简介
大多数哺乳动物的骨骼都是通过软骨内骨化形成的。这一过程依赖于各种细胞类型的协同增殖、分化和相互作用，但最终依赖于成骨细胞系细胞来实际合成和矿化骨基质。然而，体内成骨细胞和成骨基质细胞的起源尚不完全清楚。
软骨内骨化开始时，预示未来长骨的间充质冷凝首先发展为软骨。当中央区域的细胞分化为肥大的软骨细胞时，成骨细胞出现在周围的软骨膜中，并生成“骨领”，即临时骨皮质。此时，软骨模板的初始血管侵入发生，触发骨内初级骨化中心的形成（参见). 内皮细胞和破骨细胞首先积聚在软骨膜区域，并被吸引侵袭和侵蚀软骨(Karsenty和Wagner，2002年;Kronenberg，2007年). 伴随而来的是，成骨细胞和骨髓细胞填充在新挖掘的、血管密集的区域。
可诱导CreERt在成骨细胞系细胞中表达的转基因小鼠（A） 成骨细胞（OB）分化进程线的简化表示（顶部）和每个阶段的特征所用的典型基因产物（橙色，如下）。本研究中使用的Osx-CreERt和Col1（3.2 kb）-CreERt转基因分别开始在成骨细胞前体和成熟成骨细胞中表达。发育过程中骨骼形成开始的示意图（底部），发生在E14和E16之间的小鼠柱足类和角足类骨骼中。软骨骨模型的初始侵袭与其向初级骨化中心（POC）的转化有关，初级骨化中含有骨小梁，并被皮质骨包围。HC，肥大软骨。
（B） 携带Rosa26R报告基因转基因的E14.5 Osx-CreERt胚胎的全贴装X-gal染色。（从左至右）胚胎未暴露于4OHTam或未携带Osx-CreERt转基因、茜素红矿化染色和暴露于E13.5 4OHTamOsx-CRERt（Tg/−）胚胎中LacZ活性的相应模式。下颌骨与胚胎本身断开。放大（右）显示肋骨、颅骨和后肢（HL）骨质区域的X-gal染色。
（C） 在E13.5暴露4OHTam后，在E14.5收获的类似Col1-CreERt（Tg/−）胚胎的X-gal染色。右侧，放大肋骨和HL。
（D） E15.5在E13.5注射4OHTam的Osx-和Col1-CreERt（Tg/-）胚胎，放大HL和前肢（FL）。与Osx-CreERt胚胎相比，Col1-CreERt胚肋骨和HL的红色箭头染色减少。
另请参见图S1关于成骨细胞CreERt小鼠的产生和特性。
成骨细胞与表达Runx2的间充质祖细胞分化，Runx2是成骨细胞完全分化所需的转录因子(Nakashima等人，2002年;小森等人，1997年;Otto等人，1997年). Osterix（Osx）是Runx2的基因下游，是另一种成骨细胞生成所需的早期转录因子(Nakashima等人，2002年). 当它们进一步分化时，成骨细胞产生基质蛋白，包括主要的骨成分I型胶原（Col1）。嵌入骨基质的成熟成骨细胞分化为骨细胞(玛丽，2008;Karsenty和Wagner，2002年; 看见).
Cre重组酶与修饰的雌激素受体配体结合域（ERt）融合后，可以通过给药他莫昔芬或4-羟基他莫昔酚（4OHTam）暂时诱导其活性(Metzger等人，1995年). 三苯氧胺从细胞中的清除介导CreERt复合体回到非活性状态，从而为基因调控创造了一个时间窗口(Feil等人，1996年). 条件报告基因，如Rosa26Rβ-半乳糖苷酶（LacZ）转基因(索里亚诺，1999年)，可以通过用LacZ底物4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）对细胞进行蓝色染色来指示重组。因此，该系统允许在注射三苯氧胺时对CreERt表达细胞进行基因标记，并随后追踪这些细胞及其后代（参见Maes等人，2007年以及其中的参考）。
在这里，我们使用CreERt系统开发小鼠模型，用于体内成骨细胞谱系追踪。通过使用Osx和胶原蛋白I（α1）（Col1）基因启动子，我们可以标记和跟踪骨发育过程中的阶段选择性成骨细胞。我们的数据表明，特定的成骨细胞谱系细胞池显示出不同的命运和启动新骨形成部位的能力。
结果
由阶段特异性成骨细胞谱系启动子驱动的CreERt小鼠
产生Osx-CreERt和Col1-CreERt小鼠（见补充实验程序在线提供）并交叉给Rosa26R LacZ报告鼠(索里亚诺，1999年) (图S1A). 在特定时间注射4OHTam的怀孕小鼠的子代的X-gal染色确定了经过CreERt介导的重组的细胞及其后代(图S1B). 为了评估起源于软骨膜的成骨细胞系细胞的命运，我们在初级骨化中心发育之前对这些细胞进行了基因标记，这一过程始于或超过E14.5(). 我们首先确认CreERt活性在整个胚胎发生过程中是配体依赖性和特异性的。在没有4OHTam的情况下，任何一种小鼠系都没有发生漏重组，E14.5和E17.5之间的任何年龄段都没有X-gal染色证明了这一点，并且在缺乏Osx-或Col1-CreERt转基因的胚胎骨骼中也没有发现非特异性LacZ活性(; 数据未显示）。
当怀孕小鼠在E13.5用4OHTam脉冲处理时，Osx-CreERt（Tg/−）和Col1-CreERt胚胎在E14.5处死后均显示出强烈的X-gal染色(). 宏观和组织学分析证实了诱导的LacZ表达的骨骼特异性(图S1C–S1F). 在E13.5接受4OHTam的E14.5 Osx-CreERt（Tg/−）胚胎中的X-gal染色在下颌骨、颅骨外侧骨、肋骨近端和近端肢体骨中显示()而时间匹配的Col1-CreERt（Tg/−）胚胎大致显示了这种模式，但整个骨骼的分布减少(例如，注意后肢没有染色）。这些观察结果证实了在Osx和Col1-CreERt（Tg/−）胚胎的骨骼中，三苯氧胺和Cre依赖性LacZ的激活是紧密的，也表明了小鼠品系之间的细微差异。
为了进一步比较Osx-和Col1-CreERt小鼠的标记模式，我们接下来在E13.5刺激母亲后，分析了E15.5的胚胎(). X-gal染色模式与E14.5中观察到的相似。因此，与Osx-CreERt（Tg/−）小鼠相比，Col1-CreERt胚胎的LacZ活性再次降低(). 因此，正如预期的那样，Osx-CreERt在发育过程中的表达早于Col1-CreERt。
谱系追踪揭示软骨膜成骨细胞亚群在体内的不同命运
与发育领先于后肢的前肢一致，在E13.5暴露于4OHTam的Osx以及Col1-CreERt（Tg/−）胚胎中，肱骨、桡骨和尺骨呈蓝色。因此，我们将追踪实验的重点放在肱骨上。组织学证实其软骨状态为E14.5(). Osx-和Col1-CreERt（Tg/−）胚胎均显示软骨膜细胞的镶嵌LacZ标记(，左）。标记细胞的数量，分别命名为Osx/LacZ+和Col1/LacZ+细胞，没有显著差异()（p=0.84）。两组标记细胞均含有BrdU阳性细胞(，最左边）和它们的增殖指数没有显著差异()（p=0.16）。
以Osx-或Col1-CreERt表达标记的软骨膜成骨细胞世系细胞显示发育中骨骼的不同命运（A） 在E13.5用4OHTam脉冲处理小鼠的Osx-CreERt（顶部）和Col1-CreERt的（底部）肱骨切片，在E14.5（左侧）或E16.5（右侧）处死，并染色X-gal和曙红或BrdU（最左侧；箭头表示单个LacZ+细胞，箭头指向LacZ+/BrdU+双阳性细胞）。比例尺，100μm。（B和C）E14.5时Osx-和Col1-CreERt（Tg/−）小鼠软骨膜标记（B）和标记细胞增殖指数（C）的量化。LacZ+细胞的数量和BrdU额外染色阳性的百分比是在一个确定的区域内测定的，该区域包括与（a）中黑盒区域相对应的软骨膜中央部分。棒材，平均值±SEM；n=3。
（D和E）E16.5处追踪到的Osx/LacZ+和Col1/LacZ+细胞的分布（D）和总数（E）。在固定的皮质骨和小梁骨区域（A中的蓝色方块）对细胞进行计数***基因型间比较p<0.001#位置之间p<0.001。棒材，平均值±SEM；n=5–9。
另请参见图S2关于系统的谱系追踪动力学。
为了在软骨内骨发育的后续步骤中追踪标记细胞的命运，我们需要定义标记的时间窗口，并验证在此期间之后没有发生进一步的细胞从头标记。因此，我们评估了4OHTam给药后胚胎中LacZ诱导的动力学(图S2). X-半乳糖染色在注射4OHTam后8小时即可检测到，此后其骨骼分布模式保持相似。通过使用不同骨骼元素的不同发育时间作为内部时钟，我们可以确定Osx-CreERt的诱导活性(图S2)Col1-CreERt（数据未显示）在体内快速短暂，4OHTam给药后激活窗口小于24小时。
有趣的是，当我们追踪3天E13.5标记的细胞时，两个转基因小鼠系的染色模式变得明显不同(，右侧）。Osx/LacZ+细胞沿着外皮质骨稀疏分布，而它们大量占据了轴内形成的小梁骨(，右上角）。与之形成鲜明对比的是，Col1/LacZ+细胞几乎只局限于皮质表面，在骨腔内几乎没有发现(，右下方）。这些不同的模式通过在指定的小梁和皮质区域（蓝色方块)：70%计数的Osx/LacZ+细胞位于小梁区，而Col1/LacZ+细胞仅占20%(). 两个小鼠系之间的细胞总数相似()这表明，各个细胞群增殖潜能的细微差异不太可能解释观察到的位置多样性。当在初级骨化中心形成后（在E15.5或超过E15.5）给予4OHTam时，Col1-CreERt转基因能够标记骨内的小梁成骨细胞（未显示）。这些数据表明，以分化阶段选择性基因活性为标志的软骨膜成骨细胞谱系细胞在发育中的骨骼中表现出不同的命运。Osx/LacZ+池的细胞似乎主要在骨内移动到小梁区域，而Col1/LacZ+细胞主要留在皮质。
Osx-CreERt表达软骨细胞的共标记对小梁成骨细胞池的贡献不大
Col1-CreERt标记仅限于软骨膜，而Osx-CreERt（Tg/−）胚胎在肥大前和早期软骨细胞区也显示出镶嵌标记()与Osx在增生前软骨细胞中的内源性表达一致(希尔顿等人，2005年)（另请参见图S4A). 由于注射后3天Osx/LacZ+软骨细胞完全消失，因此没有针对自我更新人群（E16.5）(). 为了评估这些细胞是否因凋亡而死亡或转分化为成骨细胞，我们采用软骨导向的Col2-CreERt小鼠系(Nakamura等人，2006年) ().
Osx-CreERt-表达软骨细胞的Colabeling对小梁成骨细胞池没有明显影响（A） 在E13.5给予4OHTam后，连续3天（d1-d3）肱骨近端软骨生长。在第1天（前）肥大区（左侧）检测到Osx/LacZ+细胞，但在圆形软骨细胞区（右侧）未检测到。少数Osx/LacZ+肥大软骨细胞留在d2（支架）。到d3时，软骨中没有蓝色细胞，而Osx/LacZ+细胞在软骨-骨交界处以外的干骺端丰富（星号标记的红色括号）。
（B） E15.5 Col2-CreERt胚胎的X-gal染色，E14.5处暴露或未暴露于4OHTam。注意软骨限制性X-半乳糖染色，补充茜素红染色。
（C） Col2-CreERt humeri在E14.5的4OHTam后的d1和d3处被X-gal染色。注意d1软骨特异性标记和d3更复杂的染色模式，在（D）中所示区域进行了详细分析。比例尺，200μm。
（D） 连续d1切片上的番红花色素O和曙红染色（左上角）显示未成熟软骨中有丰富的Col2/LacZ+细胞，肥厚层（支架）浸润，软骨膜（红色箭头）缺失。d2（右上角）处肥大和软骨膜标记增加，包括软骨-软骨界面附近的拉伸细胞，垂直于更中央的软骨细胞（黑色箭头）。（下面板）（d3）区域1（旋转）和1′（如C所示，右侧为放大视图）显示软骨-软骨界面（箭头）和骨内表面（箭头）的Col2/LacZ+细胞。区域2，软骨-骨界面处弥漫蓝色，可能是由侵蚀肥大软骨细胞释放的残余LacZ活性解释的。区域3，中央干骺端区域，由小梁成骨细胞（箭头）和骨细胞（箭头）占据，通常不呈蓝色。显示了以15–50μm的间隔分析的n=3–7条前肢的代表性截面。Col2-CreERt（−/−）切片没有X-gal染色（n=2个时间点）。
另请参见图S3.
这条Col2-Cre（ERt）生产线和其他许多生产线一样(希尔顿等人，2007年;Sakai等人，2001年)标记软骨细胞和软骨膜细胞及其成骨细胞后代在骨发育早期的活性，可能是通过靶向软骨-软骨祖细胞群体(图S3). 随后在E14.5处注射4OHTam，可以在很大程度上绕过肱骨的限制。我们在3天内逐步追踪标记细胞。我们的数据()表明外侧软骨-软骨界面的特定细胞有助于骨内成骨细胞池（皮质内表面的成骨细胞）(，底部，1和1′），但在生长软骨（远离骨内表面）下方的中央干骺端区域，最终成熟的软骨细胞对成骨细胞/骨细胞池没有明显贡献(，底部，2和3）。因此，我们得出结论，初级骨化中心的成骨细胞主要来源于移位的软骨膜细胞，如Osx/LacZ+细胞。
Osx/LacZ+细胞和Col1/LacZ+细胞的分化阶段选择性
由于软骨膜Osx/LacZ+细胞进入骨骼，而Col1/LacZ+细胞几乎不进入骨骼，因此这些细胞池可能存在显著差异。在E13.5处用透射电镜（EM）标记后不久，我们仔细检查了细胞及其直接环境，使用紧邻的切片鉴定组织轮廓内的LacZ+细胞（蓝色X-gal染色）（甲苯胺蓝）()（见实验程序）。在整个研究过程中，EM分析的标记细胞根据其连续薄片中的蓝色着色进行鉴定。通过在几个分析样品中检测到X-gal反应产物作为EM上的暗细胞质沉积物，证实了EM和LacZ信息的这种细胞特异性比对的有效性().
软骨膜Osx/LacZ+和Col1/LacZ+细胞代表成骨分化的增加阶段（A） EM方法。用（A1）甲苯胺蓝、（A2）X-gal和（A3）EM分析的连续中层、横向薄片进行了对齐。比例尺，50μm。（A4），颗粒内质网中经常检测到的X-gal沉淀物的黑色堆积（箭头）证实，在连续切片的EM图像上，A2上识别的蓝色染色细胞可被明确指定为X-gal+（蓝色“+”）。
（B） 4OHTam诱导E13.5标记1天后，软骨膜Osx/LacZ+细胞（蓝色“+”）的EM图像显示为松散的灶性连接的未成熟基质细胞（B1）、早期成骨细胞（B2和B2′放大的盒子）或软骨膜血管内皮细胞（V）（B3）周围的周细胞（EC）。插图显示了整个研究过程中用作识别标准的光镜水平的蓝色Osx/LacZ+细胞。高倍镜（B3′）显示未成熟毛细血管内皮细胞之间紧密连接（箭头），缺乏基底膜，含有红细胞。比例尺，2μm。
（C） 在E13.5标记后12或24小时，通过EM对Osx/LacZ+和Col1/LacZ+细胞进行评分分析（每组分析40-47个细胞）。
（D） 12小时（D1）和24小时（D2）时具有代表性的Col1/LacZ+细胞。五、 软骨膜毛细血管。（D1）通常，基质细胞和血管周细胞（星号）没有标记，而Col1/LacZ+细胞表现为成熟的立方形成骨细胞。（D2和D2′中放大的大方框）A Col1/LacZ+骨细胞和细胞树突（箭头）。（D2和D2〃中的小盒子）成熟成骨细胞。比例尺，2μm。
（E） E14.5的组织学显示E13.5标记的LacZ+软骨膜细胞和骨领（Von Kossa，黑色）之间的关系。注意Osx/LacZ+细胞与矿化骨无关，而Col1/LacZ+细胞主要位于骨表面（放大）或嵌入骨中（箭头和插图）。比例尺，50μm。
（F） E14.5胚胎在E12.5暴露于4OHTam。注意Osx-但Col1-CreERt后肢没有X-gal染色（箭头所示）。
（G） Von Kossa染色的相应肱骨组织学。Col1/LacZ+细胞很少被发现（红色箭头）。比例尺，100μm。
（H） 在E12.5标记的Osx/LacZ+细胞的典型EM图像和在E13.5分析的细胞，显示它们在松散结缔组织中作为未成熟基质细胞出现，通常与毛细血管紧密并列（V，虚线）。插图，对齐的X-gal视图。底部放大的方框区域视图，显示细胞质过程（箭头）和缝隙连接（星号）。
（一） 在E12.5标记后24或48小时，通过EM分析对Osx/LacZ+细胞的形态进行评分，显示未成熟细胞的富集（每组分析14-17个细胞）。
（J） E12.5标记的Osx/LacZ+细胞在E16.5肱骨皮质和小梁区域的计数。棒材，平均值±SEM；n=2***p<0.001。另请参见图S4.
E14.5时，软骨膜Osx/LacZ+细胞构成异质性群体。大多数（24/40；60%）是未成熟的基质细胞，显示出大的细胞核、非常稀疏的内质网（ER）和细胞质挤出物，嵌入松散的结缔组织基质中，与类似形态的细胞有一些粘附(). 第二类定义为“早期成骨细胞”（9/40）；这些细胞具有类似基质细胞的特征，但在含有胶原的基质附近发现，并且显示出没有或有限的活性骨形成(). 只有少数Osx/LacZ+细胞的外观与成熟成骨细胞的外观一致（见下文）。有趣的是，近20%的基质细胞（10%的Osx/LacZ+细胞）出现在软骨膜血管旁。这些细胞具有明显的周细胞定位，细胞突起包裹红细胞（RBC）填充毛细血管的内皮衬里().
在标记后12或24小时对Col1/LacZ+细胞进行的平行分析显示，这些细胞都不是血管周围的、周胞样的细胞()（n=检查的46–47个细胞）。相反，它们主要是成熟的基质分泌型矿化成骨细胞和骨细胞，每个细胞都有丰富的颗粒内质网排列和/或部分或全部被类骨基质和矿化骨包围(). 常规光学显微镜证实了这些发现，因为在矿化骨领上发现了Osx/LacZ+细胞，并且这些细胞与矿化骨领无关，而Col1/LacZ+细胞主要与骨表面相关(，Von Kossa染色，黑色沉积物指示矿化）。
最早表达Osx-CreERt细胞的选择性标记和追踪
上述分析证实了我们的预期，即在E13.5，Col1-CreERt表达与成熟成骨细胞相关，而Osx-CreERt的表达与更广泛的成骨细胞系细胞相关，包括未成熟细胞。特别是这些早期细胞可能因此负责原发性骨化中心的成骨定植。为了验证这一假设，我们接下来标记了富含未成熟细胞的Osx/LacZ+群体。与内源性奥斯克斯-和第1列-基因启动子（参见图S4A–S4C)Osx-CreERt标记的时间早于Col1-CreERt标签。在E12.5注射4OHTam是导致Osx-胚胎四肢近端骨骼出现明显X-gal染色的最早时间点，但在Col1-CreERt（Tg/−）胚胎中没有出现这种染色(; 数据未显示）。E14.5的组织学显示Osx-CreERt肢体切片中软骨膜标记，而Col1/LacZ+细胞几乎无法检测到，甚至在肱骨中也无法检测到(). Osx/LacZ+细胞出现在骨领形成之前，E13.5缺乏矿化证明了这一点(图S4D，左）。这些数据表明，给予E12.5的4OHTam选择性标记的Osx/LacZ+细胞，这些细胞尚未成熟为产生I型胶原的成骨细胞。
EM分析证实，E12.5标记的Osx/LacZ+池仅由标记24小时后形态学上分类为未成熟基质细胞和早期成骨细胞的细胞组成，仅在48小时后进展为参与骨领的成熟成骨细胞池(). 早期标记的Osx/LacZ+池在位于血管上的周细胞中进一步富集（20%的筛选细胞）().
然后我们在接下来的几天里追踪这些未成熟的Osx/LacZ+细胞(图S4D). 随着初级骨化中心的发育，蓝色细胞逐渐局限于骨腔内，并与初级小梁和骨领的骨内表面日益相关(图S4D). 使用中使用的量化策略早期标记的Osx/LacZ+细胞通过E16.5（>80%）向原发性海绵体转移更多，其中不到20%的细胞位于皮质层（包括内皮层）().因此，最早表达Osx-CreERt的细胞子集代表了主要骨化中心的成骨细胞池的前体。
Osx表达前体在生长的骨骼内产生成骨细胞系细胞的全分化谱，但也包括周细胞样细胞
E16.5的组织学和EM分析表明，Osx/LacZ+细胞表现为小梁周围基质细胞、覆盖小梁表面的立方形成骨细胞、骨内成骨细胞和包裹在骨内的骨细胞(). 原位杂交（ISH）检测到，许多（尽管不是全部）Osx/LacZ+细胞现在表达内源性Col1mRNA(). 值得注意的是，所有Col1/LacZ+细胞都表达Col1 mRNA（未显示）。因此，这些追踪研究表明，最早表达Osx-CreERt的细胞，或至少是其中的一个子集，在生长骨内产生了成骨细胞谱系细胞的全分化谱，因此代表了小梁成骨细胞的真正前体。
软骨膜Osx/LacZ+细胞包括产生基质细胞、成骨细胞和发育中骨骼内的骨细胞以及周细胞的成骨细胞前体（A–C）软骨膜Osx-CreERt表达的成骨细胞前体在E12.5处标记，通过E16.5产生骨内成骨细胞（OBs）、小梁OBs和小梁周围基质细胞以及皮质骨细胞。概述部分显示在右侧。（A） 插图放大的组织学。比例尺，200μm。（B） Col1 ISH（红色信号，叠加在对比度或Hoechst图像上）。箭头，表达Col1 mRNA的Osx/LacZ+细胞；箭头，Col1-阴性Osx/LacZ+细胞；hc，软骨肥大。区域（1）和（2）来自概览图像中的框；区域（3）显示皮层细节。（C） 通过红框区域（1-4，位于右侧概述部分）的甲苯胺蓝、LacZ和EM视图进行EM分析，并在平行EM图像上用蓝色“+”标记Osx/LacZ+细胞，通过蓝色染色进行识别。底部放大视图；注意这些LacZ+细胞中的细胞质X-gal沉积。
（D） 矿化骨（“+”和箭头）上立方体Osx/LacZ+成骨细胞与含RBC的血管（V）的频繁接近。顶部，区域轮廓（（C）中的白框）和EM在（D）（1-2）和（E）（3）中分析的区域。底部，通过（左）曙红或（右）附加PECAM-1染色进行组织学检查（棕色）。注意血管直接与Osx/LacZ+成骨细胞相邻（左侧面板），或仅被梭形血管周细胞（星号）隔开，一些是Osx/LacZ+（红色箭头）（右侧面板）。
（E和F）EM（E）和PECAM-1 IHC（F）显示Osx/LacZ+细胞的周细胞定位。（E） 区域3（见D）（血管进入骨干的入口位置）的概述和放大倍数增加。箭头，EC之间的紧密连接；插图和箭头，重叠内皮下覆盖的细胞延伸。（F） X-gal、PECAM-1（棕色）和曙红染色部分的顶部、概述和放大图。血管周围Osx/LacZ+细胞的底部详细视图。另请参见图S5，使用Osx-Cre:GFP小鼠模型提供Osx表达细胞的分子特征。
通过分析E16.5处Osx/LacZ+细胞的环境，我们注意到它们通常靠近骨髓腔内的血管(). 一些已成为成熟立方形成骨细胞的细胞显示出显著的极性，其顶端有骨基质，侧面相邻的成骨细胞，基底面两侧有血管。有时内皮细胞紧邻成骨细胞，而在其他情况下，血管周细胞在其间伸展(). 事实上，其中一些血管周细胞是Osx/LacZ+细胞与内皮样周细胞并列(). 这些细胞表现出未分化细胞的形态特征，具有非常突出的细胞核、具有细长突起的小细胞体和稀疏的颗粒内质网、高尔基体和细胞器。像周细胞一样，它们的细胞进程紧紧包裹着血管内皮衬里(). 内皮细胞特异性标记物血小板/内皮细胞粘附分子1（PECAM-1）的免疫组织化学（IHC）表明，在这些血管周围位置大量发现Osx/LacZ+细胞(). 因此，除了在原发性海绵体内产生成骨细胞外，一部分以Osx表达为特征的胚胎成骨细胞前体在骨发育过程中保持未成熟特性和周细胞定位。
为了解决Osx表达细胞的分子特征，我们利用了Osx-Cre:GFP小鼠模型(Rodda和McMahon，2006年)允许基于GFP的细胞分类（指定为Osx/GFP+细胞）和视觉共定位研究（红色荧光IHC和ISH）(图S5). 同样的BAC被用于产生Osx-Cre:GFP和Osx-CreERt小鼠，Cre:GFP表达与内源性Osx mRNA表达以及Osx-CRERt标记在骨骼发育的模式和时间方面相关（参见图S4和S5). 与追踪的Osx/LacZ+细胞一样，Osx/GFP+细胞群包括广泛的成骨细胞分化谱，包括表达非胶原I型和骨桥蛋白的未成熟细胞；它们的遗传特征表明Osx和Runx2表达强烈富集(图S5A–S5D). Osx/GFP+细胞也经常出现在血管周围的直接位置，甚至在成人骨骼中(图S5E). 然而，Osx/GFP+血管周细胞并没有完全覆盖血管床，而是分散在一些血管上。由于qRT-PCR揭示了一些周细胞标记物的转录本的存在(RGS5型,SM22型、和结蛋白; 数据未显示），我们评估了Osx/GFP+或Osx/LacZ+细胞和骨切片中周细胞标记物的潜在共定位(图S5F–S5I). 虽然在少数Osx表达细胞中确实检测到了α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）、SM22、结蛋白和神经/胶质抗原2（NG2），但其存在的功能意义尚不清楚：没有标记物的表达模式与骨中血管模式的表达模式一致（后续切片上的PECAM-1染色，未显示）。因此，胚胎和成人骨骼内的血管系统很少见，因为它基本上缺乏典型的周细胞覆盖。
成骨细胞前体和血管在长骨发育中的共渗
在软骨膜中首次标记Osx/LacZ+细胞时以及追踪到骨内部后，观察到Osx/LacZ+细胞在解剖学上与周细胞相似，这一发现提出了Osx/LacZ+的血管周围定位是否是一个一致特征的问题。因此，我们检查了Osx/LacZ+细胞与整个软骨侵袭过程中的血管系统之间的空间关系。
Osx/LacZ+细胞与血管和破骨细胞紧密共定位，因为它们在肥大软骨侵入前积聚在软骨膜中()以及在最初入侵期间(). 在血管旁和血管生成前沿检测到Osx/LacZ+细胞(). 毛细血管穿过骨领的开口，作为灌注血管（充满红细胞）进入肥大的软骨核心()点缀有Osx/LacZ+细胞(). 最初的血管侵入过程和初级骨化中心的形成并不依赖破骨细胞的存在(图S6).
成骨细胞前体进入发育中的骨骼与其对软骨侵犯血管的结块作用相关（A和B）经曙红或TRAP染色的纵切面（A，底部），显示Osx/LacZ+细胞与血管（V，含有RBCs[曙红上强烈的洋红色]）和破骨细胞（箭头所示）在肥大软骨（HC）侵入之前（A）和侵入期间（B）积聚在中层软骨膜中。
（C） 利用薄横切面和中厚切面分析HC的初始侵入过程。缩写：V，容器；HC，肥大软骨；内皮细胞；红细胞，红细胞；蓝色“+”，Osx/LacZ+细胞；OCL，破骨细胞。（C1）识别Osx/LacZ+细胞的X-gal视图（上图）和（下图）分别对应于左侧和右侧的黑匣子的对齐EM图像。各面板下方显示了相应白框的进一步放大倍数。注意软骨侵入的开始，横穿骨胶原的内皮细胞显示丰富的丝状伪足延伸（红色箭头），表明新生血管萌芽。（C2）甲苯胺蓝图片，红细胞填充血管横穿骨领（虚线）。（C3）充满RBC的毛细血管萌芽进入软骨，其间散布着Osx/LacZ+细胞。（D） 在指定的时间点，PECAM-1染色Osx-CreERt和Col1-CreERt肱骨。Osx-CreERt胚胎在E12.5或E13.5（A）–（D）中暴露于4OHTam，Col1-CreERt小鼠在E13.5中接受4OHTam。
请参见图S6破骨细胞在初始侵袭中的作用。
采用PECAM-1染色的脉冲相分析显示，在软骨开挖的后续阶段，成骨细胞前体/内皮细胞持续并置，最终通过E15.5–E16.0建立初级骨化中心(，左侧面板）。尽管Osx/LacZ+细胞有规律地包裹在血管周围，但从未在管腔内观察到它们。与Osx/LacZ+前体细胞形成鲜明对比的是，Col1/LacZ+成熟成骨细胞很少或没有证据表明与侵入的血管系统有关(，右侧）。这些发现表明，成骨细胞前体进入发育中骨骼的时间与血管的侵入密切相关，表明可能存在耦合运动过程，涉及成骨细胞谱系中早期细胞特有的机制，并在高级成骨细胞分化时丢失。
骨折愈合中的血管生成和成骨耦合与Osx表达、血管相关成骨细胞前体的进入有关
鉴于控制胚胎骨发育的过程在骨折愈合过程中大体上被重新描述，我们想知道在成人骨修复环境中是否会发生类似的成骨细胞谱系细胞和血管的共渗。在证实Osx-Cre:GFP小鼠中的Osx/GFP+细胞显示出与血管共同侵入发育中的初级骨化中心，类似于在Osx-CreERt小鼠中观察到的情况()，我们使用Osx-Cre:GFP小鼠系，通过厚骨切片的共焦显微镜直接显示以核GFP为主的信号。
骨折愈合中软骨的成骨和血管同时侵袭（A） 冻存E15.5 Osx-Cre上的PECAM-1 IHC：GFP胫骨切片显示肥大软骨（HC）初始侵袭和初级骨化中心（POC）形成期间Osx/GFP+细胞（绿色，注意Cre:GFP融合蛋白的主要核定位）和内皮（红色）。PC，软骨膜。右，所示区域的放大视图。
（B） 骨折后第7天Osx-Cre:GFP小鼠胫骨骨折的厚切片分析，用PECAM-1抗体（红色）和Hoechst（蓝色）染色。顶行，5×标准显微镜下的骨痂概览（左侧；黄色，脉管系统；暗区，软骨[c]和皮质骨[b]；p，骨膜），指示共焦显微镜分析的区域（方框1-3）。右侧面板，区域1和2，显示用20倍物镜拍摄的叠加图像集的投影（另请参见电影S1–S3). 左下角，区域3，显示60×共焦图像的3D投影（另请参见电影S4). 3D红色通道（PECAM-1信号）也单独显示（黑白视图），显示了侵入前沿的内皮细胞丝足（红色箭头）。右下角，从60×堆栈中提取的单个光学切片，以及省略蓝色通道信号的放大细节，以优化Osx/GFP+核的评估。注意大量Osx/GFP+细胞立即并排在内皮衬里（箭头）和侵入前沿的尖端（箭头）。
（C） qRT-PCR分析Osx/GFP+分类细胞群（平均值±SEM；n=4）中的VEGF、Ang1和PDGFRβ，这些细胞群来源于胶原酶消化的新生Osx-Cre:GFP小鼠颅骨或长骨，与Osx-Cre:GFP阴性同窝鼠（“全裂解物”）的对照消化物相比较。视频文件(电影S1–S4)中提供了骨折愈合过程中其他时间点的叠加共焦图像和数据图S7.
成年（3个月大）Osx-Cre:GFP小鼠在覆盖未受损骨骼皮质骨表面的薄骨膜层中显示Osx/GFP表达细胞（骨折后第0天[PFD]0）(图S7A). 接下来，我们在应用于Osx-Cre:GFP小鼠的半稳定骨折模型中，在软骨内愈合过程的后续阶段监测Osx/GFP+细胞和PECAM-1+内皮细胞（红色荧光IHC）之间的关系（图示为图S7B). 如前所述，骨缺损的诱导与受损皮质骨膜的早期增殖反应有关(Maes等人，2006年). 在PFD 4的增厚骨膜中，Osx-GFP+细胞特别丰富(图S7C). 进一步的动力学研究表明，通过PFD 14，Osx/GFP+细胞对编织骨痂起着重要作用，定位于再生骨区域以及编织骨穿插的血管(图S7D).
有趣的是，在过渡期软骨内骨化过程中，软骨愈伤组织被侵入的内皮细胞浸润与Osx-GFP+细胞的共渗密切相关（PFD 7，). 成体Osx/GFP+细胞在与软骨交界的骨痂的血管化周边部分以及侵袭前沿显著丰富。共焦显微镜显示，延伸血管丛内皮周围有周细胞样Osx/GFP+细胞(;电影S1–S4). 这些数据表明，在骨发育和骨折愈合过程中，类似的机制可能支配成骨细胞前体和血管的共渗。
为了在分子水平上解决成骨细胞前体和血管系统之间的关系，我们对FACS分类的Osx表达细胞进行了qRT-PCR分析，并与未选择Osx表现的细胞制剂进行了比较（参见补充实验程序). Osx/GFP+细胞消化显示VEGF和血管生成素-1（Ang1）的表达水平增加了3到10倍，这些因子由周细胞分泌，可能调节内皮细胞的募集(). 此外，在Osx/GFP+细胞中也检测到PDGF受体PDGF-Rβ的表达，这是周细胞向内皮细胞募集的关键受体，暗示着共定位细胞类型之间的分子相互作用().
讨论
小梁成骨细胞的软骨膜起源
成骨基质和占据初级骨化中心形成小梁骨的成骨细胞的起源尚不明确。假设表明，这些细胞来源于软骨膜/骨膜、软骨细胞、通过血流输送循环祖细胞和/或周细胞(Colnot等人，2004年;Galotto等人，1994年;Kronenberg，2007年;Modder和Khosla，2008年;Roach和Erenpreisa，1996年). 在这里，我们评估了胚胎软骨膜成骨细胞系细胞的命运。我们的结果通过以下方面证实并扩展了先前的体外研究结果Colnot等人（2004）他表示，具有未知遗传特征的软骨膜细胞有助于成骨细胞发育肾包膜下植入的骨骼。通过使用小鼠Osx-和Col1-启动子驱动可诱导CreERt转基因在软骨膜成骨细胞系细胞的阶段选择性亚群中的表达，我们现在发现成骨细胞前体，而不是成熟的软骨膜成骨细胞，有能力进入发育中的骨骼并在那里分化为小梁成骨细胞（参见). 这并不一定意味着所有标记的Osx/LacZ+细胞的唯一命运就是成为成熟的成骨细胞。事实上，我们的数据表明，它们中的一个子集有助于干骺间质的形成，表现出相当未分化的表型（参见). 目前尚不清楚这些细胞是否构成储备前体细胞，这些前体细胞可以被激活后成为成骨细胞。或者，它们可能代表一个具有不同/独立命运和功能（例如造血支持）的亚群，而不是相互排斥的亚群(Wu等人，2008).
总结我们发现的模型软骨骨模型初始侵入及其转化为初级骨化中心（POC）期间发生的事件的示意图。表达Col2的软骨-大肠前体细胞（绿色）在中央生长软骨中产生细胞，在周围产生横向细胞，推测软骨膜/成骨细胞的命运。第一个定向成骨细胞谱系细胞出现在骨干肥大软骨周围的软骨膜中。这些细胞根据其成熟阶段在发育中的骨骼中显示不同的命运。以表达Osx的成骨细胞前体细胞（Osx/LacZ+，黄色）为代表的谱系早期细胞移动到发育中的POC中，并将其作为基质细胞填充，或进一步分化为成骨小梁成骨细胞。成骨细胞前体进入POC与血管（红色）和破骨细胞（蓝色）的初始侵袭相吻合，并且与前体的一个子集在内皮上的周细胞定位有关。相反，软骨膜/骨膜（Col1/LacZ+成熟成骨细胞，橙色）内分化至Col1（3.2 kb）表达阶段的细胞在血管覆盖部位没有发现，也没有转移到POC的能力。这些成骨细胞保留在皮质骨表面上和内部。
分化软骨细胞不是小梁成骨细胞的主要来源
由于最初标记的Col1/LacZ+细胞局限于软骨膜，而Osx/LacZ+细胞还包括分化软骨细胞，因此我们评估后者是否构成或促成了小梁成骨细胞池。我们使用可诱导的Col2-CreERt的数据证实，在发育早期，Col2-表达细胞包括有助于软骨内骨中软骨细胞和成骨细胞池的双功能祖细胞(希尔顿等人，2007年;Nakamura等人，2006年;Sakai等人，2001年) (图S3). 甚至后来，生长软骨周围的细胞尤其如此，沿着软骨-软骨界面显示出纵向排列（“边缘软骨细胞”）(Bianco等人，1998年)，可并入软骨膜和/或在骨内膜和骨内产生成骨细胞。相比之下，我们的数据概述于表明，在我们研究的时间跨度内，加入更多中央生长软骨的大部分的Col2/LacZ+细胞，在那里它们遵循经典的软骨细胞分化程序向肥大方向发展，不会成为中央干骺端区域（远离骨内表面）的小梁成骨细胞。
成骨细胞前体和血管对软骨的共渗作用
先前的一些实验已经探讨了血管和成骨细胞侵袭骨骼的相互依赖性。阻断软骨模板最初的血管侵入，无论是物理上、化学上还是遗传上，都会抑制初级骨化中心的形成(Colnot等人，2004年;Maes等人，2002年). 另一方面，通过灭活Runx2、Osx、β-catenin或印度刺猬，早期阻断软骨膜成骨细胞生成的几个遗传模型也显示出几乎完全没有血管侵入和原发性骨化(小森等人，1997年;Otto等人，1997年;Colnot等人，2005年;圣雅克等人，1999年;Nakashima等人，2002年;Hill等人，2005年). 总的来说，这些研究表明软骨膜成骨细胞分化，至少达到Runx2/Osx表达前体的阶段，是软骨血管侵袭所必需的。相反，通过基因或破骨细胞生成抑制剂阻断破骨细胞形成(图S6)不能阻止血管或成骨细胞的侵袭。
在我们的研究中，可以通过结合成骨细胞谱系追踪和血管内皮监测，以细胞特异性的方式密切分析这两个过程。在成骨细胞前体从软骨膜转移到新生的初级骨化中心的整个过程中，观察到一些成骨细胞系细胞与侵入的血管密切相关，而其他细胞则靠近血管，表明在骨折的骨再生过程中出现了一个耦合的运动过程（参见,).
根据我们的数据和现有文献，可以提出三个耦合假设。首先，成骨细胞前体和内皮细胞可能被肥大软骨产生的相同或同时表达的趋化因子所吸引，从而协同运动进入其核心。然而，仅仅是独立的融合并不能解释我们在运动过程中发现的部分成骨细胞前体的周细胞定位。
因此，第二种机制可能是一些成骨细胞前体利用血管作为导管来支持它们进入骨骼，正如黑色素瘤肿瘤细胞所报道的那样，这些细胞在一个称为“血管外迁移转移”的过程中沿着内皮的腔外表面迁移(Lugassy等人，2004年). 我们的研究表明，Osx表达细胞强烈表达血管生成刺激以及参与周细胞-内皮细胞相互作用的分子（VEGF、Ang1、PDGRβ）。值得注意的是，我们的研究中检测到的血管周围成骨细胞谱系细胞是否具有通常归因于周细胞的功能特征尚不确定。事实上，与大多数其他组织不同，骨的血管缺乏支持细胞的覆盖，支持细胞表达经典周细胞标记物，如αSMA（参见图S5F–S5H). 这一观察结果可能与骨髓中存在薄壁和开窗窦有关，其中反式-造血细胞发生内皮细胞迁移(Kopp等人，2005年).
第三种选择是，成骨细胞前体自身通过将血管拉入无血管软骨来触发最初的血管侵袭。这可能涉及“循环血管生成”，这是一种最近提出的机制，描述了以前无血管的愈合伤口肉芽组织的血管化，通过完整血管的生物力学移位，由肌纤维母细胞收缩拉动循环，收缩愈合伤口的肉芽组织(Kilarski等人，2009年). 我们的EM分析显示，毛细血管作为形态完整的血管侵入软骨，这些血管可能与循环相连，其管腔中有大量红细胞，成骨细胞前体位于前缘以及管腔衬里（参见). 血管丛的扩张最有可能涉及新生血管的萌芽，正如EM和（共焦）组织学观察到的从侵入血管萌芽尖端的内皮细胞延伸出的大量丝状伪足所表明的那样在胚胎发生的最初软骨侵入和和电影S4，显示了软骨内骨愈合过程中骨痂新生血管的3D投影）。众所周知，内皮尖端细胞表现出PDGF-B和VEGFR-2的特征性高表达(Gerhardt等人，2003年)可能与富含PDGFRβ和VEGF的成骨细胞谱系细胞发生串扰。
这三个假设并非相互排斥，可能会在以下模型中收敛（参见)：软骨膜中发育的成骨细胞前体与血管一起侵入未来的骨髓腔，同时以周细胞的方式与内皮细胞相关，并通过与萌芽血管和破骨细胞的前端一起迁移，挖掘软骨。成骨细胞前体与内皮细胞的相互作用可能有助于移位到晚期增生性软骨，可能是通过循环和新生血管生成的联合机制，这可能是由VEGF等刺激信号的高浓度和释放定向控制的。软骨膜中分化为成熟基质生成细胞的成骨细胞不具有周细胞特性，也不进入骨内成为小梁成骨细胞。相反，这些细胞注定要生成皮质骨。
实验程序
动物研究
Osx-CreERt2和Col1（3.2 kb）-CreERt小鼠的产生在补充实验程序Osx-Cre:GFP小鼠(Rodda和McMahon，2006年). 实验按照《实验动物护理和使用指南》进行，并得到马萨诸塞州总医院比较医学中心和鲁汶大学的批准。男性CreERt（Tg/−）；Rosa26R（R/R）小鼠与CD1雌性小鼠定时交配过夜，并在早上分离，命名为E0.5。怀孕小鼠腹腔注射2 mg 4OHTam（约50 mg/kg），逐步溶于20μl二甲基氟化物中，总体积为200μl葵花籽油。在献祭时，对胚胎进行称重，并将其切去皮肤和内脏。收集尾部或肝脏活检，通过PCR进行基因分型（参见补充实验程序). 从E15.5开始，四肢的骨骼肌被移除。使用标准方案用茜素红对选定的胚胎进行染色。使用之前详细描述的半稳定胫骨骨折模型，在3个月大的Osx-Cre:GFP小鼠中研究骨折愈合(Maes等人，2006年). 胫骨在2%PFA中固定过夜，并在0.5M EDTA中脱钙2周。
LacZ活性的X-Gal染色
将胚胎本体、器官和分离肢体在0.2%戊二醛和1.5%甲醛中室温下固定1小时，然后根据标准方案在37°C下过夜X-gal染色，并在4°C下在2%PFA中固定1天。
组织学
X-电泳样品石蜡包埋并在4μm处切片。必要时，在包埋前将骨头脱钙1–3天。切片在二甲苯中脱蜡，逐步浸泡在100%和95%乙醇中，用1%曙红Y在95%乙醇中染色5分钟，然后漂洗、脱水和贴装。按标准方法进行Von Kossa染色，然后进行曙红染色。如前所述，使用PECAM-1（CD31）（BD Biosciences）或BrdU（Harlan Sera-Lab）抗体对其他切片进行TRAP活性染色或IHC染色(Maes等人，2002年). 有关成骨细胞和周细胞标记物的IHC和ISH程序的详细信息，请参阅补充实验程序用保存Osx/GFP+信号的厚切片研究骨折胼胝体，方法是将骨骼嵌入5%低熔点的海蚀斑琼脂糖（Lonza Rockland）中，并在微米振动仪上进行100μm切片。切片用PECAM-1抗体（Cy3红色荧光检测）和Hoechst染料（蓝色核信号）染色。
成像
在配备Image Pro Plus数字成像模块的Leica MZ16立体显微镜上拍摄整个支架的图像。使用2×、4×、10×、20×、40×和100×物镜以及SPOT Advanced或Axio-vision软件，在Nikon Eclipse E800和Zeiss Axioplan显微镜上对组织切片进行成像。使用Adobe Photoshop软件对整个图像的亮度和对比度进行调整。使用0.75 N.a.20×和1.4 N.a.60×（油）物镜，在尼康Eclipse Ti-2000逆共聚焦扫描显微镜上分析厚振动切片，并使用NIS-Elements AR3.1软件获取图像堆栈和单个共聚焦光学切片。使用Image J程序（版本1.42）调整对比度和亮度，并从堆栈中合成3D投影。
LacZ阳性细胞的定量
通过计算包含大部分软骨膜的固定区域（纵向跨度345μm，集中在股骨干中部）中LacZ+和LacZ+/BrdU+双阳性细胞的数量，在E14.5肱骨切片上量化软骨膜标记（如图所示，左）。每个骨骼分析三到五个切片（每个基因型3个切片），仅包括间隔至少40μm的中央切片。增殖指数计算为LacZ+/BrdU+细胞占LacZ+细胞总数的百分比。在E16.5，LacZ+细胞在骨小梁和皮质骨区域的规定区域（210×210μm）内计数，这些区域沿着穿过骨的垂直轴居中，如图所示（右，蓝色方块）。取肥大软骨细胞区远端50μm处的小梁区，以排除连接处。对n=2–9个胚胎的每根骨骼进行3到5个切片的分析，盲目地考虑基因型。通过双边双样本t检验进行统计分析。结果表示为平均值±SEM，符号*表示p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。
EM分析
X-半乳糖染色后，骨骼完全清除周围软组织，在中间横切，固定在EM固定剂中（2.5%戊二醛，2.0%PFA，0.025%氯化钙，0.1M碳酸钠缓冲液[PH7.4]），并处理EM。样品垂直（E13.5–E14.5）或水平（E16.5）嵌入树脂中，分别创建横向或纵向截面。准备了三组连续的部分，如：（1）1μm切片用甲苯胺蓝染色15s以显示组织形态，（2）0.3μm切片放在网格顶部进行EM分析，以及3）1μm切片保持未染色以显示蓝色LacZ+细胞。将来自各个切片的信息对齐，以便对EM检查的标记细胞进行细胞特异性分析。通过EM对LacZ+细胞细胞质中X-gal反应产物沉积的识别，可以确认通过该程序正确识别每个标记细胞，作为片状分布的黑色无定形材料。样品用Phillips 301透射电子显微镜进行检查，数字图像用AMT（高级显微镜技术）CCD摄像机拍摄，放大倍数为×4500至×19500。通过根据LacZ+细胞的形态和空间特征对其进行分类进行量化：周细胞，显示血管周围的即时定位；基质细胞，显示出与骨基质没有连接，并且具有很少的ER和很少的细胞器；早期成骨细胞谱系细胞，位于胶原基质附近或之上，但仍含有有限的内质网，稀疏的质膜卷曲，没有或很少有分泌活性的证据；成熟成骨细胞，定义为位于类骨和/或矿化骨上并积极分泌基质的立方细胞；骨细胞，至少三个侧面的细胞立即被骨基质包围。
FACS分类、RNA提取和qRT-PCR基因表达分析
本文详细描述了新生Osx-Cre:GFP小鼠颅骨和长骨消化物的制备、FACS分类和qRT-PCR分析补充实验程序.
