猪尾猕猴月经周期中SHIV获取时间估计值与阴道上皮层变薄的关系

摘要

介绍

HIV感染和女性生殖道系统感染的确定尚不完全清楚¹新的见解可能会导致生物医学艾滋病毒预防战略的新方法。阴道上皮被认为是HIV首次向浸润或潜在靶细胞传播的部位。在猕猴中，Hu等人证明SIV在阴道内暴露后迅速穿过阴道上皮²Carias等人报告了该屏障的有效穿透，表明存在简单的“扩散渗流机制”^三恒河猴在激素影响下阴道上皮组织变薄^4，5和尾纤^6-9猕猴。在人类月经周期中以黄体酮为主的自然时期，这种情况发生的程度要小得多^10，11以及一些研究中基于黄体酮的激素避孕^10-12，但其他人没有^13，14然而，尚未详细确定变薄的程度和时间过程。

上皮变薄被解释为猕猴月经周期中SHIV风险增加的可能原因^5，6.其他生物因素已被讨论为假定的艾滋病毒风险因素（在^15，16)，它们也可能影响SHIV风险（例如，阴道微生物组的变化、粘膜炎症、上皮的靶细胞浸润等）。缺乏定量数据将SHIV或HIV感染与这些生物因素联系起来。在一些观察性研究中，在激素避孕期间报告的HIV感染风险增加期间，这些因素也可能受到调节^17，18在女性身上。对这些假定的生物SHIV或HIV风险因素中的每一个进行仔细研究，预计将有助于对激素避孕与SHIV/HIV风险之间的关系进行全面的科学评估。

我们在这里测量了小尾猴月经周期中阴道上皮的厚度。这种组织与皮肤有许多相似之处¹⁹，包括其屏障功能，如HIV所示²⁰它是复层鳞状上皮，由四个不同的细胞层组成，即表层角质层（面向阴道管）和下层颗粒层、棘层和基底层^三，19HIV靶细胞，即Langerhans和CD4 T细胞，可以在上皮中发现，但主要位于固有层下。我们量化了未感染动物的上皮层厚度，并将数据与之前在不同组动物中测量到的SHIV获取相关联。我们的研究小组使用尾尾猕猴，通过重复低剂量（RLD）病毒暴露方法（例如。，²¹). 它模拟了人类性接触HIV，因为并非每次接触都会导致感染²²使用我们的动物模型，我们之前注意到，在这些动物的整个月经周期中，阴道SHIVSF162P3的获取并不是随机发生的，而是优先发生在月经前两周和整个月经期间^23，24这是在孕酮周期的高峰期间，以及孕酮下降的第二周。这就提出了一个问题，即激素诱导的上皮变薄是否与该模型中的估计感染时间相关，如果它确实是感染的易感因素，这也是可以预期的。

方法

动物、活检采集、月经周期测定

16只雌性辫猴(豚尾猴)出生在其他地方，购买并居住在疾病预防控制中心。年龄从4.5岁到14.2岁不等。除了猕猴PHQ1（ID列于表1)他有六个活产。阴道活检是通过使用刚性穿孔活检仪（EuroMed，Tuttlingen，德国）从三个不同的位置每次取4.2mmy×4.2mm的穿孔进行的，如前所述⁸记录部位的放射度和距阴道口的距离，避免在同一位置重复活检。每隔两周或三周进行一次活检。使用血浆孕酮（先前描述的）组合回顾性测定活检的月经周期日²³)每周测量一次，并在每个工作日观察月经血和性皮肤（会阴肿胀）²⁶，并分别以0/1和1-4的比例记录。所有16只动物都有月经周期（数据未显示）。月经周期测定的示例如所示图1.对于动物BB0499。周期的第一天是指月经出血的第一天。两只动物未观察到出血。在这些试验中，第1天的定义是孕酮在急剧下降后达到背景水平²³卵泡期定义为周期第1-16天，而黄体期为周期结束前第17天。活检时，动物年龄均匀分布在月经周期各时间点（数据未显示）。其他43只动物在整个月经周期中获取SHIVSF162P3的估计时间点汇总在其他地方²⁴43只动物中有19只的感染年龄为2.7至18.5岁。所有43只感染动物都有月经周期^23，24.

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图1

示例猕猴BB0499的月经周期开始时间测定。通过每日观察出血（开放性圆圈）、性皮肤肿胀（以1-4分为刻度，左轴，灰色条记录）和血浆孕酮（右轴，填充圆圈），回顾性地确定月经周期的开始和持续时间。在这个例子中，月经出血的开始定义了周期的第一天。在周期的第8天和第29天收集该动物的活检（交叉符号）。

表1

阴道上皮测量总结

动物 身份证件	月经 循环日	年龄 活组织检查 （年）	上皮 （嗯） 意思是	标准偏差	有核的 层 （嗯） 意思是	标准偏差	非- 有核的 层 （嗯） 意思是	标准偏差	数量 测量
PHQ1（第一季度）	1	14.08	82	48	82	48	0	0	157
BB405型	三	6.42	276	128	276	128	0	0	83
BB050型	三	4.42	361	89	240	71	121	43	43
BB108型	8	6.58	319	84	224	84	95	31	92
BB480型	8	6.42	270	91	185	65	85	38	445
BB552型	8	4.58	389	98	338	88	51	34	135
BB967（英国广播公司）	8	8.58	418	111	270	72	148	55	235
BB049型	8	6	260	141	190	68	70	87	141
第173页	8	9.58	325	143	214	181	111	71	149
BB981公司	8	12.58	535	104	358	103	176	39	149
PPi2（PPi2）	8	7.58	273	72	254	78	19	30	213
BB480型	9	6.33	475	199	361	163	113	53	157
BB537型	9	6.67	392	158	292	124	100	63	178
BB537型	15	6.75	248	67	198	65	50	18	93
BB770型	15	9.17	532	109	407	140	125	50	124
PHQ1（第一季度）	15	14.17	388	101	243	65	145	70	104
BB405型	17	6.5	445	111	272	79	173	64	103
BB552型	18	4.5	259	94	169	96	90	28	182
BB981公司	22	12.58	394	160	304	110	89	75	140
BB173型	22	9.67	250	97	182	74	69	39	58
BB480型	23	6.42	265	92	162	64	104	48	177
BB050型	25	4.5	156	58	130	55	26	27	138
BB269型	25	6.33	216	81	169	81	47	10	11
BB480型	25	6.33	200	69	155	63	44	17	145
BB770型	25	9.25	284	52	178	44	107	25	125
BB521型	27	6.17	211	58	139	47	72	40	175
BB108型	29	6.5	84	48	84	48	0	0	224
BB049型	29	6.08	114	75	99	58	15	33	52
BB967（英国广播公司）	29	8.67	224	88	189	81	35	31	185
PPi2（PPi2）	29	7.5	112	113	99	94	13	21	82

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16只猪尾猕猴整个月经周期的阴道上皮测量汇总，按月经周期天数排序。该表提供了每次活检时所有测量值的平均值，以及标准偏差（SD）。显示了30个活检结果；另外两次活检无法使用。每行汇总了一只动物在一个时间点的结果（ID=识别号）。“上皮”是指11–445次测量（最后一列）中平均有核层和无核层的总和，单位为微米（um），具体取决于收获组织的大小。

结果

月经周期中阴道上皮的动态变化

在16只小尾猕猴周期内的两个时间点评估阴道上皮结构。图2A显示了两种动物上皮厚度和角化程度的周期性变化。BB173的活组织切片显示了周期第8天和第22天的上皮细胞。BB405在周期第3天显示上皮变薄，没有角化，而在周期第17天显示上皮较厚，有显著的角化表层（角质层）。为了量化变化，我们分别测量了表层无核层和底层有核层的厚度。进一步区分有核上皮层（颗粒层、棘层、基底层）^{三，19，28}由于各层之间缺乏清晰的轮廓，因此未进行尝试。图2B显示了用于厚度测量的图像分析软件在手动划分无核和有核上皮层之间边界后的输出示例。动物BB770的组织显示在周期第15天（左侧、顶部和底部），动物BB0540的组织显示于周期第25天（右侧面板，底部）。

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图2 A

例如，在两个不同的时间点（放大10倍）对两只尾尾猕猴进行H&E染色阴道活检。文字插页是指猕猴的识别号和月经周期。B类：上图：无核和有核阴道上皮层图示。中间层是指颗粒链球菌和棘突链球菌。底部：使用文中描述的软件应用分析参数，在活检的所有安装部位以50微米的间隔测量上皮厚度。对每次活检的平均142个测量值进行分析。

表1总结了个别猕猴的上皮厚度测量结果。在第1个周期的第1天，在动物PHQ1的82微米处测量最薄的上皮。在月经周期第8天和第15天，BB981和BB770的上皮厚度分别为535和532μm。值得注意的是，在第1天、第3天或第29天，三只动物完全缺乏表面无核上皮层（PHQ1、BB405、BB108）。我们比较了卵泡期和黄体期的整个上皮的厚度，正如其他人之前在猪尾猴和恒河猴身上所做的那样^5，6卵泡的平均厚度为346μm，黄体期为230μm，减少至66%。这种差异具有统计学意义（p=0.007，Mann-Whitney检验）。

在整个周期中，平均厚度以4天为间隔显示，以更详细地显示动态变化图3A上皮在第9-12天最厚，平均总厚度为434μm，在月经前第29-32天最薄，为134μm，从高峰到低谷相对变薄至31%。在这些时候，表面无核层发生了较大的相对厚度变化，从峰值平均值106μm到最小平均值16μm，相对减少到15%。对于有核层，相应的平均厚度分别为327和118μm，减少至36%。图3B描述了使用平滑算法在周期期间上皮及其组成层的动态变化。

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图3

月经周期中阴道上皮的动态变化。答：在所示的4天周期分段中测量动物各层的平均上皮厚度和SD（标准偏差，误差线）。B类：如图所示，使用平滑曲线绘制上皮厚度层的动态变化图。

上皮厚度与估计的SHIV获得之间的关系

我们之前报道了43只不同猕猴月经周期内SHIV获得的估计时间点²⁴在猕猴的整个周期中，每周或每周两次重复接触低剂量病毒，与周期相关的随机接触开始时间，在中位五次接触后导致感染²⁴活组织检查具有侵袭性，可能会损害阴道上皮并产生病毒进入点，从而增加感染的易感性。因此，我们使用了先前收集的数据²⁴并独立检测了16只未感染猕猴周期内相应时间段阴道上皮厚度与阴道上皮厚度的关系。图4A显示了之前报告的估计SHIV采集时间点，并以4天的间隔进行重新粒度分析。如前所述，大多数感染估计发生在周期的第1-8天和第25-32天²⁴估计感染率与无核层厚度呈负相关（Pearson r=-0.7，p<0.05，线性回归分析），但与有核层厚度相关性较小，且无统计学意义（Pearson's r=-0.6，p=0.15，图4B、C). 感染与整个上皮厚度（即两层的总和）的相关性在统计学上不显著（Person的r=-0.7，p=0.06，未显示图表结果）。平滑数据曲线中的模式进一步支持了负相关发现(图4D). 该图显示了一种相反的关系，上皮厚度在最高传播事件时最低，在最低传播事件时最厚，即在月经周期的开始和结束时。

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图4

上皮厚度与SHIV感染易感性的关系答：。图中显示了43只雌性尾猴患est的百分比。（=估计）四天的指定月经周期段的SHIV采集时间点。据报道，在低病毒剂量下反复阴道接触后，猕猴感染了SHIVSF162P3²⁴。每隔4天对数据进行分析和绘制。B、 抄送：43只不同猕猴4天月经周期中平均阴道上皮层厚度的散点图，以及在相应的4天周期中估计的SHIV获得量。直线代表线性回归分析；R=皮尔逊系数；p值来自非零斜率的假设检验。右Y轴表示中报告的感染数量²⁴.D。绘制平滑的数据，以进一步检查无核层厚度与整个月经周期感染易感性之间的关系。

年龄、上皮厚度和感染易感性之间的关系

所有活组织检查的动物都是育龄动物，年龄从4.5岁到14.2岁不等(表1). 我们使用分层多变量回归模型检测上皮厚度是否随年龄变化，该模型控制了整个月经周期中上皮深度的变化。特别值得关注的是，模型地层的数据点来自上皮最厚的时间段，即不可能由于激素的影响而变薄。因此，我们选择了平均上皮最厚的月经周期的一半，即第5-20天(图3A). 此时，无核层的厚度与年龄增长相关（p=0.002，图5A)，但有核层的厚度没有（p=0.46图5B)总厚度也没有（p=0.08，多变量回归，未显示图表数据）。我们还检查了周期中组织因激素影响而变薄时的年龄和厚度，即第1-5天和第21-32天。对于有核或无核层，年龄和减薄之间没有关联（数据未显示）。最后，我们询问在RLD动物模型中，年轻动物是否更容易受到阴道感染，因为与老年动物相比，他们的阴道上皮无核层在中期较薄。我们能够确定43只先前检查过的受感染动物中19只的出生日期和感染年龄²⁴在这些患者中，年轻与感染易感性增加无关(图5C)，因为年龄与感染动物的接触次数之间没有显著相关性（皮尔逊r=0.1，p>0.05，线性回归分析，图5C)尽管该模型没有控制月经周期中时间的潜在混淆。

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图5

年龄、阴道上皮厚度和感染易感性。A、 B。散点图显示了16只猕猴的平均阴道层厚度和年龄分布，范围为4.5至14.2岁。厚度在第5-20天之间进行评估，即当厚度较高且不受激素影响而变薄时。直线代表线性关系；p值检验了多变量模型中非零斜率的假设，该模型控制了月经周期中厚度水平的变化C、。散点图显示了19只猕猴被反复低剂量SHIVSF162P3阴道感染时的年龄，如²⁴.

讨论

本研究的目的是描述小尾猴月经周期中阴道上皮变化的程度和动力学，与之前的研究相比，在时间上更加详细。我们发现，与卵泡期相比，黄体期上皮变薄至原来厚度的66%，与之前在猕猴中的发现类似^5，6然而，正是在更窄的时间间隔内，我们看到这些动物阴道组织的厚度不断变化。当比较周期中最厚和最薄的四天间隔时，观察到最大减薄为31%。值得注意的是，在同一时间段内，无核层减薄至其最大深度的15%。当月经周期被分析为卵泡期或黄体期时，上皮变化的程度并没有完全认识到。另一个研究目的是评估阴道感染次数与上皮变薄之间的关系。在使用两组不同的研究动物时，我们将最薄无核上皮层的时间与最高感染概率的时间相关联。我们的研究为阴道上皮的屏障功能及其长期怀疑的作用提供了新的、更定量的支持⁴研究雌性猕猴感染SIV和SHIV的风险。

阴道表层上皮（角质层）变薄与周期内SHIV感染显著相关。角质层链球菌可能对宿主防御特别关键^16，28这一层只有松散的细胞间连接，因此很容易被入侵的病原体穿透^2，三它的细胞是终末分化的，基本上失去了细胞核和蛋白质生产机制，因此不能重新产生免疫反应。尽管如此，该层被认为在抗HIV防御中起着重要作用，因为它富含糖原，这是滋养阴道微生物群（维持阴道pH值）所必需的特征。微生物群在宿主防御中的作用仅部分被阐明，但很明显，导致细菌性阴道病的微生物组的变异会增加艾滋病毒感染的风险^29，30然而，值得注意的是，人类和短尾猿生殖器微生物种群之间存在显著差异³¹角质层链球菌通过不断脱落自身和任何附着的病原体，也可以去除入侵病原体的角质。因此，稀释不仅可以通过减少物理屏障和与靶细胞的距离，还可以通过细菌菌群或其他先天抵抗机制的相关变化来促进SHIV的摄取。

人类阴道上皮和猪尾阴道上皮之间存在重要差异。与猕猴相比，人类阴道上皮无角质化，在周期中不易变薄，对激素避孕反应也不太强烈。Mauck等人发现20名平均年龄为35.4岁的女性在卵泡期和黄体期之间阴道壁平均上皮高度有微小但具有统计学意义的变化¹⁰根据两位独立病理学家的读数，我们计算得出，黄体期上皮变薄至滤泡期厚度的83%或73%（分别为212至174.6微米和283.6至205.9微米），以与我们的分析相匹配。在使用DMPA（dept-醋酸甲羟孕酮，品牌名称Depo-Provera®）期间，厚度没有进一步降低。Chandra等人¹¹据我们计算，减薄至86%，尽管减薄在统计上并不显著。在一些研究中，DMPA的使用导致稀释¹²，但其他人没有^13，14因此，与猪尾猕猴相比，人类阴道上皮厚度的激素诱导波动更为有限。然而，人类减薄的动力学和程度可能没有像这里记录的那样进行详细的研究，可能被低估了。

研究局限性包括动物数量少，无法在每个月经周期对每只动物进行两次以上的活检，以及如前所述，由于未知的日食期，感染时间可能不准确^23，24上皮厚度与感染易感性之间的关系基于生态学推断，因为研究的是不同动物而非单一动物群体的聚合数据。这是不可能的，因为活检采集有望促进SHIV的获得。因此，我们不能得出结论，阴道上皮厚度是防止SHIV感染的“相关保护”。然而，我们的发现并没有反驳这种可能性。此外，我们没有收集有关浸润淋巴细胞的信息，即HIV的靶细胞。

我们所有的动物都是在性成熟后购买的，而性成熟发生在这个物种的2.5到3岁。因此，我们无法检测非常年轻的女性的减薄或感染易感性。我们也无法检查间伐与其他可能与年龄增长相关的生殖因素的关系，例如，性经验增加或产次增加，因为这些信息没有包括在购买动物时的健康记录中。重要的是要指出，厚度增加与年龄的关系只适用于生殖年龄的动物，而不是超过其生殖阶段的动物。在女性中，阴道上皮在绝经后会变薄，这可能是由于雌激素水平低。猕猴会出现更年期³²，但预计在25岁之前不会出现，这远远超过了我们辫子猕猴种群的年龄范围。

总之，我们通过量化整个月经周期中不同的阴道上皮层厚度，记录了猕猴阴道上皮变薄的程度和动力学。我们的分析表明，月经期间的变稀程度比之前观察到的要大。我们描述了月经周期中阴道变薄与感染易感性的关系。这些数据有助于我们了解SHIV感染的先天抵抗机制。

致谢

脚注

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