成骨细胞分泌Cxcl9调节骨血管生成

成骨细胞产生血管抑制因子

上述结果表明，mTORC1调节成骨细胞中血管生成和（或）血管抑制因子的表达，以调节骨中血管系统的形成。与这个概念一致，VEGF表达增强(图3a)和分泌物(补充图3a)Δ中观察到成骨细胞Tsc1型小鼠，表明mTORC1刺激了成骨细胞中VEGF的表达。尽管如此，成骨细胞中VEGF的增强表达预计会在骨中产生更多的血管，理论上不能解释ΔTsc1型老鼠。VEGFR2（激酶插入域受体（KDR））是内皮细胞中传递VEGF信号的主要受体²⁵，表现出一致的表达，但当暴露于VEGF分泌量增加ΔTsc1型成骨细胞(图3b). 此外，初级ΔTsc1型成骨细胞表达增加(图3c)和分泌物(补充图3b)血管内皮生长因子在体外从这些细胞中收集的CM抑制了HUVEC中VEGF信号级联的转导，KDR及其下游介质PLCγ1和ERK1/2的磷酸化降低揭示了这一点(图3d).

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图3

mTORC1对成骨细胞中VEGF的调节不能解释突变小鼠骨的血管表型。

(一)12周龄雄性小鼠骨中VEGF和Ocn免疫染色的代表性图像及VEGF定量分析⁺成骨细胞与总成骨细胞的比较。比例尺，50 微米。n个=每组9人。(b条)12周龄雄性小鼠骨骼中CD31、KDR和pKDR（Y1175）免疫染色的代表性图像，以及KDR的定量分析⁺和pKDR⁺骨髓中内皮细胞与总内皮细胞的比较。比例尺，50 微米。(c（c）)原代成骨细胞中VEGF的蛋白质印迹。(d日)原代成骨细胞CM作用10年后HUVEC KDR、PLCγ1和ERK1/2磷酸化的Western blot研究 最小数据显示为平均值±标准差*P（P）<0.05, **P（P）<0.01（学生的t吨-测试）。Ctrl，control。

成骨细胞分泌VEGF与内皮细胞中VEGF信号级联转导之间的脱节复制于Δ猛禽老鼠。与VEGF表达总体下降不一致(图3a)和分泌物(补充图3a)乘以Δ猛禽成骨细胞中，Δ猛禽老鼠(图3b). 此外，当Δ猛禽表达成骨细胞(图3c)和秘密的(补充图3b)VEGF减少在体外，HUVECs在Δ猛禽成骨细胞(图3d). 总之，这些数据表明，mTORC1正向调节成骨细胞中VEGF的表达和分泌，这并不能解释突变小鼠骨骼和在体外表明成骨细胞可能产生血管抑制因子来阻断骨中的VEGF信号。

Cxcl9由成骨细胞组成

为了筛选血管抑制因子，我们在ΔTsc1型或使用微阵列控制颅骨成骨细胞。在上调的mRNA中，Cxcl9被报道为肝内VEGF信号传导的直接反调节分子²⁶重要的是，发现Cxcl9在骨细胞的成骨细胞中组成性表达(图4a)其受体CXCR3在骨髓中的内皮细胞和培养的HUVEC中表达(图4b、c). CXCR3在两种转基因小鼠模型及其相应的对照中表现出一致的表达(图4b)但Cxcl9在骨髓和血清中的表达和分泌量显著高于ΔTsc1型成骨细胞(图4a、d). 此外，Cxcl9 mRNA表达显示初级Δ增加了7倍Tsc1型成骨细胞与对照细胞(图4e). 蛋白质表达进一步证实了类似的增加模式(图4f)和分泌水平(图4g).

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图4

mTORC1调节成骨细胞中的Cxcl9。

(一)的代表性图像就地12周龄雄性小鼠股骨切片中Cxcl9 mRNA杂交与Runx2免疫染色。方框区域在右下角放大。Cxcl9公司⁺成骨细胞总数中的成骨细胞也被定量。比例尺，50 微米。n个=每组9人。(b条)CD31中CXCR3免疫染色的代表性显微照片⁺骨髓内皮细胞与CXCR3的定量分析⁺12周龄雄性小鼠骨骼中总内皮细胞中的内皮细胞。比例尺，50 微米。n个=每组9人。(c（c）)培养的HUVEC中CXCR3免疫染色的代表性显微照片。比例尺，100 微米。(d日)用ELISA法评估骨髓（BM）和血清中Cxcl9的浓度。n个=每组5人。(e（电子）)原代成骨细胞Cxcl9 mRNA的定量PCR分析。(（f）)原代成骨细胞中Cxcl9的蛋白质印迹。(克)通过ELISA评估原代成骨细胞CM中Cxcl9的浓度。n个=每组5人。数据显示为平均值±标准差*P（P）<0.05, **P（P）<0.01（学生的t吨-测试）。Ctrl，control。

与Δ相反Tsc1型小鼠，Δ猛禽成骨细胞的Cxcl9表达水平显著降低(图4a)和分泌物(图4d). Cxcl9 mRNA(图4e)，蛋白质表达(图4f)和分泌物(图4g)Δ中均减少猛禽颅骨成骨细胞培养在体外根据这些观察结果，我们得出结论，mTORC1正向调节成骨细胞中Cxcl9的表达和分泌，这可能解释了上述突变小鼠的血管生成表型。

Cxcl9抑制骨血管生成

接下来，我们试图确定Cxcl9是否与两个小鼠模型中的血管结构改变有关。ΔTsc1型用抗Cxcl9抗体处理小鼠，以中和内源性Cxcl9。有趣的是，抗Cxcl9抗体显著增加了骨CD31的数量⁺内毒素⁺容器ΔTsc1型小鼠比对照组小鼠多(图5a). 如上所述，HUVEC保持在ΔTsc1型CM表现出增殖和迁移受损。当细胞在添加了抗Cxcl9的相同培养基中生长时(补充图4a)和迁移率(补充图4b)的细胞明显升高到高于用对照培养基处理的细胞的水平。此外，当HUVEC在ΔTsc1型补充抗Cxcl9的CM与ΔTsc1型成骨细胞与对照成骨细胞(图5b). 重要的是，HUVEC中KDR及其下游介质的磷酸化降低均增加到基础水平以上(图5c). 此外，Cxcl9在Δ中下调Tsc1型siRNA诱导的成骨细胞，CM也能促进HUVEC的增殖、迁移和成管(补充图5). 这些数据表明，成骨细胞中Cxcl9升高是ΔTsc1型老鼠。随着Cxcl9的血管抑制作用被消除，VEGF信号转导恢复，大量VEGF表达于ΔTsc1型成骨细胞在促进骨血管生成和在体外.

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图5

Cxcl9负责突变小鼠骨骼中的血管表型。

(一)CD31和EMCN免疫染色微血管的典型共焦图像，以及ΔTsc1型给予Cxcl9抗体（Ab）和Δ的小鼠猛禽小鼠皮下注射Cxcl9。比例尺，100 微米。n个=每组9人。(b条)代表性Matrigel试管形成分析图像，并使用CM（添加或不添加Cxcl9或Cxcl9-中和抗体）对培养的HUVEC的试管面积进行定量分析，如图所示。比例尺，100 微米。n个=每组9人。(c（c）)Western blot检测用CM处理的HUVEC中KDR、PLCγ1和ERK1/2的磷酸化，CM来自原代成骨细胞，添加或不添加Cxcl9或Cxcl9-中和抗体 最小数据显示为平均值±标准差*P（P）<0.05, **P（P）<0.01（学生的t吨-测试）。Ctrl，control。

测试Δ中减少的Cxcl9猛禽成骨细胞有助于增加骨中的血管，我们治疗Δ猛禽Cxcl9小鼠。Δ猛禽接受Cxcl9治疗的小鼠的血管明显少于接受磷酸盐缓冲盐水（PBS）治疗的小鼠和对照小鼠(图5a). Cxcl9还显著逆转了Δ对增殖和迁移的促进作用猛禽HUVECs中的CM并进一步减少增殖(补充图6a)和迁移(补充图6b)以低于在对照培养基中保存的细胞中的速率。在Matrigel分析中，HUVEC中的网络维持在Δ猛禽添加Cxcl9的培养基比在对照培养基中生长的培养基形成更少(图5b). 细胞集裂解物的免疫印迹分析揭示了潜在的机制。由于VEGF信号转导在维持在Δ猛禽在同一培养基中补充Cxcl9可阻断细胞内的CM信号转导(图5c). 这些观察结果表明，成骨细胞中Cxcl9表达的减少是Δ猛禽老鼠。由于Cxcl9在Δ中下调猛禽成骨细胞通过Cxcl9阻断VEGF信号转导，ECs中VEGF的释放通过Δ猛禽成骨细胞能够更有效地发挥其促血管生成作用，导致骨内形成更多的血管。总之，这些发现表明Cxcl9拮抗VEGF信号，以防止骨中的血管生成。接下来，我们确定了Cxcl9拮抗内皮细胞中VEGF信号转导的机制。我们首先研究了CXCR3（Cxcl9受体）是否在我们的模型中介导Cxcl8的抗血管生成作用。由于CXCR3被补充了ΔTsc1型CM中培养的人脐静脉内皮细胞增殖率低(图6a)和迁移(图6b)形成管的能力较差(图6c). 此外，NBI-74330阻断CXCR3活性，但未能缓解Cxcl9对内皮细胞中VEGF信号转导的抑制Tsc1型构型管理(图6d)表明Cxcl9在该模型中不需要CXCR3来抑制血管生成。另一方面，补充VEGF可显著逆转ΔTsc1型构型管理(图6a–d). 根据这些观察结果，我们假设Cxcl9可以与VEGF相互作用并减弱其与内皮细胞的结合。我们进一步将重组小鼠Cxcl9和VEGF混合₁₆₄ 在体外以及使用抗Cxcl9抗体的免疫沉淀VEGF。如所示图6e，抗Cxcl9抗体成功沉淀VEGF₁₆₄来自VEGF混合物₁₆₄和Cxcl9，但未能沉淀VEGF₁₆₄从含有VEGF的溶液中提取₁₆₄独自一人。这些结果表明Cxcl9与VEGF相互作用₁₆₄ 在体外为了研究Cxcl9对VEGF与内皮细胞结合的影响，将HUVECs与10 纳克 毫升^{−1 125}I–血管内皮生长因子₁₆₄以及Cxcl9浓度的增加。正如预期的那样，Cxcl9能够抑制¹²⁵I–血管内皮生长因子₁₆₄至EC(图6f). 总之，这些发现表明Cxcl9与VEGF相互作用，阻止VEGF与内皮细胞结合，从而拮抗内皮细胞中的VEGF信号转导。

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图6

Cxcl9通过与VEGF相互作用并阻止其与内皮细胞的结合，对抗内皮细胞中的VEGF信号转导。

(一)HUVEC中BrdU（绿色）免疫染色的典型共焦图像和BrdU定量分析⁺单元格数超过总单元格数。比例尺，100 微米。n个=每组9人。(b条)0时HUVEC伤口的代表性显微照片 h和18之后 h；虚线突出显示了每组细胞的线性划痕/伤口。条形图显示伤口闭合的平均百分比。比例尺，200 微米。n个=每组9人。(c（c）)用Matrigel培养的HUVEC成管的典型显微照片和管面积的定量分析。比例尺，200 微米。n个=每组9人。(d日)Δ处理的HUVEC中Akt（S473）、Src（Y416）、KDR、PLCγ1和ERK1/2磷酸化的Western blotTsc1型CM加或不加NBI-74330（CXCR3拮抗剂）或VEGF，如10所示 最小值(e（电子）)重组小鼠Cxcl9和VEGF₁₆₄与抗Cxcl9抗体混合并免疫沉淀，并用抗VEGF抗体进行免疫印迹检测。(（f）)的绑定¹²⁵I–血管内皮生长因子₁₆₄在Cxcl9浓度增加的情况下。所示为特异性结合，通过从总结合中减去非特异性结合计算得出。数据显示为平均值±标准差**P（P）<0.01（学生的t吨-测试）。

Cxcl9抑制成骨

鉴于血管生成和骨生成在骨中是耦合的，我们接下来研究Cxcl9在骨形成中是否有任何直接作用。用上述Cxcl9抗体治疗后，ΔTsc1型小鼠表现出成骨细胞分化、骨基质矿化和骨结构正常化的部分恢复(补充图1). 相反，Δ猛禽接受Cxcl9的小鼠表现出成骨细胞分化障碍和更严重的骨量损失(补充图2). 由于CXCR3在成骨细胞中的表达在两个基因敲除小鼠及其对照组之间是一致的(补充图7a)，我们怀疑Cxcl9可能对成骨细胞的功能产生抑制作用。为了更好地描述Cxcl9在成骨细胞中的作用，我们在培养的MC3T3-E1细胞中添加了重组Cxcl9-CXCR3表达(补充图7b). Cxcl9对增殖有显著抑制作用(图7a)，差异化(图7b)MC3T3-E1细胞矿化(图7c). 由于NBI-74330对CXCR3的抑制未能逆转Cxcl9对成骨作用的废除(图7a–c)，我们怀疑Cxcl9可能通过CXCR3非依赖机制抑制成骨。有趣的是，补充VEGF可显著逆转Cxcl9对MC3T3-E1细胞成骨的抑制作用(图7a–c)，表明Cxcl9可能通过与VEGF相互作用来阻止成骨。事实上，Cxcl9能够消除VEGF与MC3T3-E1细胞的结合在体外(图7d). 此外，Cxcl9抑制大鼠骨髓干细胞（BMSCs）的增殖、分化和矿化，并阻止VEGF与这些细胞的结合(补充图8). 综上所述，这些观察结果表明Cxcl9可能抑制骨内成骨在体外通过与VEGF相互作用和消除VEGF与成骨细胞的结合。

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图7

Cxcl9通过与VEGF相互作用和消除VEGF与成骨细胞的结合来抑制成骨。

(一)MC3T3-E1细胞的BrdU染色及BrdU的定量分析⁺所有单元格中的个单元格。比例尺，100 微米。(b条)成骨诱导第7天MC3T3-E1细胞中成骨标志物Ocn和Runx2表达的Western blot分析。(c（c）)第14天分化MC3T3-E1细胞的茜素红染色。比例尺，1 厘米(d日)的绑定¹²⁵I–血管内皮生长因子₁₆₄在Cxcl9浓度增加的情况下对MC3T3-E1细胞进行诱导。所示为特异性结合，通过从总结合中减去非特异性结合计算得出。数据显示为平均值±标准差*P（P）<0.05, **P（P）<0.01（学生的t吨-测试）。

Micro-CT分析

对12周龄雄性小鼠（每组5只）的股骨进行解剖，固定48只 4%多聚甲醛中的h在12时的分析 micro-CT扫描仪上的μm分辨率（Viva CT40；Scanco Medical AG，Bassersdorf，瑞士）。简言之，我们扫描了股骨下部的生长板，并向近端延伸了300片。我们从第一个切片开始进行形态计量学分析，其中股骨髁完全融合并向近端延伸100个切片。使用轮廓工具，我们在关键切片上手动从皮质外壳分割小梁骨，并自动变形轮廓以分割所有切片上的小梁骨。构建三维结构和形态计量学，并对小梁骨体积分数（BV/TV）、小梁厚度（Tb.Th）、小梁数（Tb.N）和小梁分离（Tb.Sp）进行分析。我们还对股骨中段进行了显微CT成像，并对100个切片进行了中段评估，以量化皮质厚度（CT.Th）和骨膜周长（Ps.Pm）。

切片和细胞的免疫染色及组织形态计量学分析

小鼠后肢组织用4%多聚甲醛固定在4 48°C h，然后在4的15%乙二胺四乙酸（EDTA；pH 7.4）中脱钙 °C持续14天。将组织包埋在石蜡或最佳切割温度复合物（Sakura Finetek）中 制备μm矢状面切片进行组织学分析。对于免疫组织化学，我们培养了识别小鼠磷酸化-S6（Ser235/236）（细胞信号，#2211，1:100）、骨钙素（Abcam，#ab93876，1:500）、CD31（Abcan，#ab28364，1:50）、VEGF（Proteintech Group，#19003-1-AP，1:200）、磷酸化-VEGFR2（Y1175）（Cell Signaling，#2478,1:100）的一级抗体和CXCR3（Santa Cruz Biotechnology，#sc-13951,1:50）在4点过夜 摄氏度。随后，我们在室温下使用与荧光结合的二级抗体1 h.我们计数了阳性染色的细胞或血管的数量（CD31⁺)每组小鼠每只股骨或胫骨的整个骨干骨膜或干骺端的四个随机视野，连续三个断面。我们计算了VEGF⁺成骨细胞/总成骨细胞（%）是指与骨钙素阳性细胞相比，用VEGF和骨钙素双重染色的细胞数，并用骨髓每面积CD31（和内粘蛋白（EMCN））阳性血管数确定微血管密度。现场使用Cxcl9 mRNA与地高辛标记探针进行杂交就地杂交试剂盒（Boster，#MK3237）。我们使用FluoView FV1000共焦显微镜（奥林巴斯）或奥林巴斯BX51显微镜对样品进行成像。

为了进行免疫细胞化学染色，我们在4 摄氏度。随后，我们在室温下使用与荧光缀合的第二抗体1 h，同时避免光线照射。FluoView FV1000共焦显微镜（Olympus）用于成像。

细胞

从新生小鼠颅骨中制备原代成骨细胞。简而言之，从小鼠（24 出生后h），用PBS冲洗并在新鲜制作的0.1中消化 毫克 毫升⁻¹37℃时α-最小必需Eagle's培养基中的II型胶原酶（Thermo Fisher Scientific，#17101015） 20°C 最小值；消化重复五次。消化后，将上清液合并并离心成颗粒细胞^41,42然后将细胞保存在补充有10%胎牛血清（Gibco）的α-MEM中，100 U型 毫升⁻¹青霉素和100 毫克 毫升⁻¹硫酸链霉素，37 °C，含5%CO2。60年汇合后 mm培养皿，用添加1%牛血清白蛋白的α-MEM（Gibco）代替培养基，培养16个细胞 收集CM前h。小鼠CXCL9抗体（研发系统，#AF-492-NA，2 微克 毫升⁻¹)，rMuMig/CXCL9（PrimeGene生物技术公司，编号221-09250 纳克 毫升⁻¹)，CXCR3拮抗剂NBI-7433（研发系统，#4528，1 μM）或小鼠重组VEGF₁₆₄（研发系统，#493-MV-025，10 纳克 毫升⁻¹)已添加到CM中，如图所示。

HUVEC购自美国型培养物收集中心，在含有低血清（2%胎牛血清）和EC生长补充剂（Promo Cell）的EC基础培养基2（EBM2）中培养。细胞被剥夺血清16 添加CM前h。

细胞增殖试验

HUVEC在EBM2培养基（0.1%胎牛血清，不含生长因子；美国Lonza）中缺乏血清16 h、 然后播种（200 μl，每个孔含有8000个细胞），放入共聚焦培养皿（生物成像仪，#100350）的孔中培养4个 h.然后用BrdU标记试剂（Invitrogen）处理细胞2 根据制造商的说明，用PBS清洗。用70%乙醇固定细胞25 min，然后染色进行免疫细胞化学分析。每组中的九个区域由两名对各组盲视的独立观察员进行计数。我们通过视觉和Image Pro Plus软件对BrdU阳性细胞和总细胞进行评分。

体外迁移分析

HUVEC被播种（1×10⁵1%明胶涂层24孔板（荷兰史基浦康宁）中的每孔细胞数。汇合细胞被剥夺血清16 h、 用无菌吸管尖端（200 μl黄色尖端）。用PBS清洗单层膜以去除漂浮细胞，并添加CM。在额外18次之后 h、 用数字倒置显微镜观察细胞向伤口的迁移。使用Image Pro Plus软件，在每个测试条件下的九个伤口中，伤口闭合程度是指初始伤口中迁移细胞覆盖的面积百分比。

体外试管形成试验

HUVEC缺血清16例 h，然后以每孔10000的密度在24孔板中种植生长因子缺失的Matrigel（BD Biosciences，NSW，Australia）。添加了CM，并对结果进行了量化6 小时后。用低倍镜（×10）拍摄含有凝胶中形成的管状结构的显微场。每个测试条件下检查了九个字段。在拍照之前，用4%的多聚甲醛固定细胞。使用Image Pro Plus软件量化试管面积。

骨髓上清液采集

处死2个月大的雄性小鼠（每组5只），通过切割胫骨两端暴露骨髓。然后将样品离心15次 3000时最小值 r.p.m.和4 °C以获得骨髓上清液，然后将其储存在−80 °C，直到ELISA分析。

ELISA分析

我们使用小鼠VEGF ELISA试剂盒（Elabscience Biotechnology，#E-EL-M0050）和小鼠CXCL9/MIG（Monokine induced by interferon-gamma）ELISA试剂箱（Elabscience，#E-EL-M0020）分别分析血清、骨髓上清和CM中的VEGF和CXCL9。我们根据制造商的说明进行了ELISA分析。

蛋白质印迹

我们用2%十二烷基硫酸钠溶解细胞 M尿素，10%甘油，10 mM Tris-HCl（pH 6.8），10 mM二硫苏糖醇和1 mM苯甲基磺酰氟。对裂解产物进行离心，通过SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳分离上清液，并将其印在硝化纤维素膜上（Bio-Rad Laboratories）。然后将膜与针对磷酸化S6K（T389）（细胞信号技术，#9234，1:1000）、S6K（圣克鲁斯生物技术，#sc-8418，1:2000）、磷酸化S6（S235/236）（细胞信息技术，#2211，1:1000，磷酸化-VEGFR2（Y1175）（Abclonal Technology，#AP0382，1:1000）、VEGFR2（Abclotal Technologies，#A7695，1:1000，phospho-Akt（Ser473）（Cell Signaling Technology，#4060，1:1000）、phospho-Src（Tyr416）（Cel Signaling-Technology，#1101:1000）、Cxcl9（R&D System，#AF-492-NA，1:2000）、Runx2（Bioworld Technology），#BS8734:1000），骨钙素（Santa Cruz Biotechnology，#sc-23790，1:2000，磷酸-STAT1（S727）（Abclone Technology，#AP0453，1:1000）、mTOR（（Cell Signaling Technology，#2983，1:1000）和STAT1（Proteintech Group，#10144-2-AP，1:1000）。然后通过增强化学发光（ECL Kit，Amersham Biosciences）对膜进行可视化。未截取的western blots扫描在补充图10a–k.

实时定量PCR和微阵列分析

使用TRIzol试剂（Life Technologies，#15596-018）从细胞颗粒中分离出总RNA，并进行逆转录（2.5 50μg/样品 μl反应体积），根据制造商的协议（Takara，#2680B）使用PrimeScript逆转录酶。体积为2μl的cDNA（相当于100 使用SYBR Premix Ex Taq（Takara，#RR420A）进行实时PCR。底漆血管内皮生长因子,Cxcl9公司和STAT1（状态1）具体如下：血管内皮生长因子正向，5′-CACGTCAGAGAGCAACATCA-3′，反向，5′-TCATTCCTCTATGTGCTGGCTTT-3′；Cxcl9公司正向、5′-GGAGTTCGAGACCTAGTG-3′和反向5′-GGGATTTGTGGATCGTGC-3′；STAT1（状态1）正向，5′-TCACAGTGGTTCGAGCTTCAG-3′，反向，5′-GCAAACGAGACATAGGCA-3′。

对于mRNA阵列分析，样品提交给上海生物技术公司，在Agilent-014868全鼠基因组芯片4x44K G4122F（探针名称版本）上进行杂交。将每个微阵列芯片与标记有Cy3的单个样品杂交。进行背景减影和归一化。最后，表达水平在对照组和Δ组之间差异至少三倍的mRNATsc1型选择成骨细胞(P（P）<0.05). 微阵列数据已以加入码存放在GEO数据库中{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE74781”，“term_id”：“74781“}}GSE74781型.

免疫共沉淀分析

重组小鼠Cxcl9（PrimeGene Bio-Tech，#221-09，50 纳克 毫升⁻¹)和血管内皮生长因子₁₆₄（研发系统，#493-MV-025，30 纳克 毫升⁻¹)在冰镇裂解缓冲液（40 mM HEPES（pH 7.4），2 mM乙二胺四乙酸二乙酯，10 mM焦磷酸盐，10 mM甘油磷酸、0.3%CHAPS和每25片不含EDTA的蛋白酶抑制剂（瑞士巴塞尔罗氏公司） ml）。然后将混合物与抗Cxcl9抗体（研发系统，#AF-492-NA，1:500）孵育2 4时为小时 °C，然后添加30 μl 50%蛋白G琼脂糖珠浆液，再加入1 h.然后用裂解缓冲液洗涤珠四次，转移到2×SDS样品缓冲液中，煮沸5 100时最小值 °C，并进行VEGF的western blot分析。

mTORC1的体外激酶检测

初级颅骨细胞在冰镇缓冲液（40 mM HEPES（pH 7.4），2 mM乙二胺四乙酸二乙酯，10 mM焦磷酸盐，10 mM甘油磷酸、0.3%CHAPS和每25片不含EDTA的蛋白酶抑制剂（瑞士巴塞尔罗氏公司） 毫升）。上清液与抗mTOR抗体孵育2 4时为小时 °C，然后添加30 μl 50%蛋白G琼脂糖珠浆液，再加入1 h.然后用裂解缓冲液清洗珠子四次，用激酶缓冲液清洗一次（25 mM HEPES（pH7.4），50 毫摩尔氯化钾，10 mM氯化镁₂和250 μM ATP）。单位为0.4 μg重组谷胱甘肽S公司-将带有转移酶标记的全长STAT1肽添加到30 μl激酶缓冲液。对30例患者进行激酶分析 30分钟 °C，通过添加2×SDS样品缓冲液终止，然后煮沸5 最小值。

结合分析

小鼠重组血管内皮生长因子的碘化₁₆₄根据制造商的指示，使用碘根（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）进行。The specific activities of the¹²⁵I–血管内皮生长因子₁₆₄大约10人⁵ 下午约。 纳克⁻¹。生长在24孔培养皿中的汇合HUVEC在结合之前用冰镇PBS清洗两次，并用指示浓度的¹²⁵I–血管内皮生长因子₁₆₄DMEM中的Cxcl9包含20 毫摩尔 我⁻¹HEPES（pH 7.4）和0.15%明胶 4时为小时 摄氏度。的非特定绑定¹²⁵I–血管内皮生长因子₁₆₄在1的存在下测定 微克 毫升⁻¹血管内皮生长因子₁₆₄在结合结束时，用0.5清洗细胞，并用0.5溶解细胞 M氢氧化钠。样品在γ计数器中计数（法国圣昆廷伊夫林）。特异性结合是通过从总结合中减去非特异性结合来确定的。

电泳迁移率变化分析

总共2个 将从初级颅骨细胞中提取的μg核蛋白与生物素标记的STAT1结合位点DNA探针在结合缓冲液（EMSA试剂盒；Thermo Scientific）中孵育30 在室温下最小。用于反应的探针含有Cxcl9公司启动子（γ-RE1位点），序列为5′-CCTTACTAAACTCC-3′。培养后，样品在三硼酸盐EDTA中的6%聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到尼龙膜上并通过紫外线交联固定在膜上。用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（EMSA试剂盒；Thermo Scientific）检测生物素标记探针。一个缺乏核提取物的探针被用作阴性对照。使用含有相同序列的超过200倍的未标记探针证实了所鉴定STAT3-DNA结合活性的特异性。对于超位移分析，1 μg STAT1抗体（Proteintech）与核提取物孵育30 添加生物素标记的DNA探针前的min。

siRNA敲除

我们瞬时转染细胞STAT1（状态1）根据制造商的说明，在Opti-MEM培养基（Invitrogen）中使用Lipofectamine RNAi MAX（Invit罗gen，Carlsbad，CA，USA）的siRNA。western blot检测转染效率。的顺序STAT1（状态1）siRNA如下：5′-AAGGAAAGCAAGCGTAATCT-3′（基因制药，中国上海）⁴³.

统计

所有结果均以平均值±标准差表示。使用Prism（GraphPad）确定曲线分析。使用未配对的双尾Student’st吨-测试。重要性级别设置为P（P）<0.05.

本研究得到了国家重点基础研究发展计划2013CB945203（X.B.）和2015CB55360（X.B..）的资助；国家自然科学基金31529002（X.B.）、81530070（X.B.）、81625015（X.B.）、U1301222（X.B.）、81301525（C.J.）和81672120（D.J.）。