长期接触孕酮可防止阴道内接种减毒单纯疱疹病毒2型后引起保护性粘膜反应

动物接种。

小鼠通过腹腔注射麻醉剂（氯胺酮-噻嗪，分别为0.75和0.25 ml）麻醉，置于其背部，并在阴道内接种10μl野生型HSV-2菌株333或减毒TK⁻HSV-2菌株，每株剂量为10⁵每只鼠标的PFU。在麻醉的影响下，将小鼠仰卧45分钟至1小时，让接种物感染它们。

阴道涂片和灌洗液收集。

将2×30μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）从阴道内外多次吸出，收集用于生殖周期分期和菌斑检测的阴道灌洗液。对于阴道涂片，将液体涂在玻片上并用光学显微镜检查，以确定如上所述的发情周期的阶段(30). 以下分类用于确定周期的阶段：发情期，>90%的角化上皮细胞；间期，>75%的多形核细胞；发情间期，50%上皮细胞-50%多形核细胞。对于菌斑分析，阴道冲洗液在−70°C下冷冻。如前所述，用Depo治疗的小鼠在5至6周内处于间期(10). 对Depo 5和Depo 15小鼠的阴道涂片进行检查，以确认它们在接种TK之前均处于月经间期⁻HSV-2和野生型HSV-2的挑战。

生殖道中的病毒复制和病理学。

每日监测HSV-2感染后的生殖器病理，并按五分制评分：0分，无感染；1、外阴道轻度发红；2、外阴道红肿；3、阴道及周围组织严重肿胀、发红，生殖器部位脱发；4、生殖器溃疡，生殖器及周围组织严重红肿脱发；严重的生殖器溃疡延伸至周围组织。动物在达到第四阶段后被处死。

通过菌斑试验分析阴道冲洗液或组织匀浆中的病毒滴度。Vero细胞在添加了5%胎牛血清（GIBCO）、1%青霉素-链霉素和我-谷氨酰胺（GIBCO）。对于斑块分析，Vero细胞在12孔板中生长汇合。样品被稀释（10⁻²到10⁻⁷)并添加到单层中。将受感染的单层在37°C下孵育2小时，以进行病毒吸收。用补充有0.05%人类免疫血清球蛋白（加拿大血液服务局）的α最小必需培养基覆盖受感染的单层。在37°C下感染48小时。然后固定单层并用结晶紫染色，并在光学显微镜下计数病毒斑块。每毫升PFU是通过对每个样本进行菌斑计数并考虑稀释系数来计算的。

ELISA检测抗HSV-2 gB-IgG和IgA。

HSV-2糖蛋白B（gB）特异性抗体滴度通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定，该试验根据之前描述的方案进行了修改(8). 简而言之，将Maxisorp 96板（加拿大安大略省伯灵顿市Invitrogen）在4°C的PBS中涂上2.5μg重组gB蛋白（加利福尼亚州埃默里维尔市Chiron公司）/ml过夜。在室温下用2%牛血清白蛋白封闭平板2小时，并装入100μl样品或对照品的两倍系列稀释液。在4°C温度下培养过夜。清洗板，并与以下生物素化抗体之一反应1小时：山羊抗鼠IgG或山羊抗鼠-IgA，稀释度为1:1000（加拿大安大略省米西索加市PharMinen）。用外维定过氧化物酶（1:2000稀释）和3,3′，5,5′-四甲基联苯胺制成平板。测定终点滴度，并将其表示为几何平均滴度±平均值标准误差（SE）。通过使用非免疫小鼠的阴道灌洗样品获得背景值。取平均背景光密度值的两倍作为确定正值的截止值。

LN细胞的制备和培养。

解剖引流生殖道的髂骨淋巴结，通过刺激淋巴结制备单细胞悬液。让碎片沉降2分钟，回收含有单个细胞的上清液，并以500×克用含有5%牛血清白蛋白的RPMI 1640培养基冲洗细胞7至10分钟，然后以5×10的密度进行电镀⁵96 well板中的细胞/孔。通过在三份培养物中添加gB（10μg/ml）（Chiron Inc.），对细胞进行HSV-2特异性增殖测试。通过向涂有抗CD3抗体（20μg/孔；从克隆2C11中纯化，由麦克马斯特大学D.P.Snider慷慨提供）的平板中添加细胞来测量总T细胞增殖。培养物孵育48小时，收集上清液并冷冻以进行进一步测试。通过摄入1μCi[^三H] 三天培养的最后18小时每孔胸腺嘧啶核苷。结果以每分钟平均计数±三份培养物平均数的标准偏差报告。

细胞因子ELISA。

根据试剂盒中推荐的方案，使用R&D Systems（明尼阿波利斯）的商业ELISA试剂盒测量LN上清液中的细胞因子水平。将收集的上清液的50微升等分试样一式两份进行。在450 nm处读取吸光度。使用标准曲线计算每个样品中每毫升浓度的微克数。计算每只动物的γ-干扰素（IFN-γ）与白细胞介素10（IL-10）和IFN-γ与IL-4的比值，并计算每个实验组的平均±SE。

TK免疫后的病毒脱落模式⁻HSV-2和随后的HSV-2挑战。

检查两组小鼠在保护方面的差异是否与TK能力相关⁻病毒感染生殖道后，我们检测了免疫后以及野生型HSV-2攻击后的病毒滴度。遵循TK⁻Depo 15和Depo 5组阴道分泌物中的HSV-2免疫病毒滴度相似（图。​（图2A）。2安培). HSV-2攻击后，阴道冲洗液中测得的病毒滴度与病理数据显示出良好的相关性（图。​（图2B）。2B型). Depo 5组的所有动物在3天内解决了感染问题，随后在其阴道冲洗液中未检测到病毒滴度。相比之下，Depo 15组中六分之四的动物在测量脱落的所有六天内都具有高病毒滴度。这些动物与表现出严重病理的动物相同（图。​（图11).

在单独的窗口中打开

图2。

TK免疫小鼠阴道冲洗液中的病毒滴度⁻经过15或5天的Depo治疗（A）后，用HSV-2静脉注射激发HSV-2。3周后（B）。每组12只小鼠接种10只⁵TK的PFU⁻HSV-2型。每天在PBS中收集阴道冲洗液，并进行病毒斑块分析以计算病毒脱落。对斑块进行计数，病毒滴度以每毫升PFU表示。每个符号代表一种动物。所示数据代表了至少三个具有类似结果的独立实验。虚线表示病毒斑块分析的检测下限。

免疫后和激发后阴道冲洗液中的IFN-γ水平。

先前实验的结果表明，5天的Depo治疗可以保护小鼠免受随后的HSV-2攻击，但15天的Deo治疗不能。先前的研究表明，分泌到阴道分泌物中的IFN-γ是局部抗病毒反应的良好指标(18). 为了检测受感染动物体内局部IFN-γ的产生是否存在差异，我们检测了阴道分泌物中的IFN-γ水平。接种TK后⁻HSV-2，Depo 5组在免疫后第2天出现了分泌到阴道分泌物中的IFN-γ的早期峰值，其他研究也报道了这一点（图。​（图3B）。3B公司). 在Depo 15组中没有出现这种早期IFN-γ峰值。免疫后，在该组的阴道冲洗液中检测到极低水平的IFN-γ（图。​（图3A第3页).

在单独的窗口中打开

图3。

TK免疫小鼠阴道冲洗液中IFN-γ浓度⁻HSV-2和HSV-2菌株333攻击后。用10只小鼠免疫小鼠（每组6只）⁵TK的PFU⁻在Depo治疗后15或5天，HSV-2开始静脉注射。带10⁵3周后HSV-2的PFU。每天在免疫接种和挑战后收集阴道冲洗液。由于每只小鼠可获得的样本量较小，因此将所有六只动物的阴道冲洗液汇集在一起，并通过ELISA测定IFN-γ水平。这些数据代表了从两个具有可比结果的独立实验中获得的数据。（A） TK免疫小鼠⁻Depo治疗后15天，HSV-2。（B） TK免疫小鼠⁻Depo治疗后5天出现HSV-2。（C） 德波15只小鼠在挑战后。（D） 戴波5只老鼠挑战后。

HSV-2攻击后，Depo 5动物在攻击后第1天出现早期IFN-γ分泌高峰。到第4天，水平降至可检测水平以下，与病毒清除模式一致（图。​（图3D）。三维). 另一方面，在Depo 15只动物中，IFN-γ反应在挑战后第2天达到峰值，并显示出其他研究中所见的典型双相模式(18)初次接触病毒后，在第6天仍然存在高水平的IFN-γ（图。​（图3C3C公司).

TK排空LN中的T细胞反应⁻HSV-2免疫小鼠。

因为我们观察到，在接受TK治疗的Depo 15组中，阴道分泌物中的局部IFN-γ反应降低⁻我们检测了HSV-2免疫后5天，在两组小鼠中，T细胞免疫应答在局部LN排出生殖道。在这些实验之前，测定了排泄LN中T细胞反应的时间动力学，发现免疫后第5天是测量HSV-2特异性LN T细胞反应（数据未显示）的最佳时间。为了检测免疫后的总T细胞反应，用抗CD3抗体在体外激活LN T细胞。通过用高免疫原性HSV-2包膜糖蛋白gB体外刺激来测量HSV-2特异性反应。遵循TK⁻免疫后，来自Depo15和Depo5组的LN细胞对体外gB挑战或抗CD3抗体刺激的增殖反应没有显著差异（图。​（图4A）。4A级). 然而，当在体外gB激发的LN细胞的培养上清液中检测细胞因子时，Depo 5培养物的IFN-γ水平大约是Depo 15 LN培养物的三倍（图。​（图4B）。4B类). 与Depo 15组相比，Depo 5组的IL-4水平较低，IL-10水平较高，尽管这些水平没有统计学意义（图。​（图4C4摄氏度和D）。然而，当计算Th1/Th2比率时，Depo 5 LN培养物的IFN-γ/IL-4比率高于其他培养物(P（P）<0.01）（图。​（图4E）。第四版). 同样，与Depo 15组相比，Depo 5组上清液中的IFN-γ/IL-10比率增加了三倍（图。​（图4F4楼).

在单独的窗口中打开

图4。

Depo处理的TK免疫小鼠的LN增殖和细胞因子反应⁻HSV-2型。用10⁵TK的PFU⁻德波治疗后15或5天，HSV-2感染。免疫后5天提取髂骨LN，并按照材料和方法中的描述培养细胞48小时。（A） 用抗CD3抗体（CD3）和HSV-2 gB检测LN细胞增殖。对照培养物仅接受培养基。结果显示为平均值±标准偏差。（B至D）用gB蛋白培养48小时后收集上清液，并通过ELISA分别分析IFN-γ、IL-4和IL-10。计算每只动物的Th1/Th2比值，并显示各组的平均值±SE。（E） γ/IL-4比值。（F） IFN-γ/IL-10比值。所示数据代表了两个具有类似结果的独立实验。

在HSV-2攻击后5天，也检查了T细胞反应（数据未显示）。与阴道分泌物中病毒脱落和IFN-γ反应的观察结果一致，在挑战后第5天，Depo 5动物的T细胞反应超过峰值，所有细胞因子水平与未感染小鼠的水平相当。另一方面，Depo 15 LN显示IFN-γ水平显著升高，Th1/Th2比值显著升高，表明对HSV-2有初步反应。

这项工作得到了加拿大卫生研究院（给C.K.和K.L.R.）、安大略省艾滋病毒治疗网络（C.K.）和Bickell基金会（C.K.K.）的研究资助。C.K.是安大略省艾滋病毒治疗网络学者。

我们感谢Jen Newton和Amy Patrick的技术帮助。我们还感谢丹尼斯·斯奈德对手稿的批判性阅读。