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.2007年6月；117（6）：1616-26。
doi:10.1172/JCI31581。

低氧诱导因子-α途径在骨骼发育过程中将血管生成与骨生成耦合

王颖（音） 1, 赵湾, 邓连福, 刘锡盟, 曹雪梅, 肖恩·吉尔伯特, 玛丽·L·鲍克森, 玛丽·克劳德·福格雷, 罗伯特·E·古德堡, 路易斯·杰斯腾菲尔德（Louis C Gerstenfeld）, Volker H Haase公司, 兰德尔·S·约翰逊, 欧内斯特尼亚·斯基帕尼, 托马斯·克莱门斯
附属公司

低氧诱导因子-α途径在骨骼发育过程中将血管生成与骨生成耦合

王颖（音）等。 临床研究杂志. 2007年6月.

摘要

骨骼发育和周转与血管生成在时空上密切相关。成骨细胞理想地位于骨骼中，通过激活缺氧诱导因子-α（HIF-α）通路来感知氧张力并对缺氧作出反应。在这里，我们提供了证据表明，HIF-α通过提高成骨细胞中的VEGF水平促进血管生成和成骨。通过选择性删除von Hippel-Lindau基因（Vhl）在成骨细胞中过度表达HIF-α的小鼠表达了高水平的Vegf，并发育出极其致密、血管密集的长骨。相比之下，成骨细胞中缺乏Hif1a的小鼠具有与Vhl突变体相反的骨骼表型：长骨明显比对照组更薄，血管更少。成骨细胞中Vhl的丢失增加了体外胚胎跖骨的内皮细胞萌芽，但在没有血管的情况下对成骨细胞功能几乎没有影响。缺乏Vhl和Hif1a的小鼠的骨表型介于单个突变体之间，表明HIF在骨中的功能重叠。这些研究表明，骨发育过程中HIF-α途径的激活通过细胞自主机制增加了骨建模事件，以协调骨中新血管形成的时间、方向和程度。

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数字

图1
图1。原代小鼠成骨细胞表达HIFα途径的成分。
(一个)从野生型小鼠中获得Calvarial原代成骨细胞，并在α-MEM中培养至融合。在重复进行的实验中，使用抗pVHL（顶部）、PHD1（中部）和PHD3（底部）的抗体通过免疫印迹分析全细胞裂解物。OB，成骨细胞。(B类和C)汇合细胞单层暴露于21%（常氧）或2%（缺氧）O224小时。(B类)分别从细胞质（C）和细胞核（N）中提取蛋白质，并用抗HIF-1α（顶行）和HIF-2α（底行）抗体进行免疫印迹分析。(C)HIF-1α（顶行）和HIF-2α（底行）的核易位通过共聚焦显微镜进行评估，如方法所述。DAPI染色细胞核。原始放大倍数，×100。(D类和E类)进行定量实时PCR分析以确定维格夫和葡萄糖转运蛋白1细胞单层暴露于常压（白条）或缺氧（黑条）指定时间后mRNA表达*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01***P（P）< 0.001.
图2
图2。成骨细胞特异性、Cre介导的缺失沃尔.
(一个)aΔ中选定组织中Cre介导重组的PCR分析沃尔鼠标。重组等位基因（Δ弗洛克斯)仅存在于骨组织中。(B类)6周龄对照组和Δ组股骨远端的代表性组织切片沃尔如方法中所述，用针对pVHL（左）、HIF-1α（中）或HIF-2α（右）的抗体染色后的小鼠。切片用苏木精复染。红色箭头表示成骨细胞中的阳性染色，黑色箭头表示成骨细胞中的阴性染色。原始放大倍数，×400。(C和D类)汇合单层沃尔用Ad-GFP或Ad-CreM1（100 MOI）感染漂浮的原代成骨细胞48小时。(C)分别提取细胞质和细胞核中的蛋白质，并用抗pVHL、HIF-1α和HIF-2α抗体进行免疫印迹分析。TBP和α-微管蛋白的免疫印迹分别用作核蛋白和细胞质蛋白的负荷对照。TBP、TATA盒-结合蛋白。(D类)腺病毒感染48小时后，从成骨细胞融合单层中提取总mRNA，并对其进行基因表达沃尔,维格夫、和葡萄糖转运蛋白1通过实时定量PCR检测。白色条表示Ad-GFP感染；黑色条表示Ad-CreM1感染*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
图3
图3。中断沃尔成骨细胞中长骨体积增加。
(一个)Δ的股骨代表性μCT图像沃尔对照组小鼠为3周龄、6周龄和12周龄。比例尺：5.0 mm(B类)6周龄Δ的代表性股骨横截面沃尔和对照小鼠。比例尺：1.0 mm(C–E类)对Δ沃尔方法中描述的3周龄小鼠和对照组。骨小梁体积的比较(C)，小梁分离(D类)和每个成骨细胞的成骨率(E类)控制中（白色条；n个=6）和ΔVhl公司小鼠（黑条；n个=7）。数据表示平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01. (F类)七日龄小鼠在处死前用连续剂量的钙黄绿素标记。来自对照组和Δ的股骨远端代表性钙调素标记切片沃尔展示的是老鼠。原始放大倍数，×400。(G公司)在7日龄Δ的股骨远端进行成骨细胞数量的定量组织形态计量学测量沃尔（黑色条；n个=3）和对照小鼠（白条；n个= 3). 数据表示平均值±SEM*P（P）< 0.05.
图4
图4。损失沃尔成骨细胞不改变颅骨。
(一个)12周龄Δ颅骨的典型μCT图像沃尔和控制老鼠（顶部）。比例尺：2.0 mm。底部面板显示6周龄对照组和Δ的头盖骨H&E染色部分沃尔老鼠。原始放大倍数，×100。(B类和C)对6周龄Δ的颅骨切片进行骨体积和成骨细胞数量的定量组织形态计量学测量沃尔（黑色条；n个=3）和对照小鼠（白色条；n个= 3). 数据表示平均值±SEM。
图5
图5。Δ长骨血管生成增加沃尔老鼠。
(一个)Δ后肢照片Vhl公司和对照小鼠。(B类)7日龄和3周龄Δ微丝灌注股骨血管的典型μCT图像沃尔和对照小鼠。比例尺：1.0 mm(C和D类)微过滤器灌注Δ对股骨内血管表面和体积的形态学分析沃尔（黑色条；n个=3）和控制（白色条；n个=3）小鼠。数据表示平均值±SEM**P（P）< 0.01. (E类)原位杂交分析维格夫3日龄对照组和对照组组织切片上的mRNA沃尔变异股骨。原始放大倍数，×40。(F类–我)体外血管生成试验。从对照组和Δ沃尔E17.5胎儿，在α-MEM中培养14天。使用方法中描述的抗CD31抗体进行检测。显示了具有代表性的图像。原始放大倍数，×25。(F类)对照跖骨几乎没有可检测到的内皮细胞发芽。(G公司)用重组VEGF（10 ng/ml）治疗的对照跖骨中出现大量内皮细胞发芽。(H（H）)Δ处大量内皮细胞萌芽沃尔用小鼠对照IgG（100 ng/ml）治疗后，跖骨保持完整。(我)内皮细胞在Δ中发芽的特异性抑制沃尔使用VEGF-中和抗体（100 ng/ml）的跖骨。数据代表了3个独立实验。
图6
图6。删除沃尔体外培养的原代成骨细胞不影响成骨细胞的增殖和凋亡。
汇流的Vhl公司漂浮的原代成骨细胞单层被腺-GFP或腺-CreM1（100 MOI）感染。沃尔感染48小时后通过实时PCR检测感染成骨细胞的mRNA表达，以评估缺失效率。按照方法进行细胞增殖、凋亡和分化分析。(一个和B类)用流式细胞术检测BrdU掺入对细胞增殖的影响。(C和D类)用膜联蛋白V–PE染色流式细胞术检测细胞凋亡。(E类)细胞在成骨培养基中培养7和14天后，通过ALP（左）和von Kossa染色（右）检测矿化结节的形成。(F类和G公司)ALP和von Kossa染色的密度分析E类使用NIH ImageJ 1.36b。数据表示平均值±SEM(H（H）)测量沃尔,Hif1a型，runt-related转录因子2(运行2)、和OC公司在成骨诱导第14天通过定量实时PCR进行mRNA表达**P（P）<0.01***P（P）< 0.001.
图7
图7。缺少老鼠Hif1a型成骨细胞的长骨狭窄，血管化不良。
(一个)aΔ中选定组织中Cre介导重组的PCR分析Hif1a型鼠标。重组等位基因（Δ弗洛克斯)仅存在于骨组织中。(B类)6周龄对照组和Δ组股骨远端的代表性组织切片Hif1a型方法中描述的HIF-1α（左）或HIF-2α（右）抗体染色后的小鼠。切片用苏木精复染。红色箭头表示成骨细胞中的阳性和黑色箭头表示阴性染色。原始放大倍数，×400。(C)对照组和Δ的股骨横截面代表性图像Hif1a型老鼠。比例尺：1.0 mm(D类)3周龄Δ微丝灌注股骨血管的典型μCT图像Hif1a型和对照小鼠。比例尺：1.0毫米(E类和F类)的汇合单层Hif1a型漂浮的原代成骨细胞感染Ad-GFP或Ad-CreM1（100 MOI）。(E类)感染48小时后，分别提取细胞质和细胞核中的蛋白质。用HIF-1α和HIF-2α抗体进行免疫印迹分析。TBP和α-微管蛋白的免疫印迹分别用作核蛋白和细胞质蛋白的负荷对照。(F类)感染48小时后，从融合的成骨细胞单层中提取总mRNA。Hif1a型,Hif2a型、和维格夫用实时定量PCR检测mRNA表达**P（P）< 0.01.
图8
图8。骨和血管表型沃尔和Hif1a型双基因敲除小鼠。
(一个)6周龄Δ的代表性股骨横截面μCT图像沃尔/ΔHif1a型双突变小鼠和野生型对照。比例尺：1.0 mm(B类)3周龄Δ的微丝灌注股骨的代表性图像沃尔/ΔHif1a型双突变小鼠和对照鼠。比例尺：1.0 mm(C)6周龄Δ股骨切片HIF-2α水平的免疫组化分析沃尔/ΔHif1a型双突变小鼠和对照鼠。切片用苏木精复染。红色箭头表示成骨细胞中的阳性和黑色箭头表示阴性染色。原始放大倍数，×400。(D类)原位杂交分析维格夫来自6周龄对照和双突变股骨的组织学切片上的mRNA。原始放大倍数，×100。
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