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癌症研究。作者手稿；PMC 2012年3月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
癌症研究2011年3月1日；71(5): 1573–1583.
doi（操作界面）：10.1158/0008-5472.CAN-10-3126
预防性维修识别码：项目经理3077087
尼姆斯：美国国家卫生研究院264534
采购管理信息：21363918

VEGF生成、血管生成和血管再生的减少有助于双mTORC1/mTORC2抑制剂的抗肿瘤特性

贝弗利·L·法尔肯,1,* 沙伦·巴尔,2,* Prafulla C.Gokhale公司,2 周杰玲（Jeyling Chou）,1 詹妮弗·福格蒂,1 菲利普·德佩尔,1 马克·米格拉雷斯,2 大卫·M·爱泼斯坦,2和唐纳德·麦克唐纳1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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摘要

雷帕霉素（mTOR）通路的哺乳动物靶点在癌症病理生理学中有着广泛的联系。mTOR激酶复合物mTORC1和mTORC2的双重抑制可降低体内肿瘤移植生长和体外VEGF分泌，但这两种作用之间的关系尚不清楚。在本研究中，我们检测了mTORC1/2双重抑制对VEGF生成、肿瘤血管生成、血管退化和血管再生的影响，并将双重抑制的效果与单独抑制mTORC1的效果进行了比较。ATP竞争性抑制剂OSI-027和OXA-01在体外和体内靶向mTORC1和mTORC2信号传导，而雷帕霉素只抑制mTORC1信号传导。OXA-01降低了肿瘤中VEGF的产生，其方式与血管发芽减少但几乎没有血管消退有关。相反，雷帕霉素对肿瘤产生VEGF的影响较小。用选择性VEGFR抑制剂OSI-930治疗可减少血管萌芽，并导致肿瘤血管实质性退化。然而，在OSI-930停药后，OXA-01治疗可减缓肿瘤再生。mTORC1和mTORC2双抑制剂与VEGFR2抑制剂联合使用比单独使用两种抑制剂更能降低肿瘤生长。总之，这些结果表明，mTORC1/2的双重抑制可发挥抗血管生成和抗肿瘤作用，当与VEGFR拮抗剂联合使用时，效果更为有效。

关键词：mTOR、VEGF、血管生成、血管再生、RIP-Tag2肿瘤

介绍

哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它整合了多种信号通路，包括细胞生长和存活。mTOR存在于两种复合物中，即mTORC1和mTORC2。通过PI3K和Akt激活mTORC1通过调节翻译、核糖体生物生成、自噬和代谢来控制细胞生长(1). 而mTORC2磷酸化Akt、SGK1和PKC以控制细胞存活和细胞骨架组织(2).

许多mTOR激活物和效应物在癌症中过度表达或突变(三). 雷帕霉素及其类似物（rapalogs）是mTORC1的变构抑制剂，对某些肿瘤具有临床疗效(三,4). 然而，mTORC1抑制通过p70S6K-IRS1负反馈激活mTORC2信号，从而限制了rapalogs的疗效(5–7). 最近的证据表明，通过抑制mTORC1和mTORC2，可以获得更广泛和更强大的抗癌作用(8–11). 此外，mTOR催化位点抑制剂对mTORC1活性的抑制作用更强。与mTORC2对Akt的调节相一致，这些研究表明，与仅mTORC1相比，通过抑制mTORC 1和mTORC 2，Akt信号和肿瘤细胞增殖的减少更大(8–11). mTORC1/mTORC2抑制也会降低HIF1-alpha表达、血管内皮生长因子（VEGF）分泌和肿瘤血管生成(10,11).

VEGF抑制剂减少血管生成，导致肿瘤血管退化，减缓肿瘤生长，并可能改善药物输送(12–15). 尽管VEGF在肿瘤血管生成和生长中的作用已被广泛证实(16)目前的方法阻断VEGF配体或受体。关于减少VEGF生成对肿瘤血管系统的影响，目前知之甚少。虽然血管内皮生长因子抑制剂可以破坏多达80%的肿瘤血管，但大多数肿瘤血管在治疗结束后会重新生长(17). 血管再生可能是由于VEGF的持续生成，因为基质金属蛋白酶或IV型胶原隐匿位点的抑制不会减缓血管重建(17).

先前的研究检测了mTORC1/mTORC2对体外VEGF分泌的抑制作用(11)或雷帕霉素对体内肿瘤血管的作用(10,18,19). 然而，mTORC1/mTORC2对肿瘤血管和VEGF生成的抑制作用体内尚未进行研究。我们假设，与单独抑制mTORC1相比，双mTORC2抑制能更好地抑制Akt信号和VEGF的生成，对肿瘤细胞和肿瘤血管的影响更大。为了研究这一点，我们使用了小分子ATP竞争抑制剂OXA-01和OSI-027。这些药物选择性地抑制mTORC1和mTORC2。我们比较了这些分子与雷帕霉素（一种变构mTORC1抑制剂）的作用。此外，我们确定mTORC1/mTORC2和VEGFR联合抑制是否比单独使用两种抑制剂具有更大的抗肿瘤作用。我们的研究结果表明，mTORC1/mTORC2抑制通过两种机制影响肿瘤：第一，对肿瘤细胞的直接作用降低了增殖，增加了凋亡；第二，抗血管作用比单独抑制mTORC1后更显著。当双mTORC1/mTORC2抑制与VEGFR抑制相结合时，对肿瘤细胞增殖和凋亡以及肿瘤生长的影响更大。总之，这些结果支持将mTORC1/mTORC2抑制剂用作单一疗法、与抗血管生成剂交替使用的单一疗法或与抗血管形成剂同时使用的联合疗法。

材料和方法

生物化学和细胞选择性测定

mTORC1和mTORC2的抑制作用是使用在1mM ATP下从HeLa裂解物中免疫沉淀的天然酶复合物来测定的，如所述(20). HTRF分析用于PI3K分析（Millipore，MA，USA），DNA-PK活性使用人类重组p53蛋白（Axxora，CA，USA）和磷酸化p53（S15）抗体（Cell Signaling Technologies，MA，US）进行测量。两种分析均使用100mM ATP。对额外激酶组的OXA-01和OSI-027选择性进行了评估，如补充方法.

细胞培养

按照指示培养ATCC中的H292细胞。将T.Frederick博士慷慨赠送的Ovcar-5细胞培养在RPMI加10%血清和1%L-谷氨酰胺中。

体内抗肿瘤疗效研究

对于异种移植模型，收集细胞，将皮下埋植于nu/nu CD-1小鼠的右侧，并按所述分析肿瘤生长(21,22). 肿瘤生长抑制和回归计算包括在补充方法.收集肿瘤样本并在指定时间点进行快速冷冻。通过在裂解缓冲液（1%Triton X-100，10%甘油，50 mM HEPES（pH 7.4），150 mM NaCl，1.5 mM MgCl）中均质（Precellys-24均质器；MO Bio Laboratories，Inc.，CA）制备肿瘤裂解物2、1 mM乙二胺四乙酸、10 mM氟化钠和1 mM钠三VO（旁白）4蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Sigma，MO））。使用MultiGauge软件（FujiFilm）通过Western blot定量磷酸化和总4E-BP1、Akt或S6。

RIP-Tag2小鼠研究

如前所述使用RIP-Tag2小鼠(13,17,23). 在9-10周龄时，RIP-Tag2小鼠用载体（Labrifil或水）治疗长达7天；75 mg/kg OXA-01 BID灌胃；200 mg/kg OSI-930 QD灌胃；或每天一次20mg/kg雷帕霉素，通过ip注射。对于血管再生研究，10周龄RIP-Tag2小鼠接受以下治疗：（a）载体治疗11天；（b） OSI-930，持续7天；（c） OSI-930治疗7天，然后使用车辆治疗4天；（d） OSI-930治疗7天，OXA-01治疗4天；（e） OSI-930治疗7天，雷帕霉素治疗4天。用于药物联合研究的小鼠，OSI-930的剂量为100 mg/kg，OXA-01的剂量为100mg/kg，雷帕霉素的剂量为20mg/kg，每天一次性服用4天。在治疗期间，每天监测体重。如果小鼠减重超过初始体重的10%，则给予补充液体。

免疫组织化学和蛋白质阵列

治疗后，通过血管灌注固定RIP-Tag2小鼠，对肿瘤进行免疫组织化学处理，并对60-80μm切片进行染色(13,24). 内皮细胞、基底膜、VEGF、红细胞、增殖和凋亡细胞以及磷酸化的S6K、Akt和4E-BP1通过免疫组织化学方法进行鉴定，如补充方法根据制造商的指示，使用小鼠血管生成阵列（R&D Systems）对肿瘤裂解物中的VEGF进行检测。

显微镜和图像分析

用蔡司Axiophot荧光显微镜和LSM510激光扫描共聚焦显微镜检查RIP-Tag2胰腺染色切片。使用ImageJ软件根据荧光图像计算面积密度(25)如前所述，使用经验确定的30–50的阈值(13,17,23). 荧光强度如前所述进行测定(17)并在补充方法如前所述，对内皮芽进行检查(24,26).

统计分析

以SEM表示的值反映了每组3-8只小鼠。通过方差分析和Fisher-PLSD事后检验确定差异的显著性。在体内疗效研究中，使用了秩方差分析和Dunnett的比较。P值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

OXA-01和OSI-027的选择性

本研究的目的是比较mTORC1/mTORC2对VEGF生成、肿瘤血管和肿瘤生长的双重抑制与雷帕霉素单独抑制mTORC1。为了研究mTORC1/mTORC2的抑制作用，我们使用了mTOR激酶的选择性ATP竞争性抑制剂OXA-01和OSI-027。因为这些化合物抑制了mTOR激酶的活性，所以每个化合物都以mTORC1和mTORC2为靶点。IC50OXA-01和OSI-027分别为11 nM和4 nM(图1). 用抗猛禽抗体（mTORC1活性）或抗蓖麻毒素（mTORC2活性）进行免疫沉淀表明，这些化合物能有效抑制这两种mTOR复合物。在生化分析中，相对于其他PIKK相关激酶，mTOR的选择性超过100倍。我们还检测了OXA-01和OSI-027在细胞检测中的特异性。OXA-01和OSI-027通过IC抑制磷酸化-4E-BP1的mTOR信号50分别为1.1μM和1μM(图1). 观察到对来自酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸家族的37种其他蛋白激酶的选择性超过100倍（数据未显示）。在评估OXA-01和OSI-027对98种纯化蛋白激酶的活性时，这些化合物完全抑制mTOR。虽然只有3种激酶被OXA-01和OSI-027抑制超过90%：PI3Kδ、PI3Kγ和RET。JNK3和MEK2被OXA-01抑制，而PIP5Kγ被OSI-026显著抑制（数据未显示）。OSI-027和OXA-01对PDK1均无效。

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mTORC1/mTORC2抑制剂、OXA-01和OSI-027的选择性

一个所示为OXA-01和OSI-027的结构。B。体外IC50显示了一组具有代表性的激酶的值。C、。在使用磷酸化激酶或下游效应物作为活性测量的基于细胞的分析中进一步证明了选择性。

OXA-01、OSI-027和雷帕霉素对mTORC1/mTORC2信号转导的比较

比较了OXA-01、OSI-027和雷帕霉素对mTORC1和mTORC2信号传导的影响在体外.OXA-01或OSI-027，但不是雷帕霉素，剂量依赖性地减弱mTORC2特异性Ser473位点和Akt下游底物PRAS40的Akt磷酸化(补充图1A). OXA-01和OSI-027抑制Ser37/46处的4E-BP1磷酸化，这通常是雷帕霉素不敏感的。雷帕霉素未能在这些位点抑制Akt、PRAS40或4E-BP1磷酸化，并诱导磷酸化Akt。mTORC1/mTORC2抑制剂和雷帕霉素均抑制S6激酶及其底物S6，这与mTORC1对这些效应器的调节一致。量化OXA-01、OSI-027和雷帕霉素对Akt、4E-BP1和S6K磷酸化的影响(补充图1B).

OSI-027、OXA-01和雷帕霉素对mTORC1/mTORC2信号转导和肿瘤生长的体内影响

我们假设，与雷帕霉素对mTORC1的抑制相比，mTORC2的抑制更能减缓肿瘤生长。雷帕霉素对GEO大肠异种移植物生长的影响(图2A)或OSI-027(图2B)持续12天与我们的体外实验一致。雷帕霉素（20 mg/kg）处理抑制了磷酸-S6和磷酸-4E-BP1，而Akt磷酸化增加了29%(图2A). 相反，OSI-027（65 mg/kg）抑制了mTORC1和mTORC2效应器。2小时后，观察到4E-BP1、Akt和S6磷酸化降低，S6和Akt的抑制持续24小时(图2B). OSI-027的血浆药物浓度与mTORC1和mTORC2信号的这些影响呈负相关，OXA-01的药代动力学曲线相似（数据未显示）。OSI-027的中位血浆药物浓度在2小时为21.3μM，在8小时为14.9μM。OXA-01的中位血浆浓度在1小时时为25.6μM，在8小时时为13.2μM（数据未显示）。与它们对mTORC1和mTORC2的抑制作用一致，OSI-027(图2C)和OXA-01(图2D)比雷帕霉素更能减缓肿瘤生长。

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OSI-027、OXA-01和雷帕霉素对肿瘤生长和药效学的影响

答：。在雷帕霉素（20mg/kg）或载体治疗12天后的2、8和24小时，测量GEO肿瘤以及对mTOR信号的影响。显示了4E-BP1 37/46（浅灰色条）、Akt 473（黑色条）和S6 235/236（深灰色条）的下游效应器磷酸化（n=2）。B。用OSI-027（65mg/kg）或载瘤剂治疗携带GEO异种移植物的小鼠12天，并在第2、8和24小时收集肿瘤。mTOR信号的磷酸化如图所示（n=2）。C–D。用OSI-027或雷帕霉素治疗携带GEO异种移植瘤的小鼠(C）或OXA-01或雷帕霉素（D）肿瘤体积随时间变化。

进一步比较mTORC1/mTORC2抑制与mTORC1抑制在RIP-Tag2胰腺神经内分泌肿瘤中的作用。与早期的观察结果类似，OXA-01降低了Akt和4E-BP1磷酸化，而雷帕霉素介导的两种效应物抑制均未观察到(图3A、B). 相比之下，与对照组相比，OXA-01和雷帕霉素处理均抑制了磷酸S6K(补充图2). 正如异种移植模型中肿瘤生长减少所表明的那样，OXA-01治疗降低了由磷甾酮H3决定的细胞增殖(图3C)活化的caspase-3检测细胞凋亡增加(图3D).

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mTOR对RIP-Tag2肿瘤下游信号传导、增殖和凋亡的抑制

答：。载体、OXA-01或雷帕霉素治疗7天后，RIP-Tag2肿瘤中肿瘤血管（CD31；绿色）和磷酸化Akt（红色）的共焦图像。B。治疗后RIP-Tag2肿瘤的荧光图像染色肿瘤血管（CD31；绿色）和磷酸化-4E-BP1。C、。载体、OXA-01或雷帕霉素治疗7天后，RIP-Tag2肿瘤的磷酸组蛋白-H3（PHH3）染色和定量。D。治疗7天后，RIP-Tag2肿瘤中的凋亡细胞被活化的caspase-3染色。D中的比例尺表示A和B中的25μm；C组和D组为100μm。与所有其他组相比，P<0.05。

OXA-01和雷帕霉素对RIP-Tag2肿瘤VEGF的影响

残基T37、T46、S65和T70处4E-BP1磷酸化降低降低cap依赖性蛋白翻译(27). 由于OXA-01和OSI-027抑制4E-BP1上的雷帕霉素抗性位点，我们假设OXA-01治疗比雷帕霉素更能减少VEGF的产生。RIP-Tag2肿瘤具有高VEGF表达，血管系统对VEGF抑制敏感(13)，使该模型适用于评估mTOR抑制对肿瘤血管中VEGF生成和下游变化的影响。用载体治疗7天后，肿瘤细胞和肿瘤血管的VEGF免疫反应强烈且大致相等(图4A-B). 肿瘤血管中的VEGF染色有弥散成分和点状成分。在OXA-01治疗7天后，肿瘤细胞和血管中的VEGF免疫荧光明显减少，但肿瘤细胞的减少更大，血管染色的持续模式证明了这一点（图A-B）。雷帕霉素治疗后，VEGF染色略低于基线水平，肿瘤细胞中VEGF的减少程度高于血管(图4A–B). OXA-01治疗1、4或7天后，整个肿瘤的VEGF荧光降低了12%、48%和45%，雷帕霉素治疗7天后仅降低了21%(图4C，左）。与肿瘤细胞相关的VEGF荧光强度在OXA-01治疗7天后降低65%，而雷帕霉素治疗后仅降低34%。OXA-01后与肿瘤血管相关的VEGF荧光降低了48%，而雷帕霉素后仅降低了20%(图4C，右侧）。

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mTORC1/mTORC2抑制的VEGF免疫反应

答：。用载体、OXA-01或雷帕霉素治疗7天后，RIP-Tag2肿瘤的荧光图像进行VEGF染色。B。治疗后RIP-Tag2肿瘤血管（CD31；绿色）和相关VEGF（红色）的高倍共聚焦图像。C、。量化整个肿瘤（左）和肿瘤细胞与肿瘤血管内的VEGF荧光强度（右）。D。抗体阵列检测载体、OXA-01或雷帕霉素治疗的RIP-Tag2肿瘤中VEGF的像素密度。B中的比例尺表示A中的100μm；6μm，B.*与车辆相比P<0.05†与OXA-01相比，P<0.05。

用多重抗体阵列检测RIP-Tag2肿瘤中VEGF的表达。密度分析显示OXA-01后VEGF-A减少72%，但雷帕霉素后无明显减少(图4D). VEGF-B的表达在两种治疗中都没有变化（数据未显示）。免疫组织化学法检测VEGF减少的差异(图4C)和免疫沉淀(图4D)可能反映了检测的敏感性，但两种检测均显示OXA-01后VEGF明显低于雷帕霉素后。

OXA-01、雷帕霉素和OSI-930对肿瘤血管的影响

因为VEGF对肿瘤血管生成很重要，我们确定了OXA-01或雷帕霉素后VEGF的减少是否会减少RIP-Tag2肿瘤血管，并将其与VEGFR酪氨酸激酶抑制剂OSI-930进行了比较(28). CD31-阳性肿瘤血管在未经治疗的RIP-Tag2肿瘤中丰富(图5A). OXA-01治疗7天后，肿瘤血管略有减少。雷帕霉素并没有明显减少肿瘤血管，但OSI-930持续7天与肿瘤血管大量减少相关。OXA-01后，肿瘤血管在第1、2或4天没有明显减少，但在第7天与基线相比减少了23%。雷帕霉素治疗后肿瘤血管没有明显减少，但OSI-930治疗7天后肿瘤血管减少了61%(图5B). 肿瘤中VEGF信号抑制后，基底膜袖套空可作为血管退行的指示(17,26). 载药、OXA-01或雷帕霉素治疗后，基底膜套不明显，但OSI-930治疗7天后，基底膜套筒数量众多(图5C). 与未经治疗的肿瘤相比，OXA-01后，血管芽数量减少了54%，雷帕霉素后减少了21%，OSI-930后减少了61%，这是肿瘤血管生成的一个指标(图5D).

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mTOR抑制对肿瘤血管的影响

答：。治疗7天后的RIP-Tag2肿瘤血管（CD31；绿色）。B。OXA-01治疗对CD31区域密度的时间进程量化（左），以及7天治疗与载体、OXA-01、雷帕霉素（Rapa）和OSI-930的比较（右）。C、。治疗7天后RIP-Tag2肿瘤血管（CD31；绿色）和基底膜（IV型胶原；红色）的共焦图像。D。治疗7天后肿瘤血管萌芽的共焦图像和量化。D中的比例尺表示A中的100μm；50μm（单位：C）；直径12μm，与车辆相比P<0.05†与OXA-01相比，P<0.05与雷帕霉素相比，P<0.05。

OXA-01和雷帕霉素对血管再生的影响

VEGF抑制会导致肿瘤血管退化，但治疗结束后血管会迅速再生(17). 由于OXA-01降低了VEGF和血管萌芽，我们询问OXA-01或雷帕霉素是否可以在OSI-930停止VEGFR抑制后阻止血管再生。RIP-Tag2小鼠用OSI-930治疗7天，然后用载体、OXA-01或雷帕霉素治疗4天。之所以选择4天的时间点，是因为在OXA-01治疗4天后，VEGF显著减少，但肿瘤血管没有改变(图4C和​和5B）。5亿). OSI-930治疗7天，肿瘤血管减少了63%，与我们之前的观察结果一致。OSI-930停用四天后，用载体治疗的肿瘤血管密度仅下降18%。OSI-930停药后用OXA-01治疗4天的肿瘤，肿瘤血管减少40%，但用雷帕霉素治疗的肿瘤相当于用车辆治疗的对照组（减少15%）(图6A). 然而，在OSI-930停药后用OXA-01治疗1天的肿瘤，肿瘤血管再生没有明显减少，这与我们的发现相吻合，即OXA-011治疗1天不足以降低VEGF（数据未显示）。

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VEGFR抑制停止后mTOR抑制的效果

答：。显示了肿瘤血管（CD31；绿色）的共焦图像和CD31区域密度的量化。B。红细胞标志物TER-119（红色）的共焦图像和量化。B中的比例尺表示A和B中的100μm。与车辆相比，P<0.05。†与OSI-930相比P<0.05与OSI-930 7d、Vehicle 4d相比，P<0.05。§P<0.05 vs.OSI-930 7d，OXA-01 4d。

因为VEGF促进肿瘤血管生成和血管渗漏，所以我们询问OXA-01或雷帕霉素降低VEGF是否会影响红细胞标记物TER-119评估的肿瘤内出血。OSI-930治疗7天后，RIP-Tag2肿瘤中TER-119免疫反应降低72%，表明出血减少(图6B). 然而，停止OSI-930后4天，TER-119水平在基线水平的28%以内。相反，在OSI-930停药后用OXA-01或雷帕霉素治疗的肿瘤中，TER-119水平比基线水平低50%或48%。

mTORC1/2抑制联合VEGFR抑制的效果

我们假设，通过OSI-930靶向肿瘤血管和OXA-01靶向肿瘤细胞的加性效应，OSI-930+OXA-01联合使用比单独使用任何一种抑制剂都更能降低肿瘤生长。为了评估这一点，我们检测了OSI-930加OXA-01或雷帕霉素对增殖（磷酸化-甾酮H3）和凋亡（活化caspase-3）的影响。与OSI-930和雷帕霉素相比，OSI-930+OXA-01降低了磷甾酮H3(图7A). 此外，OSI-930与OXA-01联合使用时，激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3增加了700%，但雷帕霉素与OSI-930(图7B).

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VEGFR2联合mTORC1/2抑制剂的抗肿瘤作用

磷酸-硫酮H3的共聚焦图像和定量(一个)并激活胱天蛋白酶-3(B类)如图所示。H292肺癌异种移植瘤的生长（C）和Ovcar-5卵巢癌异种移植物（D）使用载体、舒尼替尼（40 mg/kg）、OSI-027（50 mg/kg）或舒尼替布和OSI-027.的组合进行治疗。B中的比例尺表示A和B中的100μm*P（P）与车辆相比<0.05†P（P）<0.05 vs.OSI-930+OXA-01P（P）与所有其他治疗组相比，<0.05。

RIP-Tag2模型有助于评估肿瘤血管系统，但为测量肿瘤生长动力学提供了一个具有挑战性的平台。为了证实VEGF抑制联合mTORC1/mTORC2抑制的效果，我们使用了人类肿瘤异种移植模型。由于VEGF抑制剂与mTOR催化位点抑制剂联合使用可能是临床试验的一种选择，我们将舒尼替尼（一种经批准用于临床的多靶向VEGFR2抑制剂）与OSI-027一起用于临床试验。舒尼替尼与OSI-930对VEGFR2具有相似的选择性和等效效力。OSI-930和舒尼替尼都有生化IC50对于9 nM的VEGFR2(28–30). 此外，OXA-01和OSI-930在长期治疗的啮齿动物模型中耐受性不好，但OSI-027和舒尼替尼联合用药未发现毒性。这个体内OSI-027联合舒尼替尼对H292人肺和Ovcar-5人卵巢异种移植瘤的疗效进行了测试。用OSI-027（50 mg/kg）治疗21天的H292肿瘤在治疗期间（TGI）的肿瘤生长抑制中位数为61%。舒尼替尼（40 mg/kg）持续21天的中位TGI为47%。然而，OSI-027与舒尼替尼联合使用的中位TGI为100%，肿瘤最大消退为59%(图7C)，与单独使用这两种药物相比，具有显著的统计学意义。使用OSI-027或舒尼替尼治疗的Ovcar-5异种移植瘤的中位TGI分别为55%和68%。使用舒尼替尼的OSI-027的中位TGI明显好于100%，肿瘤最大消退率为38%。

讨论

本研究检测了双mTORC1/mTORC2抑制与mTORC1抑制对肿瘤细胞和肿瘤血管的差异作用。与之前的报告一致，我们发现与载体或雷帕霉素治疗相比，mTORC1和mTORC2抑制降低了肿瘤细胞增殖，增加了细胞凋亡，减少了p-S6K、p-Akt和p-4E-BP1信号，并降低了肿瘤生长(8–11). 因此，与雷帕霉素相比，OSI-027或OXA-01对mTORC1/mTORC2的抑制能更好地控制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡。mTORC1和mTORC2的双重抑制也比mTORC抑制具有更大的抗血管生成作用。与雷帕霉素相比，OXA-01降低RIP-Tag2肿瘤中VEGF的生成。VEGF生成减少与肿瘤血管生成减少有关，但与肿瘤血管退化无关。OXA-01还减少了OSI-930停止抑制VEGFR2后的血管再生。最后，将VEGFR抑制与mTORC1/mTORC2抑制相结合，可降低肿瘤细胞增殖，刺激肿瘤细胞凋亡，并降低肿瘤生长。总之，这些结果为mTORC1和mTORC2抑制剂的临床开发提供了支持，可作为单一药物，与抗血管生成治疗药物同时使用，或与抗血管形成治疗药物交替插入。

Rapalogs对某些肿瘤有效，但反馈激活可能会限制临床用途(7,31). 我们推断，同时抑制mTORC1和mTORC2比单独抑制mTORC效果更好。在这些研究中，我们使用雷帕霉素作为mTORC1的选择性变构抑制剂。虽然拉帕洛斯（依维莫司和替米罗莫司）是更常用的癌症治疗药物，但这些药物在机理上与雷帕霉素相似，雷帕霉素是一种特征鲜明的临床前工具化合物。与雷帕霉素相比，我们发现用OXA-01或OSI-027抑制mTORC1/mTORC2后，下游信号效应器减少更多，体内抗肿瘤效果更强。肿瘤生长的减少可能是由于肿瘤细胞增殖的减少，但凋亡的增加可能有助于这种作用。这些结果与mTORC1/mTORC2抑制后细胞增殖的更大减少一致(8–11)以及细胞系亚群中细胞凋亡的增加(11).

虽然雷帕霉素抑制mTORC1，但经过长期治疗，mTORC2信号在选择的细胞系中减少，可能是通过耗尽Rictor复合体中的mTOR(32). 然而，在本研究中，雷帕霉素体内治疗后，未观察到对4E-BP1（37/46）的mTORC2效应物Akt或雷帕霉素敏感性位点的抑制。此外，在这些研究中，使用了雷帕霉素的最大耐受剂量（20 mg/kg），这远远高于人类相关的临床相关剂量(33).

OXA-01治疗RIP-Tag2肿瘤降低了VEGF含量和肿瘤血管生长。先前的体外研究表明，雷帕霉素或双mTORC1/mTORC2抑制剂可降低VEGF分泌(11)表明VEGF的生成依赖于mTORC1。在我们的体内研究表明，雷帕霉素适度降低了VEGF，而OXA-01则实现了更大的降低。VEGF的生成由cap依赖和独立翻译控制(34). 虽然雷帕霉素抑制S6K和4E-BP1上某些位点的磷酸化，但其他4E-BPl位点（Thr37和Thr46）对雷帕霉素耐药(35). 因此，mTORC1/mTORC2抑制可能会更完全地抑制cap依赖性翻译，从而最大限度地减少体内VEGF的表达(11). 由于VEGF依赖于翻译调节，VEGF含量的减少可能是由于蛋白质合成减少，然而，储存和分泌减少也是可能的。

VEGF在肿瘤细胞和肿瘤血管相关簇中均减少。如前所述，VEGF免疫荧光的聚集模式可能代表VEGF和VEGFR复合物内化到内皮细胞中(36–38). 细胞内VEGF复合物依赖于Akt激活(37). 因此，mTORC1/mTORC2抑制导致的VEGF内化减少可能来自VEGF生成减少和Akt信号传导。

血管内皮生长因子受体抑制剂（例如OSI-930、舒尼替尼、阿西替尼）或配体（例如贝伐单抗）阻止肿瘤血管生长并修剪现有血管(39). 在这里，我们发现mTORC1/mTORC2抑制降低了VEGF的生成，从而减少了肿瘤血管的生长，但不会导致血管退化。在之前的一项研究中，在注射肿瘤细胞之前用mTORC1/mTORC2抑制剂对小鼠进行预处理时，肿瘤血管减少(10)与mTORC1/mTORC2抑制作用靶向肿瘤血管生长的观点一致。其他研究表明，内皮细胞中活化的Akt的条件性表达会导致大血管渗漏(18,40). 在这些研究中，雷帕霉素抑制肿瘤血管生长，可能表明根据Akt活性不同雷帕霉素敏感性阈值不同。

有趣的是，雷帕霉素对血管内皮生长因子受体（VEGFR）抑制停止后，VEGF的少量减少减少了肿瘤出血的复发，这与雷帕霉素介导的血管渗漏减少相一致(18). 然而，OXA-01治疗后VEGF的大量减少减少了肿瘤出血和肿瘤血管的复发。出血是肿瘤血管渗漏的标志，出血引起的血湖是RIP-Tag2胰腺肿瘤的显著特征(41,42). 总之，这些数据表明VEGF的少量减少可以防止肿瘤血管渗漏，但更大的减少对于减缓血管生长是必要的。这定义了依赖肿瘤中VEGF浓度的肿瘤血管的不同反应。

我们的数据支持使用mTORC1/mTORC2抑制剂，如OSI-027和OXA-01，作为单一药物或与抗血管生成药物联合治疗癌症。舒尼替尼是一种经批准的多靶点激酶抑制剂，具有强大的抗VEGFR2活性，其毒性特征要求在两种给药方案之间进行药物休假。药物节假日期间VEGFR抑制停止后，血管再生可能发生(17). 我们的数据表明，在停止VEGFR抑制后，OXA-01治疗减缓了血管再生。同时使用OSI-930和OXA-01治疗肿瘤异种移植物也导致肿瘤细胞增殖显著下调和凋亡上调。此外，舒尼替尼与OSI-027联合使用，比单一药物更能抑制肿瘤生长。在人类异种移植物中，交替使用舒尼替尼和OSI-027治疗方案是可以耐受的，但没有提供比连续单药给药更好的疗效。总之，这些观察结果表明，VEGFR2和mTORC1/mTORC2共同抑制肿瘤细胞和血管，从而显著抑制肿瘤生长。虽然确切的机制尚不清楚，但我们假设VEGFR2拮抗剂引起的缺氧增加会使肿瘤细胞对mTORC1/mTORC2的抑制敏感。先前的研究表明，低氧诱导的VEGF生成被Akt抑制而不是雷帕霉素减弱，表明mTORC2/Akt信号轴是低氧条件下的关键效应器(43). 此外，缺氧激活mTORC2效应器Akt可以保护细胞免受凋亡(44–46). 我们的数据表明，OXA-01而不是雷帕霉素显著抑制Akt，这可能是VEGFR2和mTORC1/mTORC1联合抑制后细胞凋亡增加和肿瘤生长减少的机制。

Rapalogs被批准用于治疗晚期肾细胞癌。本研究表明，与mTORC1抑制相比，mTORC1/mTORC2的双重抑制具有更强的抗肿瘤和抗血管作用。总之，这些结果表明，OXA-01和OSI-027具有独特的治疗相关特性，适用于这些癌症治疗药物的临床开发。

补充材料

1

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2

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三

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致谢

研究经费：美国国立卫生研究院拨款：美国国立卫生研究院CA82923；NHLBI中的HL24136、HL59157和HL96511；OSI Pharmaceuticals的拨款和AngelWorks基金会的资助。

我们感谢道格拉斯·哈纳汉（Douglas Hanahan）提供的RIP-Tag2小鼠繁殖对，感谢瑞安·奈勒（Ryan Naylor）和凯瑟琳·科尔顿（Katharine Colton）提供的技术帮助，感谢凯瑟琳·威尔逊（Kathleen Wilson）审阅手稿。作者感谢Andrew Crew、Shripad Bhagwat、Jonathan Pachter、Robert Wild、Andrew Cooke、Mark Bittner、Suzanne Russo、Jennifer Kahler、Yan Yao、Christine Mantis和Eric Brown对OSI-027和OXA-01的设计和表征。

脚注

SB、PCG、MM和DME是OSI Pharmaceuticals的员工

工具书类

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