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.2011年7月21日；2（7）：e180。
doi:10.1038/cddis.2011.63。

针对STAT1的短干扰RNA通过抑制炎症减轻顺铂诱导的大鼠耳毒性

T Kaur公司 1, D Mukherjea先生, K希恩, S贾乔, L P Rybak公司, V拉姆库马
附属公司

STAT1短干扰RNA通过抑制炎症减轻顺铂诱导的大鼠耳毒性

T Kaur公司等。 细胞死亡病. .

摘要

顺铂广泛用于治疗各种实体瘤。然而，这种药物会产生剂量限制性耳毒性和肾毒性，从而显著降低癌症患者的生活质量。虽然利尿可以减轻肾毒性，但目前还没有批准治疗听力损失的方法。先前的研究表明，活性氧和炎症是顺铂所致听力损失的主要原因。在本研究中，我们发现ROS通过激活信号转导子和转录激活物-1（STAT1）触发耳蜗的炎症过程。STAT1激活的激活依赖于通过NOX3 NADPH氧化酶产生的ROS，而通过siRNA的敲除可以减少STAT1的激活。此外，STAT1 siRNA可保护大鼠免受p53激活，减少细胞凋亡，减少OHC损伤，并保护听力。STAT1 siRNA可减弱炎症介质的增加，如TNF-α，其抑制可保护细胞免受顺铂介导的凋亡。最后，我们表明，经胸腺给药的依那西普（一种TNF-α拮抗剂）可以保护OHC损伤和顺铂诱导的听力损失。这些研究表明，通过抑制耳蜗中STAT1依赖性通路来控制炎症可以成为治疗顺铂耳毒性和提高癌症患者整体生活质量的有效途径。

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数字

图1
图1
顺铂激活UB/OC-1细胞和大鼠耳蜗中的STAT1。(一)UB/OC-1细胞用2.5 μ通过全细胞裂解物的western blotting测定不同时间段的M顺铂和STAT1激活。STAT1（p-STAT1/STAT1）的激活如下所示。(b条)用干扰siRNA或STAT1 siRNA转染UB/OC-1细胞48小时 顺铂治疗前h 45 分钟。制备细胞裂解物并用于血清的western blot研究727p-STAT1。(c（c）)UB/OC-1细胞与编码STAT1荧光素酶的质粒载体以及打乱或STAT1 siRNA共同转染 h后使用载体或顺铂（2.5 μM） 用于8 h.制备裂解液并用于测定荧光素酶活性。表达质粒的共转染雷尼利亚荧光素酶使每个孔中的荧光素酶活性正常化。(d日)对从接受载体或顺铂（11）治疗的大鼠分离的耳蜗切片进行免疫标记研究 mg/kg，i.p.）72 经鼓室给药scramble或STAT1 siRNA后h（0.9 μg） 。序号727p-STAT1免疫标记用绿色荧光表示，而细胞核用DAPI染色表示。在OHC、SVA、SG细胞和SL中观察到免疫荧光增强。右下面板中显示的比例尺测量50 μ米(e（电子）)从面板放大OHC视图d日箭头表示三行OHC。右下面板中显示的比例尺为10 μm.数据表示为平均值±S。E.M.星号(*)和(**)分别表示与溶媒/加扰剂组和加扰剂+顺铂治疗组的统计显著性差异(P（P）<0.05,n个=3)
图2
图2
活性氧对顺铂介导的STAT1磷酸化至关重要。(一)UB/OC-1细胞用载体或DPI（10 μM） 然后顺铂治疗45例 通过western blotting测定STAT1激活的最小值。H（H）2O（运行）2(100 μM） 治疗作为ROS生成的阳性对照。(b条)用干扰或NOX3 siRNA转染细胞（5 nM）用于48 h、 用新鲜培养基替换培养基，细胞暴露于载体或顺铂（2.5 μM） 用于45 NOX3 siRNA在不改变基础STAT1水平的情况下，通过顺铂减弱STAT1的激活。(c（c）)用打乱或NOX3 siRNA转染UB/OC-1细胞（5 nM）48 h、 其次是顺铂（2.5 μM） 再治疗24个 h.通过实时RT-PCR测量NOX3 mRNA，显示顺铂使其增加2.7±0.2倍，NOX3 siRNA+顺铂组降低至0.3±0.1倍。单独添加NOX3 siRNA可将NOX3 mRNA降低至0.3±0.1倍。(d日)用打乱或NOX3 siRNA（5 nM）用于48 h、 然后用顺铂治疗（2.5 μM） 用于15 分钟，然后用5 μ月H2DCFDA染料15 通过共焦显微镜观察min和ROS生成（绿色荧光）。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。数据以平均值±S表示。E.M.星号(*)和(**)分别表示与溶媒/加扰剂组和加扰剂+顺铂治疗组的统计显著性差异(P（P）<0.05,n个=4). 所示比例尺为10 μ米
图3
图3
STAT1 siRNA减少顺铂介导的UB/OC-1细胞凋亡。(一)用打乱或STAT1 siRNA转染UB/OC-1细胞48 h、 其次是顺铂（20 μM） 额外24小时 h.通过流式细胞术测量Annexin阳性细胞和Annexin+碘化丙啶阳性细胞（分别为右下象限和右上象限）的百分比来确定细胞凋亡。(b条)小组中确定的每种治疗的凋亡细胞百分比一并绘制为平均值±S。E.M.公司(*P（P）<0.05,n个=3). (c（c）和d日)用打乱或STAT1 siRNA转染UB/OC-1细胞48 h、 其次是顺铂（20 μM） 额外24小时 小时(c（c）)细胞用于测定p53、p-STAT1、STAT1和β-肌动蛋白（用于标准化）。(d日)顺铂增加了Bax和裂解caspase-3的水平，这两种酶被STAT1 siRNA减弱。所示的数字代表了四个显示类似结果的类似实验。数据表示为平均值±S。E.M.星号(*)和(**)分别表示与干扰siRNA组或顺铂治疗组的统计显著差异(P（P）<0.05)
图4
图4
顺铂诱导的大鼠听力损失依赖于STAT1的激活。(一)记录顺铂治疗的Wistar大鼠的ABR阈值（11 mg/kg，i.p.）72 48小时后 h反义给药打乱或STAT1 siRNA（0.9 μg） 。(b条)对耳蜗进行了扫描电子显微镜研究。典型的图像显示顺铂对OHC（白色箭头）的显著损伤，STAT1 siRNA不存在顺铂(c（c）)扫描电子显微照片的定量分析。数据表示为平均值±S。E.M.星号(*)和(**)显示与craft或craft+顺铂治疗组的统计显著性差异(P（P）<0.05,n个=6)
图5
图5
顺铂通过STAT1依赖途径增加促炎介质的表达和转录。(一–c（c）)用打乱或STAT1 siRNA转染UB/OC-1细胞48 h、 其次是顺铂（2.5 μM） 24小时 h.然后将细胞裂解物用于蛋白质印迹研究，以确定TNF的水平-α(一)、iNOS(b条)和COX2(c（c）).β-肌动蛋白水平用于归一化。(d日)iNOS、COX2和TNF的mRNA水平-α通过实时RT-PCR在UB/OC-1培养物中测定一–c（c）数据表示为平均值±S。E.M.星号(*)和(**)分别表示与加扰和加扰+顺铂治疗组的统计学显著差异(P（P）<0.05,n个=4)
图6
图6
顺铂增加大鼠耳蜗炎症。(一)大鼠通过经胸腺注射Scramb或STAT1 siRNA，然后再注射载体或顺铂（11 毫克/千克，静脉注射）48 小时后。老鼠被杀72只 给药后h。切除耳蜗并进行免疫组织化学处理。用CD14和TNF共同标记耳蜗的中极切片-α抗体，然后是荧光素（绿色）或TRITC（红色）标记的二级抗体。顺铂增加CD14和TNF-α用干扰siRNA处理耳蜗的免疫反应。然而，用STAT1 siRNA处理的耳蜗免疫标记的增加减弱。合并的面板（黄色）表明CD14和TNF的共定位-α。比例尺（右下面板）指示50 μ米(b条)专题小组中OHC的放大视图一箭头表示三行OHC。比例尺指示10 μ米
图7
图7
炎症途径在介导顺铂诱导的听力损失中的作用。(一)用预先免疫血清或抗肿瘤坏死因子单克隆抗体预处理UB/OC-1细胞-α，然后添加TNF-α.收集细胞24 h后，通过流式细胞仪Annexin-V–FITC染色测定细胞凋亡率。TNF公司-α显著增加(P（P）<0.05,n个=4）凋亡，这被抗肿瘤坏死因子单克隆抗体所消除-α. (b条)从面板中处理的细胞制备的裂解液一western blotting显示Bax、裂解caspase-9和裂解caspase-3水平增加。印迹归一化为β-肌动蛋白。(c（c）)用溶媒（对照）、免疫前血清或TNF预处理UB/OC-1细胞-α抗体，然后给药载体或顺铂（20 μM） ●●●●。顺铂使这些组中凋亡细胞的百分比增加了24 h、 TNF显著降低了-α单克隆抗体(P（P）<0.05,n个=4). (d日)分别用iNOS或COX-2抑制剂-NAME或SC-791处理UB/OC-1细胞，可部分抑制顺铂诱导的凋亡(P（P）<0.05,n个=4). 数据表示为平均值±S。E.M.星号(*)和(**)表明分别与载体和顺铂处理的细胞有统计学上的显著差异
图8
图8
抑制TNF-α依那西普抑制顺铂引起的听力损失。(一)大鼠通过鼓室注射给予载体或依那西普，然后给予载体或顺铂30 分钟后。72年前后记录这些大鼠的ABR阈值 顺铂给药h（11 mg/kg，静脉注射）。依那西普显著降低顺铂诱导的ABR阈值升高(P（P）<0.05,n个=5). (b条)对从按上述方法处理的大鼠中分离的耳蜗进行扫描电子显微镜研究。典型的图像显示顺铂对OHC（白色箭头）的损伤，依那西普可以阻止这种损伤。(c（c）)扫描电子显微图像的定量分析。数据表示为平均值±S。E.M.星号(*)和(**)分别表示与载体或顺铂治疗组的统计显著性差异(P（P）<0.05,n个=5)
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