Tsc2 is a molecular checkpoint controlling osteoblast development and glucose homeostasis

doi:10.1128/MCB.00075-14

.2014年5月；34(10):1850-62.

doi:10.1128/MCB.00075-14。 Epub 2014年3月3日。

Tsc2是控制成骨细胞发育和葡萄糖稳态的分子检查点

瑞安·C·里德尔¹, 朱莉·L·弗雷, 瑞恩·汤姆林森, 马蒂厄·费隆, 李媛媛, 道格拉斯·迪吉罗拉莫, 玛丽·克劳德·福格雷, 梅赫布布·侯赛因, 卡尔桑迪, 托马斯·克莱门斯

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Tsc2是控制成骨细胞发育和葡萄糖稳态的分子检查点

瑞安·C·里德尔等。分子细胞生物学. 2014年5月.

.2014年5月；34(10):1850-62.

doi:10.1128/MCB.00075-14。 Epub 2014年3月3日。

作者

瑞安·C·里德尔¹, 朱莉·L·弗雷, 瑞恩·汤姆林森, 马修·费隆, 李媛媛, 道格拉斯·迪吉罗拉莫, 玛丽·克劳德·福格尔, 梅赫布布·侯赛因, 卡尔桑迪, 托马斯·克莱门斯

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¹约翰霍普金斯大学医学院整形外科，美国马里兰州巴尔的摩。

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摘要

成骨细胞中的胰岛素信号通过刺激骨钙素的生成调节全球能量平衡，骨钙素是一种促进胰岛素生成和作用的骨源性蛋白。为了确定成骨细胞中介导胰岛素对骨和能量代谢影响的信号通路，我们检测了结节性硬化症2（Tsc2）蛋白的功能，该蛋白是协调营养信号的重要靶点。在这里，我们发现成骨细胞中Tsc2的缺失会激活mTOR并破坏Irs1的稳定性，导致成骨细胞分化不良并对胰岛素产生抵抗。年轻的Tsc2突变小鼠表现出低血糖，胰岛素和羧基化骨钙素水平升高。然而，随着年龄的增长，Tsc2突变体的代谢特征与成骨细胞中缺乏胰岛素受体的小鼠相似，包括外周肥胖、高血糖和胰腺β细胞质量下降。这些代谢异常似乎是由羧基化不足的骨钙素长期升高导致骨钙素受体下调和β细胞对这种激素脱敏所致。从Tsc2突变小鼠中去除单个mTOR等位基因后，骨骼和代谢异常基本恢复正常。总之，这些研究结果表明，Tsc2是成骨细胞中的一个关键检查点，成骨细胞需要适当的胰岛素信号，并可确保正常的骨获取和能量平衡。

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图1
Tsc2调节出生后的骨骼获取。（A） Oc-Core组织中Tsc2等位基因重组的PCR分析^TG公司/+Tsc2型^弗洛克斯（ΔTsc2）小鼠。（B） 3周龄对照组和ΔTsc2小鼠（B，骨；Mu，肌肉；骨膜，骨膜）皮质骨中磷酸-S6K的免疫组织化学染色。（C至G）对照组和ΔTsc2小鼠3、6、12和24周龄股骨远端骨小梁结构的显微CT定量分析(n个=4至6只小鼠）。（C）代表性图像。（D）骨体积/组织体积。（E）小梁数（Tb.N）/mm.（F）小梁厚度（Tb.Th）。（G）小梁间距（Tb.Sp）.*，*P（P）*< 0.05. （H）对照组和ΔTsc2小鼠3、6、12和24周龄股骨中段皮质骨结构的典型显微CT图像。（一） 24周龄对照组和ΔTsc2小鼠颅骨的典型显微CT图像。（J）来自3周龄对照（a）和ΔTsc2（b）小鼠的代表性苏木精-伊红染色皮质骨切片。原始放大倍数，×20。（K和L）免疫组织化学染色，检测3周龄对照组和ΔTsc2小鼠（Ma，骨髓）皮质骨中的骨性线（K）和Runx2（L）。箭头突出显示皮质骨中的染色。

图2
Tsc2缺乏损害成骨细胞分化。（A） Tsc2原代成骨细胞中Tsc2表达的Western blot分析^弗洛克斯表达腺病毒的小鼠感染后*Cre公司*（ΔTsc2）或绿色荧光蛋白（GFP）（Con）作为对照。S6K1磷酸化被用作mTOR激活的标记。（B）对照组和ΔTsc2成骨细胞蛋白质合成的定量。结果以对照成骨细胞的百分比表示。（C）通过BrdU掺入对照组和ΔTsc2成骨细胞定量成骨细胞增殖。（D）通过caspase-3活性对对照组和经载体（NT）或8 ng/ml staurosporine处理的ΔTsc2成骨细胞的凋亡进行量化。结果以车辆处理的对照成骨细胞的百分比表示。（E至G）Tsc2缺失后成骨细胞分化检查。（E）分化14天后碱性磷酸酶（ALP）和茜素红（ARS）染色。（F）分化14天后，定量PCR（qPCR）分析Runx2、osterix（Osx）、Atf4、I型胶原（ColI）、Twist1和Twist2的表达。（G）分化14天后RankL和Opg表达的qPCR分析。（H）对照组和ΔTsc2成骨细胞中胰岛素刺激（10 nM，15分钟）Akt磷酸化和Irs1水平的Western blot分析。（一）对照组和ΔTsc2成骨细胞中Irs1表达的qPCR分析。（J）在环己酰亚胺（100μg/ml）存在下培养的对照和ΔTsc2成骨细胞中的Irs1蛋白水平。（K）对照组和ΔTsc2成骨细胞eIF-2α、Perk和Jnk磷酸化状态的Western blot分析。（五十） qPCR分析对照组和ΔTsc2成骨细胞中Chop和BiP的表达。（M）用SP600125（Jnk抑制剂；10μM）处理24小时的对照组和ΔTsc2细胞和ΔTsc2细胞中Irs1蛋白表达和胰岛素刺激的Akt磷酸化的Western blot分析（N）qPCR分析Tsc2、Runx2和osterix（Osx）对照组和经SP600125处理的ΔTsc2细胞和ΔTsco2成骨细胞分化14天后的表达。（O）在指定浓度的雷帕霉素存在下分化14天后，对对照组和ΔTsc2成骨细胞培养物进行茜素红染色。（P）在0或10 nM雷帕霉素存在下分化7天的对照成骨细胞培养物的茜素红染色。*，*P（P）*< 0.05.

图3
ΔTsc2小鼠增加了外周肥胖并改变了葡萄糖代谢。（A）对照组和ΔTsc2小鼠的体重(n个=8至11）。（B） 6周龄和12周龄时的性腺脂肪垫质量(n个=4至6只小鼠）。（C） 6周龄和12周龄时随机喂食葡萄糖的测量(n个＝5至8只小鼠）。（D） 6周龄和12周龄时空腹血糖的测量(n个=5至8只小鼠）。（E） 6周龄和12周龄时的血清胰岛素水平(n个=4至6只小鼠）。（F） 6周禁食过夜后的葡萄糖耐量测试(n个=5至8只小鼠）。（G） 6周禁食4小时后进行胰岛素耐受性测试(n个=5或6只小鼠）。（H） 6周龄时GTT和ITT曲线下面积分析。（一） 12周禁食一晚后进行葡萄糖耐量测试(n个=5至8只小鼠）。（J） 12周禁食4小时后进行胰岛素耐受性测试(n个=5或6只小鼠）。（K） 12周龄时GTT和ITT曲线下面积分析。（五十） 12周大时禁食过夜后的葡萄糖刺激胰岛素分泌试验(n个=4或5只小鼠）。对照组和ΔTsc2小鼠胰腺β细胞的（M到O）组织形态计量学分析(n个=5只小鼠）。（M）胰岛胰岛素和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色的代表性图像。（N） β细胞面积（组织面积百分比）。（O） β细胞质量。（P）qPCR分析*检查1*和*2英寸*胰腺中的表达(n个=4只小鼠）。（Q） qPCR分析*Pparg公司*和*Ucp1单位*白色脂肪（WAT）和棕色脂肪（BAT）组织中的表达(n个=5只小鼠）。（R） qPCR分析*第1包*,*Pdk4型*、和格克在肝脏中的表达(n个=5只小鼠）。*，*P（P）*< 0.05.

图4
Tsc2消融后，骨钙素的产生显著增加。（A） 12周龄对照组和ΔTsc2小鼠的血清总骨钙素(n个=5至7只小鼠）。（B） 12周龄时未羧化骨钙素水平(n个=5至7只小鼠）。（C） 12周龄时羧化不足（Glu13）骨钙素水平(n个=5至7只小鼠）。（D） qPCR分析对照组和用胰岛素（INS）或载体（NT）处理6小时的ΔTsc2成骨细胞分化0或4天后的骨钙素mRNA水平。（F）分化4天后对照组和ΔTsc2成骨细胞FoxO1磷酸化状态的Western blot分析。（G）分化4天后，对从对照组和ΔTsc2成骨细胞分离的细胞核（Nuc）和细胞质（Cyto）提取物中FoxO1丰度进行Western blot分析。比率由两个独立的实验得出。（H）分化4天后对照组和ΔTsc2成骨细胞FoxO1与骨钙素基因结合的染色质免疫沉淀定量分析(n个=3或4）。未检测到N.D.。*，*P（P）*< 0.05.

图5
骨钙素过度生产导致脱敏。（A）随机喂食对照组和1周龄ΔTsc2小鼠的血糖测量(n个=8至14只小鼠）。（B） 1周龄时的血清胰岛素水平(n个=8至14只小鼠）。（C） qPCR分析*英寸1*和*2英寸*1周龄对照组和ΔTsc2小鼠胰腺中的表达(n个=3至5只小鼠）。（D） 1周龄对照组和ΔTsc2小鼠的血清总骨钙素(n个=8或9只小鼠）。（E） 1周龄时未羧化骨钙素水平(n个=8或9只小鼠）。（F）分化14天后，与对照组或ΔTsc2成骨细胞条件培养48小时的培养基中的骨钙素水平。（G） Western blot分析在含有对照或ΔTsc2成骨细胞的培养基中培养24小时的Min6细胞中Gpcr6a丰度（h和I）*在1中*和*2英寸*在含有对照或ΔTsc2成骨细胞的条件培养基中培养6小时后，用骨钙素（0至100 ng/ml）处理Min6细胞的mRNA水平。（J） Western blot分析从6周龄对照组和ΔTsc2小鼠中提取的初级β细胞中Gpcr6a的丰度。（K） Gpcr6a Western blot分析的密度分析(n个＝2或3只小鼠）。*，*P（P）*< 0.05.

图6
mTOR的调节使ΔTsc2突变体的骨和葡萄糖代谢正常化。（A）对照组和12周龄mTOR和Tsc2复合突变小鼠股骨远端骨小梁结构的典型显微CT图像。（B）对照组体重和ΔTsc2；mTOR公司¹12周龄小鼠（8至11只）。（C） 12周龄（5至11只小鼠）随机喂食和禁食时的血糖。（D） 12周禁食一晚后进行葡萄糖耐量试验(n个=7至11只小鼠）。（E） Oc-Core组织中mTOR等位基因重组的PCR分析^TG公司/+mTOR公司^弗洛克斯（ΔmTOR）小鼠。（F）对照组和ΔmTOR小鼠的体重(n个=7至14只小鼠）。12周龄对照组和ΔmTOR小鼠股骨远端骨小梁结构的（G to I）定量micro-CT分析(n个=4或5只小鼠）。（G）代表性图像。（H）骨体积/组织体积。（一）小梁数/mm。（J）从mTOR分离的原代成骨细胞中mTOR表达的Western blot分析^弗洛克斯表达腺病毒的小鼠感染后*Cre公司*（ΔmTOR）或GFP（Con）作为对照。（K）分化14天后Runx2、osterix（Osx）和I型胶原（ColI）的qPCR分析。*，*P（P）*< 0.05.

图7
ΔTsc2小鼠骨骼和代谢表型的拟议模型。成骨细胞中Tsc2的基因消融导致未经检查的mTOR信号传导，从而增加成骨细胞存活率和蛋白质合成。蛋白质合成增加导致内质网应激反应，降低Irs1蛋白水平，降低成骨细胞对胰岛素的敏感性，并损害成骨细胞分化。同时，mTOR信号转导使转录因子FoxO1失活，后者通常抑制骨钙素的生成。骨钙素的显著增加导致胰腺β细胞对激素脱敏。

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