮高水平阶段招募性工作者，人们可能会怀疑差异是否是由于NH女性的样本采集时间所致。然而，两项独立的前瞻性研究表明，香农多样性指数在整个月经周期中保持稳定(Chaban等人，2014年；Gajer等人，2012年). 因此，我们认为结果准确地描述了MPA对性工作者VMB多样性和阴道微环境的影响，特别是考虑到最近的研究结果(Brooks等人，2017年；Jespers等人，2017年).

阴道是女性感染HIV-1的主要部位，DMPA的使用始终与HIV-1敏感性增强有关。有趣的是，最近的一项大型试验比较了三种不同的常用避孕药具，DMPA、宫内铜避孕器和左炔诺孕酮植入物，结果表明三种避孕药具使用者之间的艾滋病毒发病率没有显著差异，尽管它发现这三种人群的艾滋病毒感染率都很高(2019年避孕选择和HIV结局试验联合会的证据). 性工作者是优先人群之一，因为他们感染HIV-1的风险比不从事性工作的女性高50倍。因此，了解MPA对性工作者VMB的影响是一个重要的公共卫生问题。考虑到撒哈拉以南非洲有800万妇女使用DMPA，情况尤其如此(罗斯和阿格旺达，2012年)，其中HIV-1是地方病。在这里，我们证明了MPA与血浆中雌二醇水平下降、VMB多样性增加以及肯尼亚性工作者阴道糖原和α-淀粉酶的抑制有关，这些因素被认为可以促进保护性细菌的阴道定植。我们还表明，MPA对人源化小鼠的阴道糖原也有类似的影响，并在阴道内激发后增强对HIV-1的敏感性。因此，我们提出MPA增加性工作者对HIV-1敏感性的机制之一是通过抑制内源性雌激素，内源性雌激素可能负责维持糖原和α-淀粉酶。由于底物的变化，其他不那么依赖这些底物的物种进入并竞争空间并在阴道定居。随后细菌多样性的增加增加了这些性工作者对HIV-1的易感性，可能是通过非炎症机制，如阴道上皮屏障功能的破坏。未来的研究旨在探索MPA介导的女性HIV-1易感性机制，尤其是非性工作者和人源化小鼠的易感性，这是有必要的。

材料和方法

研究批准和实验设计

本研究由麦克马斯特大学（HiREB 0332-T）（AUP#14-09-40）、马尼托巴大学（B2015:033）和内罗毕/肯雅塔国家医院（KNH-ERC P132/03/2015）批准。我们的目标是确定DMPA是否影响VMB多样性乳酸杆菌-主要性工作者、VMB聚集、阴道糖原和α-淀粉酶。我们的一些结果在人源化小鼠中复制，目的是通过实验证实DMPA影响阴道糖原和对HIV-1的敏感性。

研究参与者通过肯尼亚内罗毕Pumwani性工作者队列的性工作者外联计划（SWOP）进行筛选/登记(Fowke等人，1996年). 根据研究大纲，2015年1月至2016年4月招募了女性(图1)以及以下严格的入选/排除标准。书面知情同意书和人口统计信息(表3)在纳入研究之前，根据对研究和潜在风险的解释，收到了所有参与者的反馈。

表3。

研究参与者的人口统计信息

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如果>18岁，则包括女性 岁，更年期前，愿意接受盆腔检查，子宫和宫颈完整，健康状况良好，性病（淋病、衣原体、，阴道毛滴虫、梅毒、HIV），酵母感染阴性，筛查时Nugent评分<7，24天内可不灌洗 h和性活动12 样本采集前h，使用安全套36次 节欲前h，未从事过>5岁的性工作 年。DMPA上的性工作者使用注射DMPA>6 筛查时间在3-4个月内 最近几周的注射。OCP上的性工作者正在服用含有雌激素和孕酮的OCP（由工作人员在筛查期间记录/确认）>6 筛查时间在5-10个月内 开始新包装的天数。未使用激素避孕药（NH）的性工作者在>6岁时未使用任何激素避孕药 筛查时间在5-10个月内 开始月经周期的天数（增殖期）。根据制造商的方案，在修改后，使用ELISA（EuroProxima）对所有女性血浆中的MPA进行两次定量(Smith等人，2014年) (图4A） ●●●●。使用MILLIPLEX MAP类固醇/甲状腺激素磁珠板（Millipore，Merck）并按照制造商的说明对所有女性的雌二醇和孕酮的血浆浓度进行定量(图4B、 C）。如果妇女在采集样本时出现出血或斑点、怀孕（或在1 年），母乳喂养，不愿意提供同意或遵循方案，仅使用孕酮OCP或不符合严格的纳入标准。

筛查时，收集尿液、血液和阴道拭子。尿液测试淋病奈瑟菌、和衣原体PCR检测物种（Xpert CT/NG试剂盒，Cepheid AB）。通过快速检测（检测，Inverness Medical）收集所有参与者的血液，以进行梅毒和HIV血清学检测，并使用ELISA（Vironostika，bioMérieux Clinical Diagnostics）确认HIV血清状态。每位女性都接受了妇科检查，以获取阴道标本进行显微镜检查（Nugent评分、酵母感染和阴道毛滴虫). STI阳性的女性被排除在外，并根据肯尼亚协议进行治疗。HIV+女性接受抗逆转录病毒治疗。

样本采集发生在1内 筛选后一周。进行前列腺特异性抗原（PSA）测试（Seratec PSA Semiquant）以确认12 h禁欲，因为最近的无保护性行为可能会改变VMB。进行妇科检查，并用2 从3 ml等分试样中取出1 ml无菌1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）。从阴道后穹窿收集CVL，置于冰上的无菌试管中，并送往实验室，在那里以低速离心（120克)清除细胞碎片。上清液和剩余的1 ml PBS（阴性对照）在生物安全柜中进行校准，冷冻并储存在−80°C下，直到用液氮运输至加拿大马尼托巴省温尼伯市。CVL和阴性对照品用干冰运至加拿大安大略省汉密尔顿市进行VMB分析以及α-淀粉酶和糖原定量。CVL后收集用于分离宫颈单核细胞（CMC）的宫颈细胞刷，并立即送往肯尼亚内罗毕大学进行流式细胞术。

细菌16S rRNA基因序列的V3区

使用改进的DNA分离方法从CVL上清液中提取基因组DNA，如Stearns等人（2015）.将CVL上清液倒置混合，并转移到含有2.8 mm陶瓷珠，0.1 mm玻璃珠、胍-EDTA肌氨酸和磷酸钠缓冲液。按照中所述对样品进行压片和离心Stearns等人（2015）使用机器人MagMAX Express 96深井磁粉处理器（Applied Biosystems）和多样本工具包（Life Technologies，4413022）进一步处理产生的上清液。

纯化的DNA用于PCR扩增16S rRNA基因的V3区。DNA（50-100 ng）用作模板1 Taq的U，1×PCR缓冲液（生命科技），1.5 mM氯化镁2, 0.4 mg/ml牛血清白蛋白，0.2 mM dNTP和5 pmols每个Illumina适配引物341F（CCTACGGAGGCAGCAG）和518R（ATTACCGCTGCTGG）（引物+Illuminia适配器/条形码/启动区域，如补充材料所述Bartram等人，2011年: ∼80 bp）(Bartram等人，2011年；Wessels等人，2017年；惠兰和苏雷特，2017年). PCR反应在94°C下进行5次 最小值，94°C 30次循环30次 s、 50°C，持续30 s和72°C，持续30 s、 最终延伸72°C 10 在1.5%琼脂糖凝胶上观察任何产生的PCR产物。使用SequalPrep标准化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，A1051001）对阳性扩增子（琼脂糖凝胶上16S带的可视化）进行标准化，并在McMaster Genomics Facility（加拿大麦克马斯特大学）的Illumina MiSeq平台上进行测序。如前所述，通过sl1p管道运行产生的序列(惠兰和苏雷特，2017年).

阴性对照为：（1）DNA提取对照（所有试剂，但没有CVL上清液）包括在机器人处理和随后的PCR中，以确保产生的细菌特征不是由于试剂盒污染物造成的。（2） 每次PCR运行均不含模板阴性对照，也不产生PCR产物（300号 琼脂糖凝胶上的bp带）。（3） 四个1 随机选取ml等分PBS（阴性对照），与CVL上清液一起进行上述处理，用于gDNA提取和16S rRNA基因的PCR扩增。这些阴性对照没有产生PCR产物（琼脂糖凝胶上没有显示16S条带）。根据McMaster Genomics Facility协议，未产生16S rRNA基因PCR产物的样本未被送去测序。这些样品被认为是阴性的。因此，我们认为CVL采集、处理、加工、提取和PCR过程中的细菌污染在我们的样品中是最小的/可以忽略不计的。

细胞因子定量

使用Milliplex MAP试剂盒（Millipore）量化CVL上清液细胞因子浓度，并使用BioPlex-200（Bio-Rad）进行分析。CVL上清液培养过夜，定量分析物包括IL-1α、IL-1RA、IL-1β、IL-8、IL-10、IFN-γ、MIP-1α、MIP-2β、MIG-3、IP-10和MCP-1。

糖原和α-淀粉酶定量

使用糖原检测试剂盒（BioVision）比色法定量CVL上清液中的游离糖原(Mirmonsef等人，2014年). CVL上清液在冰上解冻、旋涡和旋转。CVL上清液（5 μl一式四份）添加到96 well板上，并将体积调整为50 µl，带水解缓冲液。将水解酶添加到两个孔/样品中；那些没有酶的为阴性对照（CVL上清液中的背景葡萄糖）。从最终值中减去阴性对照，以确定CVL上清液中的总游离糖原。使用SpectraMax i3（分子器件）读取光密度。人胰淀粉酶ELISA（Abcam）(Spear等人，2014年)用于定量CVL上清液中的α-淀粉酶（1:1稀释，试剂盒稀释）。检测灵敏度为4.0×10−4mg/ml（生物视觉）。

流式细胞术

CMC颗粒在内罗毕大学进行免疫表型分析。细胞用FACS缓冲液洗涤并染色30 用ECD-Live-Dead（Invitrogen）在4°C下至少清洗一次，然后用FACS缓冲液清洗两次。将细胞悬浮在封闭溶液（小鼠IgG、FACS缓冲液、胎牛血清）中10 在4°C下至少清洗一次，并用FACS缓冲液清洗。使用抗体和Brilliant Violet Stain（均来自BD Biosciences）的混合物在4°C下对细胞染色30分钟。所使用的抗体为：CD3 PeCY5（克隆HIT3a，1/2）、CD4 Alexa 700（克隆RPA-T4，1/4）、CD8 APCH7（克隆SK1，night）、CCR6 BB515（克隆11A9，1/8）、HLA-DR BV510（克隆G46-6，nize）、CD69 PeCy7（克隆FN50，1/5）、BVV421（克隆2D7/CCR5，1/2），CD161 APC（克隆DC12，1/2）和CD38 PE（克隆HIT2，night。将细胞洗涤并在1%多聚甲醛中固定。使用LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）采集数据，并使用FlowJo v10.0.8r1（TreeStar）进行分析。

人性化小鼠

实验方案由HiREB和麦克马斯特大学动物研究伦理委员会（AREB）批准，AUP#14-09-40，符合加拿大动物护理委员会指南。如前所述制备人源化NRG小鼠(Nguyen等人，2017年). 简单地说，对4日龄小鼠进行辐照，并注射富含CD34的胎盘脐血干细胞，然后静置12天 让人类骨髓和外周组织的免疫重建持续数周。

人性化小鼠激素治疗

人性化小鼠(N个=4）麻醉，21天缓释（476 将雌二醇颗粒（美国创新研究中心，美国）植入颈部(Anipindi等人，2016年). 雌二醇的诱导量与发情周期相似(Modder等人，2004年). 为了确保皮下注射DMPA可诱导循环浓度与人类相似，我们给药1 毫克(N个=7）或2 毫克(N个=8）的DMPA或生理盐水（对照，N个=5）给NRG小鼠，并通过心脏穿刺1或3收集血液 几周后。如上所述，使用ELISA（EuroProxima）在血清中重复定量MPA(图5A） ●●●●。我们使用了2 后续实验中的mg剂量，因为循环MPA的变异性低于1 周，与1相比 mg剂量，因为出现了与女性相似的峰值和平台期(Hapgood等人，2018年).

人源化小鼠阴道糖原定量

对未感染人源化小鼠阴道组织中的游离糖原进行定量(N个=10). 小鼠用2 1或4 mg DMPA 周(N个=8，4/次）如上所述，阴道匀浆在100°C下煮沸10 min灭活酶。均质物（10 将µl一式四份）添加到96 well板中，并如上所述进行分析。

人源化小鼠阴道内HIV-1攻击

控制(N个=20）和2 mg DMPA-处理(N个=22）人源化小鼠阴道内注射105TCID50/ml NL4.3-Bal-Env HIV-1(Nguyen等人，2017). 如果在感染后第3周或第5周通过临床RT-PCR在外周血中检测到病毒载量，则人源化小鼠为HIV-1+（根据其可靠检测血液中HIV-1的能力选择时间点）(Nguyen等人，2017年).

统计分析

16S rRNA序列由我们内部的数据管道处理(Wessels等人，2017年；惠兰和苏雷特，2017年). 使用sl1p管道计算包括单粒子的α多样性(惠兰和苏雷特，2017年)，QIIME版本1.7.0-dev。使用了10个67821序列的稀疏表。使用GraphPad Prism（GraphPad-Software）绘制并分析观察到的物种、Chao1和Shannon多样性。数据以平均值±s.e.m.类群柱状图、Bray–Curtis差异PCoAs、热图、聚类分析、聚类树状图和物种估算的形式呈现，如下所述(Wessels等人，2017年).

使用Fisher精确检验或χ2（SigmaStat 3.5 Systat软件）。连续变量由Student的t吨-测试、Mann–Whitney秩和测试、单向方差分析或Kruskal–Wallis测试（Graphpad软件）。P（P）≤0.05被认为是显著的。

补充材料

补充信息：
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致谢

作者衷心感谢所有研究参与者，并感谢他们参与本试验。作者还感谢麦克马斯特中心动物设施的工作人员，并感谢劳拉·罗西、米歇尔·沙阿、菲奥娜·惠兰博士和安娜·阿基诺提供的技术援助。

脚注

竞争性利益

作者声明没有竞争或财务利益。

作者贡献

概念化：J.M.W.、J.L.、M.I.J.H.C.、K.R.F.、C.K。；方法：J.M.W.、J.L.、K.O。；软件：M.G.S。；形式分析：J.M.W.、J.L.、M.I.J.H.C.、K.O.、J.C.S.、M.G.S。；资源：F.V.、A.D.、M.J.T.、T.M.、A.A.A。；数据管理：J.M.W.、J.L.、M.I.J.H.C.、K.O.、A.M.F.、D.V.、H.A.D.、P.V.N.、K.M。；写作-原稿：J.M.W.，C.K。；写作-审查和编辑：J.M.W.、J.L.、M.I.J.H.C.、K.O.、A.M.F.、D.V.、H.A.D.、P.V.N.、K.M.、F.V.、J.K.、J.O.、J.C.、J.N.M.、A.D.、M.J.T.、T.M.、J.C.S.、A.A.A.、K.R.F.、M.G.S.、C.K。；可视化：J.M.W。；监督：K.O.、J.K.、J.O.、JC.、J.N.M.、K.R.F.、M.G.S.、C.K。；项目管理：J.L.、K.O.、J.K.、J.O.、JC.、J.N.M.、K.R.F.、C.K。；资金收购：C.K。

基金

本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）（C.K.）粘膜免疫学HIV疫苗开发团队拨款[FRN#138657]和CIHR运营拨款[FRN#126019]（C.K.]）的支持。C.K.是安大略省艾滋病毒治疗网络应用艾滋病毒研究主席奖的获得者。薪酬支持由CIHR奖学金（J.M.W.）提供，安大略妇女健康学者奖由安大略卫生和长期护理部（J.M.W）资助，以及由安大略省政府培训、学院和大学部（D.V.）资助的安大略研究生奖学金。资助机构在研究设计、收集、分析或解释数据方面没有任何作用。

数据可用性

数据已存放在GEO中，登录号为GSE138971标准.

补充信息

补充信息可在线获取，网址：http://dmm.生物学家.org/lookup/doi/10.1242/dmm.039669.supplemental

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