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.2010年8月17日；19(2):329-44.
doi:10.1016/j.devcel.2010.07.010。

成骨细胞的前体，但不是成熟的成骨细胞，随着侵入的血管进入发育中和骨折的骨骼

克里斯塔·梅斯 1, 小林达也, 马丁·塞利格, 索菲·托雷肯斯, 桑福德一世罗斯, 苏珊·麦凯姆, 吉尔特·卡梅利特, 亨利·克伦伯格
附属公司

成骨细胞前体，但不是成熟的成骨细胞，随着侵入的血管进入发育中和骨折的骨骼

克里斯塔·梅斯等。 开发人员单元格. .

摘要

在软骨内骨发育过程中，第一批成骨细胞在无血管软骨原基周围的软骨膜中分化；然而，晚期骨骼中小梁成骨细胞的来源尚不清楚。在这里，我们将三苯氧胺诱导的转基因小鼠培育为Rosa26R-LacZ报告小鼠，以跟踪成骨细胞谱系细胞的阶段选择性亚群的命运。脉冲期研究表明，软骨血管侵入前软骨膜中标记的表达骨钙素的成骨细胞前体可在发育中的骨内产生小梁成骨细胞、骨细胞和基质细胞。在整个易位过程中，发现一些前体以周细胞样的方式与侵入的血管密切相关。在软骨内骨折愈合过程中也会发生类似的并发症。相反，软骨膜成熟成骨细胞没有出现血管周围定位，而是留在发育中骨骼的外皮质。这些发现揭示了未成熟成骨细胞前体在软骨内骨发育和修复所必需的耦合血管和成骨转化中的特殊参与。

PubMed免责声明

利益冲突声明

所有作者均声明无利益冲突。

数字

图1
图1。可诱导CreERt在成骨细胞系细胞中表达的转基因小鼠
（A） 成骨细胞（OB）分化进程线的简化表示（顶部）和每个阶段的特征所用的典型基因产物（橙色，如下）。本研究中使用的Osx-CreERt和Col1（3.2 kb）-CreERt转基因分别开始在成骨细胞前体和成熟成骨细胞中表达。发育过程中骨骼形成开始的示意图（底部），发生在E14和E16之间的小鼠柱足类和角足类骨骼中。软骨骨模型的初始侵袭与其向初级骨化中心（POC）的转化有关，初级骨化中含有骨小梁，并被皮质骨包围。HC，肥大软骨。（B） 携带Rosa26R报告基因转基因的E14.5 Osx-CreERt胚胎的全贴装X-gal染色。（从左至右）胚胎未暴露于4OHTam或未携带Osx-CreERt转基因、茜素红矿化染色和暴露于E13.5 4OHTamOsx-CRERt（Tg/−）胚胎中LacZ活性的相应模式。下颌骨与胚胎本身断开。放大（右）显示肋骨、颅骨和后肢（HL）骨质区域的X-gal染色。（C） 在E13.5暴露4OHTam后，在E14.5收获的类似Col1-CreERt（Tg/−）胚胎的X-gal染色。右侧，放大肋骨和HL。（D） E15.5在E13.5注射4OHTam的Osx-和Col1-CreERt（Tg/-）胚胎，放大HL和前肢（FL）。与Osx-CreERt胚胎相比，Col1-CreERt胚肋骨和HL的红色箭头染色减少。另请参见图S1关于成骨细胞CreERt小鼠的生成和表征。
图2
图2。以Osx-或Col1-CreERt表达标记的软骨膜成骨细胞世系细胞显示发育中骨骼的不同命运
（A） 在E13.5用4OHTam脉冲处理小鼠的Osx-CreERt（顶部）和Col1-CreERt的（底部）肱骨切片，在E14.5（左侧）或E16.5（右侧）处死，并染色X-gal和曙红或BrdU（最左侧；箭头表示单个LacZ+细胞，箭头指向LacZ+/BrdU+双阳性细胞）。比例尺，100μm。（B和C）E14.5时Osx-和Col1-CreERt（Tg/−）小鼠软骨膜标记（B）和标记细胞增殖指数（C）的量化。LacZ+细胞的数量和BrdU额外染色阳性的百分比是在一个确定的区域内测定的，该区域包括与（a）中黑盒区域相对应的软骨膜中央部分。棒材，平均值±SEM；n=3。（D和E）E16.5处追踪到的Osx/LacZ+和Col1/LacZ+细胞的分布（D）和总数（E）。在固定的皮质骨和小梁骨区域（A中的蓝色方块）对细胞进行计数***基因型间比较p<0.001#位置之间p<0.001。棒材，平均值±SEM；n=5–9。另请参见图S2中系统的谱系追踪动力学。
图3
图3。Osx-CreERt-表达软骨细胞的Colabeling对小梁成骨细胞池没有明显影响
（A） 在E13.5给予4OHTam后，连续3天（d1-d3）肱骨近端软骨生长。在第1天（前）肥大区（左侧）检测到Osx/LacZ+细胞，但在圆形软骨细胞区（右侧）未检测到。少数Osx/LacZ+肥大软骨细胞留在d2（支架）。到d3时，软骨中没有蓝色细胞，而Osx/LacZ+细胞在软骨-骨交界处以外的干骺端丰富（星号标记的红色括号）。（B） E15.5 Col2-CreERt胚胎的X-gal染色，E14.5处暴露或未暴露于4OHTam。注意软骨限制性X-半乳糖染色，补充茜素红染色。（C） Col2-CreERt humeri在E14.5的4OHTam后的d1和d3处被X-gal染色。注意d1软骨特异性标记和d3更复杂的染色模式，在（D）中所示区域进行了详细分析。比例尺，200μm。（D） 连续d1切片上的番红花色素O和曙红染色（左上角）显示未成熟软骨中有丰富的Col2/LacZ+细胞，肥厚层（支架）浸润，软骨膜（红色箭头）缺失。d2（右上角）处肥大和软骨膜标记增加，包括软骨-软骨界面附近的拉伸细胞，垂直于更中央的软骨细胞（黑色箭头）。（下面板）（d3）区域1（旋转）和1′（如C所示，右侧为放大视图）显示软骨-软骨界面（箭头）和骨内表面（箭头）的Col2/LacZ+细胞。区域2，软骨-骨界面处弥漫蓝色，可能是由侵蚀肥大软骨细胞释放的残余LacZ活性解释的。区域3，中央干骺端区域，由小梁成骨细胞（箭头）和骨细胞（箭头）占据，通常不呈蓝色。显示了以15–50μm的间隔分析的n=3–7条前肢的代表性截面。Col2-CreERt（−/−）切片没有X-gal染色（n=2个时间点）。另请参见图S3。
图4
图4。软骨膜Osx/LacZ+和Col1/LacZ+细胞代表成骨分化的增加阶段
（A） EM方法。用（A1）甲苯胺蓝、（A2）X-gal和（A3）EM分析的连续中层、横向薄片进行了对齐。比例尺，50μm。（A4），颗粒内质网中经常检测到的X-gal沉淀物的黑色堆积（箭头）证实，在连续切片的EM图像上，A2上识别的蓝色染色细胞可被明确指定为X-gal+（蓝色“+”）。（B） 4OHTam诱导E13.5标记1天后，软骨膜Osx/LacZ+细胞（蓝色“+”）的EM图像显示为松散的灶性连接的未成熟基质细胞（B1）、早期成骨细胞（B2和B2′放大的盒子）或软骨膜血管内皮细胞（V）（B3）周围的周细胞（EC）。插图显示了整个研究过程中用作识别标准的光镜水平的蓝色Osx/LacZ+细胞。高倍镜（B3′）显示未成熟毛细血管内皮细胞之间紧密连接（箭头），缺乏基底膜，含有红细胞。比例尺，2μm。（C） 在E13.5标记后12或24小时，通过EM对Osx/LacZ+和Col1/LacZ+细胞进行评分分析（每组分析40-47个细胞）。（D） 12小时（D1）和24小时（D2）时具有代表性的Col1/LacZ+细胞。五、 软骨膜毛细血管。（D1）通常，基质细胞和血管周细胞（星号）没有标记，而Col1/LacZ+细胞表现为成熟的立方形成骨细胞。（D2和D2′中放大的大方框）A Col1/LacZ+骨细胞和细胞树突（箭头）。（D2和D2〃中的小盒子）成熟成骨细胞。比例尺，2μm。（E） E14.5的组织学显示E13.5标记的LacZ+软骨膜细胞和骨领（Von Kossa，黑色）之间的关系。注意Osx/LacZ+细胞与矿化骨无关，而Col1/LacZ+细胞主要位于骨表面（放大）或嵌入骨中（箭头和插图）。比例尺，50μm。（F） E14.5胚胎在E12.5暴露于4OHTam。注意Osx-但Col1-CreERt后肢没有X-gal染色（箭头所示）。（G） Von Kossa染色的相应肱骨组织学。Col1/LacZ+细胞很少被发现（红色箭头）。比例尺，100μm。（H） 在E12.5标记的Osx/LacZ+细胞的典型EM图像和在E13.5分析的细胞，显示它们在松散结缔组织中作为未成熟基质细胞出现，通常与毛细血管紧密并列（V，虚线）。插图，对齐的X-gal视图。底部放大的方框区域视图，显示细胞质过程（箭头）和缝隙连接（星号）。（一） 在E12.5标记后24或48小时，通过EM分析对Osx/LacZ+细胞的形态进行评分，显示未成熟细胞的富集（每组分析14-17个细胞）。（J） E12.5标记的Osx/LacZ+细胞在E16.5肱骨皮质和小梁区域的计数。棒材，平均值±SEM；n=2***p<0.001。另请参见图S4。
图5
图5。软骨膜Osx/LacZ+细胞包括产生基质细胞、成骨细胞和发育中骨骼内的骨细胞以及周细胞的成骨细胞前体
（A–C）软骨膜Osx-CreERt表达的成骨细胞前体在E12.5处标记，通过E16.5产生骨内成骨细胞（OBs）、小梁OBs和小梁周围基质细胞以及皮质骨细胞。概述部分显示在右侧。（A） 插图放大的组织学。比例尺，200μm。（B） Col1 ISH（红色信号，叠加在对比度或Hoechst图像上）。箭头，表达Col1 mRNA的Osx/LacZ+细胞；箭头，Col1-阴性Osx/LacZ+细胞；hc，软骨肥大。区域（1）和（2）来自概览图像中的框；区域（3）显示皮层细节。（C） 通过红框区域（1-4，位于右侧概述部分）的甲苯胺蓝、LacZ和EM视图进行EM分析，并在平行EM图像上用蓝色“+”标记Osx/LacZ+细胞，通过蓝色染色进行识别。底部放大视图；注意这些LacZ+细胞中的细胞质X-gal沉积。（D） 矿化骨（“+”和箭头）上立方体Osx/LacZ+成骨细胞与含RBC的血管（V）的频繁接近。顶部，区域轮廓（（C）中的白框）和EM在（D）（1-2）和（E）（3）中分析的区域。底部，通过（左）曙红或（右）附加PECAM-1染色进行组织学检查（棕色）。注意与Osx/LacZ+成骨细胞直接相邻的血管（左图），或仅由纺锤形血管周围细胞分隔（星号），其中一些是Osx/LacZ+（红色箭头）（右图）。（E和F）EM（E）和PECAM-1 IHC（F）显示Osx/LacZ+细胞的周细胞定位。（E） 区域3（见D）（血管进入骨干的入口位置）的概述和放大倍数增加。箭头，EC之间的紧密连接；插图和箭头，重叠内皮下覆盖的细胞延伸。（F） X-gal、PECAM-1（棕色）和曙红染色部分的顶部、概述和放大图。血管周围Osx/LacZ+细胞的底部详细视图。另请参见图S5，使用Osx-Cre:GFP小鼠模型提供Osx表达细胞的分子特征。
图6
图6。成骨细胞前体进入发育中的骨骼与其对软骨侵犯血管的结块作用相关
（A和B）经曙红或TRAP染色的纵切面（A，底部），显示Osx/LacZ+细胞与血管（V，含有RBCs[曙红上强烈的洋红色]）和破骨细胞（箭头所示）在肥大软骨（HC）侵入之前（A）和侵入期间（B）积聚在中层软骨膜中。（C） 利用薄横切面和中厚切面分析HC的初始侵入过程。缩写：V，容器；HC，肥大软骨；内皮细胞；红细胞，红细胞；蓝色“+”，Osx/LacZ+细胞；OCL，破骨细胞。（C1）识别Osx/LacZ+细胞的X-gal视图（上图）和（下图）分别对应于左侧和右侧的黑匣子的对齐EM图像。各面板下方显示了相应白框的进一步放大倍数。注意软骨侵入的开始，横穿骨胶原的内皮细胞显示丰富的丝状伪足延伸（红色箭头），表明新生血管萌芽。（C2）甲苯胺蓝图片，红细胞填充血管横穿骨领（虚线）。（C3）充满RBC的毛细血管萌芽进入软骨，其间散布着Osx/LacZ+细胞。（D） 在指定的时间点，PECAM-1染色Osx-CreERt和Col1-CreERt肱骨。Osx-CreERt胚胎在E12.5或E13.5（A）–（D）中暴露于4OHTam，Col1-CreERt小鼠在E13.5中接受4OHTam。破骨细胞在最初侵袭中的作用见图S6。
图7
图7。骨折愈合中软骨的成骨和血管同时侵袭
（A） 冻存E15.5 Osx-Cre上的PECAM-1 IHC：GFP胫骨切片显示肥大软骨（HC）初始侵袭和初级骨化中心（POC）形成期间Osx/GFP+细胞（绿色，注意Cre:GFP融合蛋白的主要核定位）和内皮（红色）。PC，软骨膜。右，所示区域的放大视图。（B） 骨折后第7天Osx-Cre:GFP小鼠胫骨骨折的厚切片分析，用PECAM-1抗体（红色）和Hoechst（蓝色）染色。顶行，5×标准显微镜下的骨痂概览（左侧；黄色，脉管系统；暗区，软骨[c]和皮质骨[b]；p，骨膜），指示共焦显微镜分析的区域（方框1-3）。右侧面板，区域1和2，显示用20倍物镜拍摄的叠加图像集的投影（另请参阅电影S1–S3）。左下角，区域3，显示60×共焦图像的3D投影（另请参阅电影S4）。3D红色通道（PECAM-1信号）也单独显示（黑白视图），显示了侵入前沿的内皮细胞丝足（红色箭头）。右下角，从60×堆栈中提取的单个光学切片，以及省略蓝色通道信号的放大细节，以优化Osx/GFP+核的评估。注意大量Osx/GFP+细胞立即并排在内皮衬里（箭头）和侵入前沿的尖端（箭头）。（C） qRT-PCR分析Osx/GFP+分类细胞群（平均值±SEM；n=4）中的VEGF、Ang1和PDGFRβ，这些细胞群来源于胶原酶消化的新生Osx-Cre:GFP小鼠颅骨或长骨，与Osx-Cre:GFP阴性同窝鼠（“全裂解物”）的对照消化物相比较。图S7提供了骨折愈合过程中叠加共焦图像的视频文件（电影S1–S4）和其他时间点的数据。
图8
图8。总结我们发现的模型
软骨骨模型初始侵入及其转化为初级骨化中心（POC）期间发生的事件的示意图。表达Col2的软骨-大肠前体细胞（绿色）在中央生长软骨中产生细胞，在周围产生横向细胞，推测软骨膜/成骨细胞的命运。第一个定向成骨细胞谱系细胞出现在骨干肥大软骨周围的软骨膜中。这些细胞根据其成熟阶段在发育中的骨骼中显示不同的命运。以表达Osx的成骨细胞前体细胞（Osx/LacZ+，黄色）为代表的谱系早期细胞移动到发育中的POC中，并将其作为基质细胞填充，或进一步分化为成骨小梁成骨细胞。成骨细胞前体进入POC与血管（红色）和破骨细胞（蓝色）的初始侵袭相吻合，并且与前体的一个子集在内皮上的周细胞定位有关。相反，软骨膜/骨膜（Col1/LacZ+成熟成骨细胞，橙色）内分化至Col1（3.2 kb）表达阶段的细胞在血管覆盖部位没有发现，也没有转移到POC的能力。这些成骨细胞保留在皮质骨表面上和内部。
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