结果
mTORC1、营养素和生长因子调节核偏心率
由于Torin1比雷帕霉素引起更多的mTORC1失活，我们寻找了可能对雷帕霉素有很大抵抗力但对Torin1敏感的mTORC依赖性表型。通过目视检查经Torin1处理的NIH3T3细胞，正如预期的那样，Torin1能有效抑制4E-BP1和S6K1、T37/T46和T389上mTORC1催化位点的磷酸化()，我们观察到它们的细胞核，包括核基质成分、层粘连蛋白A以及DNA，其圆周形状发生了显著变化(). 雷帕霉素，同时取消T389 S6K1磷酸化()对细胞核形状没有影响，这与它不能抑制T37/T46 4E-BP1磷酸化有关(). 从几何学角度来看，Torin1增加了核偏心率，这是指圆形物体的一种特性，它分别由长轴和短轴的长度、隆起（a）和近点（p）来定义(和图S1A). 用mTOR抑制剂处理的细胞核定量证实了明显的结果(); 也就是说，与雷帕霉素或载体治疗相比，Torin1导致核偏心率显著增加(). Torin1的作用很可能依赖于mTORC1，因为它敲除了mTORC2的重要成分猛禽，猛禽正向调节mTORCl信号(Hara等人，2002年;Kim等人，2002年)，增加了核偏心率，而mTORC1途径负调控因子TSC2耗竭(Goncharova等人，2002年)，降低的核离心率(). Torin1对核离心率的影响也被双PI3K/mTOR抑制剂LY294002模拟，但不被其他促进G1期阻滞的药物模拟，如双胸苷阻断或MAPK信号抑制(图S1B和S1C)这表明核偏心率是以mTORC1依赖的方式调节的，与细胞周期进展无关。
mTORC1以抗雷帕霉素的方式调节核偏心率（A） 用100 nM雷帕霉素、250 nM Torin1或载体处理NIH3T3细胞12小时后，通过免疫印迹分析所示蛋白的磷酸化状态和水平。
（B） 用100 nM雷帕霉素、250 nM Torin1或载体处理NIH3T3细胞12小时，在免疫荧光分析中检测层粘连蛋白A（绿色），与DAPI共染DNA含量（蓝色），并成像。显示了每种情况下的图解细胞核。
（C） 偏心解释。椭圆物体的偏心率是衡量椭圆形状偏离圆形的程度。数学定义，偏心率=1−2/((一/第页)+1） ，其中一是凸起处的半径，即椭圆边缘到其中心的最远距离，以及第页是指近心点的半径，即距椭圆中心最近的距离。椭圆的偏心率必须介于0和1之间；圆的偏心率为0。当偏心率趋于1时，椭圆变得更长一/第页趋于无穷大。
（D） 利用图像分析软件，基于层粘连蛋白A免疫荧光分析（B）中处理的图像，以确定核偏心率(Carpenter等人，2006年). 雷帕霉素和Torin1处理细胞的核偏心率分布与相应载体处理细胞的分布重叠。平均值。每种情况下三个独立字段的偏心值（总计>500个单元格）为：DMSO（黑色）0.630；雷帕霉素（灰色）0.628；Torin1（红色）0.704。
（E） 利用RNAi介导的对照蛋白TSC2或猛禽敲除对p53−/−MEF中TSC2和猛禽蛋白水平进行免疫印迹分析。
（F） p53−/−MEF与TSC2、猛禽或对照蛋白的敲除进行了分析，如（D）所示。每种情况下三个独立场的平均偏心值（总计>500个单元）为：shGFP（黑色）0.660；shTSC2_1（绿色）0.622；收缩器1（红色）0.705。
（G） 去除血清、血清和葡萄糖或血清和氨基酸12小时后NIH3T3细胞中T37/T46 4E-BP1磷酸化的免疫印迹分析。
（H） 用250nM Torin1处理NIH3T3细胞，或在指定时间内去除血清、血清和葡萄糖，或血清和氨基酸，如（D）所示进行分析。未处理电池的平均偏心值为0.633（虚线）。误差条表示n=3的标准误差。*表示p<0.03；#表示p<0.01。
与4E-BP1磷酸化抑制作用的相关性()联合血清和葡萄糖剥夺增加了核偏心率，类似于Torin1或猛禽击倒()以与时间相关的方式(). 而仅血清饥饿可部分抑制4E-BP1磷酸化()，核偏心率适度增加(). 这些结果表明，核偏心是一种细胞特性，由mTORC1活性和环境条件动态调节。
mTORC1、生长因子和营养素调节脂蛋白1的定位
在调查其他人之前是否观察到核偏心率的调节时，我们注意到Ned1基因产物的过度表达葡萄裂殖酵母促进这种表型(Tange等人，2002年). 这一发现令我们感兴趣，因为之前，哺乳动物Ned1同源物lipin 1被证明是以营养和生长因子刺激的、雷帕霉素敏感的方式磷酸化的(Huffman等人，2002年). 然而，当时尚不清楚脂蛋白1是否调节核偏心率，或依赖mTOR的脂蛋白1磷酸化的功能可能是什么。
因为雷帕霉素对脂蛋白1磷脂酸磷酸酶（PAP1）活性缺乏影响(Harris等人，2007年)，我们认为mTOR可能控制脂蛋白1功能的其他方面，例如其定位。引人注目的是，用Torin1处理NIH3T3或AML12肝细胞，导致重组脂质1从细胞质完全重新分布到细胞核(和图S2A). 另一方面，雷帕霉素对重组脂蛋白1的定位几乎没有影响(和图S2A)这与缺乏对4E-BP1磷酸化的影响有关(). 雷帕霉素对脂蛋白1定位缺乏影响，这与最近在3T3-L1脂肪细胞中观察到的结果不一致(Peterfy等人，2010年). 然而，由于雷帕霉素对mTORC1信号传导抑制的完整性在不同细胞类型之间差异很大(Choo等人，2008年)我们推断，这种脂蛋白1定位的差异可能是由于mTORC1在所评估的细胞类型中对雷帕霉素的敏感性不同所致。为了支持这一点，HEK-293T细胞与NIH3T3细胞不同(和)、脂蛋白1核转位和S65 4E-BP1磷酸化对雷帕霉素部分敏感(图S2B和S2C). 与重组脂蛋白1一样，Torin1或联合血清和氨基酸或葡萄糖剥夺（而非雷帕霉素）导致内源性脂蛋白1的强烈核重定位(图S2D).
脂蛋白1细胞质核分布受mTORC1、生长因子和营养素调节（A） 用100 nM雷帕霉素、250 nM Torin1或载体处理过表达FLAG-lipin 1的NIH3T3细胞8小时。然后在免疫荧光分析中对细胞进行处理，检测FLAG（绿色），并与DAPI共染DNA含量（蓝色），然后成像。
（B） 用250 nM Torin1处理过表达FLAG-lipin 1的NIH3T3细胞指定时间，并通过免疫印迹分析所示蛋白的磷酸化状态和水平。
（C） 在免疫荧光分析中处理（B）中处理的细胞以检测FLAG，并与DAPI联合检测DNA含量，然后成像。FLAG免疫反应性与DAPI染色的重叠被分析为总共>500个细胞。误差条表示n=3的标准误差。
（D） 过度表达FLAG-lipin 1的NIH3T3细胞在完全培养基中生长，或去除血清、血清和葡萄糖，或血清和氨基酸8小时，并如（A）所示成像。
Torin1对脂蛋白1核转位的影响可能需要与抑制mTORC1同时或独立地抑制mTORC2/PI3K(哈辛托等人，2004年;Peterson等人，2009年;Sarbassov等人，2004年;Thoreen等人，2009年). 为了解决这个问题，我们监测了Torin1治疗对脂蛋白1定位的时间依赖性。在急性治疗（1小时）后，与mTORC1以及mTORC2/PI3K信号的下调相关，如在该早期时间点通过T308 Akt磷酸化判断，脂质1部分积聚在细胞核中(). 然而，在随后的时间（≥3小时），尽管mTORC2/PI3K活性恢复，但脂蛋白1完全保留在细胞核中，这与mTORC1信号的持续受损有关(). 与含有完整mTORC2的细胞一样，Torin1也能在利克氏缺陷细胞中引起脂蛋白1核移位(图S2E)这与上述结果一起表明，脂蛋白1细胞质核重定位对mTORC1而非mTORC2状态有反应。
与单独的血清剥夺不同，血清剥夺结合葡萄糖或氨基酸剥夺促进了脂蛋白1的完全核积累(和图S2D). 同样，在HEK-293T细胞中，氨基酸缺失导致完全的脂蛋白1核积累(图S2F). LY294002或AMPK激活化合物AICAR强烈削弱mTORC1信号，也促进了完整的脂蛋白1核移位(图S2G). 最后，由于脂蛋白1、脂蛋白2和Pah1/Smp2的磷酸化状态受细胞周期活动的调节(Grimsey等人，2008年;O'Hara等人，2006年)，我们测试了各种细胞周期扰动是否影响脂蛋白1的定位。然而，双胸腺嘧啶阻断G1期阻滞、CDK抑制和MAPK抑制均不影响脂蛋白1的定位(图S2G). 综上所述，这些结果表明，mTORC1能积极促进脂质1细胞质保留。
mTORC1直接磷酸化脂蛋白1以调节脂蛋白1定位和核偏心
我们试图了解mTORC1调节脂蛋白1易位的机制。因为mTORC1是一种蛋白激酶，所以我们重点研究了脂蛋白1的磷酸化状态以及先前在其上发现的19个磷酸化位点(Harris等人，2007年). 在我们的质谱分析中，我们检测到19个已发表的位点中的17个以及2个新位点，S237和T335。其中9个位点属于“脯氨酸导向”基序（S/T-P）()像4E-BP1中那些被mTOR直接磷酸化的蛋白(Brunn等人，1997年;伯内特等人，1998年;Gingras等人，1999年). 我们提高了两个脯氨酸导向位点S106和S472的抗体，并使用脂蛋白1的形式确认了它们的磷酸特异性，在19个位点中的17个位点，包括S106和S672，我们将丝氨酸和苏氨酸残基突变为丙氨酸（以下称为“17xS/T->a脂蛋白1”）(图S3A). 雷帕霉素主要抑制S106脂蛋白1的磷酸化，Torin1完全抑制，这与这些抑制剂对S65 4E-BP1磷酸化的作用类似(，图S3B). 相反，S472脂蛋白1磷酸化，像T37/T46 4E-BP1磷酸化一样，对雷帕霉素基本不敏感，但对Torin 1敏感(，图S3B). 有趣的是，Torin1延长疗程（12小时），而不是雷帕霉素，会损害S237和S472脂蛋白1的磷酸化(图S3C). 与4E-BP1磷酸化类似，联合血清和营养剥夺强烈下调了脂蛋白1 S106和S472磷酸化，而单独血清剥夺仅部分抑制了这些相同部位的脂蛋白1磷酸化(). 因此，与mTORC1对4E-BP1磷酸化状态、核偏心率和脂蛋白1定位的影响类似，mTORC2活性以分级方式调节脂蛋白1的多位点磷酸化。
mTORC1-催化的脂蛋白1磷酸化调节脂蛋白1定位和核偏心（A） 脂蛋白1磷酸化位点的位置示意图。N-末端脂蛋白1保守区。CLIP，C末端脂质1保守区。NLS，核定位信号（红色）。大写的丝氨酸或苏氨酸残基（红色）表示脂蛋白1磷酸化位点，在+1位后面是脯氨酸残基。
（B） 用100 nM雷帕霉素、250 nM Torin1或载体处理转染FLAG-lipin 1的NIH3T3细胞4小时。FLAG免疫沉淀物和细胞裂解物通过免疫印迹分析特定蛋白质的磷酸化状态和水平。
（C） 转染FLAG-lipin 1的NIH3T3细胞在完全培养基中生长或去除血清、血清和葡萄糖或血清和氨基酸4小时。
（D） 过度表达FLAG-mLST8/GβL的HEK-293T细胞被表达shRNA靶向猛禽或GFP的慢病毒感染。在250 nM Torin1或载体存在下，分析FLAG免疫沉淀物对脂质1的mTOR激酶活性。
（E） 在免疫荧光分析中处理FLAG野生型、1xS/T->A、6xS/T->A和17xS/T->A脂质1过表达NIH3T3细胞，以检测FLAG并成像。
（F） 指示的FLAG标记慢病毒表达载体稳定地导入fld细胞，并在感染后5天分离RNA。所有mRNA均通过qRT-PCR测定，并归一化为36B4 mRNA水平。误差条表示n=4的标准误差。
（G） 在免疫荧光分析中处理产生的每个脂蛋白1表达细胞系，以检测层粘连蛋白A并成像。
（H） 对（G）中处理的图像进行核偏心分析，如.每种情况下三个独立场的平均偏心值（总计>500个细胞）为：催化死亡，野生型脂蛋白1（灰色）0.666；催化死亡，17xS/T->A脂蛋白1（灰色阴影线）0.671；催化活性野生型脂蛋白1（黑色）6.76；催化活性，17xS/T->A脂质1（红色）0.713。
虽然在没有猛禽的情况下，mTOR可以在体外有效地磷酸化T389 S6K1，但T37/T46 4E-BP1磷酸化需要猛禽(Hara等人，2002年;Yip等人，2010年). 因为就雷帕霉素和Torin1敏感性而言，脂蛋白1磷酸化与4E-BP1磷酸化相似()，我们试图确定脂蛋白1是否可以在S106和S472以mTORC1依赖的方式直接磷酸化，以及mTOR是否也需要猛禽磷酸化脂蛋白1。为了测试这一点，我们通过mTORC1成分mLST8/GβL分离了mTOR(Kim等人，2003年)来自对照或猛禽击倒细胞，并对纯化的脂蛋白1进行体外激酶分析。一种含有mTORC1的mLST8/GβL纯化物，但不是一种在细胞中被RNAi耗尽和/或被Torin1容易磷酸化的S106和S472脂蛋白1和T37/T46 4E-BP1抑制的猛禽(和图S3D). 我们使用凝胶过滤高度纯化的mTORC1在S106脂蛋白1上观察到类似结果(Yip等人，2010年) (图S3E). 重要的是，野生型脂蛋白1被mTORC1高度磷酸化（与mTORC1-底物S6K1相比），而其17个位点的突变实际上消除了mTORC-1磷酸化的能力(图S3F). 最后，当从细胞中纯化时，多个TORC1底物仍与TORC1结合(Lempiainen等人，2009年;Schalm等人，2003年)，我们评估了脂蛋白1的这种行为。事实上，猛禽和共同表达的猛禽和mTOR与脂蛋白1共纯化，但不与meta2或rap2a控制蛋白共纯化(图S3G). 脂蛋白1不单独与mTOR相互作用，且mTOR不增加猛禽与脂蛋白1共渗的丰度，这表明脂蛋白1通过猛禽与mTORC1相互作用。综上所述，上述数据表明mTORC1是一种真正的脂蛋白1激酶。
由于mTORC1激酶活性调节脂蛋白1的定位，我们推断脂蛋白1定位可能通过其在mTORC1-催化位点的磷酸化来调节。仅雷帕霉素敏感催化位点S106突变为丙氨酸并不影响脂蛋白1的细胞质核分布(). 然而，19个脂蛋白1位点中的6个（7个脯氨酸定向位点中的2个）突变导致部分脂蛋白1重新分布(). 最后，包括S106和S472在内的所有17个脂蛋白1位点向丙氨酸的章动足以促进脂蛋白1核的完全积累(和S3H系列). 因此，mTORC1失活通过一种机制导致核脂蛋白1的隔离，该机制要求其在许多mTORC1-调节位点进行去磷酸化。
由于17xS/T->A突变的脂蛋白1概括了mTORC1失活对脂蛋白1定位的影响，我们确定了脂蛋白1是否可能调节mTORC1对核离心率的影响。事实上，在含有脂蛋白1的细胞中，Torin1引起的核偏心率的时间依赖性增加在脂蛋白1缺乏（fld，脂肪肝营养不良）细胞中不存在(Peterfy等人，2001年) (图S3I). 接下来，我们在fld细胞中稳定表达野生型（细胞质）或17xS/T->A突变型（核）脂质1的催化活性或非活性形式。而脂蛋白1上17个磷酸化位点的突变并不影响PAP1活性(图S3J)lipin 1的催化活性也不影响其定位(图S3K)催化活性的、核定位的17xS/T->A突变体lipin 1的表达，但其催化死亡或野生型形式不足以增加核偏心率(). 这些结果表明，mTORC1对核偏心率的影响至少部分是由核定域脂质1的催化活性驱动的。
组成性去磷酸化和核定位脂蛋白1抑制SREBP依赖性转录
因为脂蛋白1调节脂质稳态(Finck等人，2006年;Han等人，2006年;Rehnmark等人，1998年)，我们感兴趣的是核定位的脂蛋白1是否有助于mTORC1调节脂质生物合成基因的表达。由于雷帕霉素对脂蛋白1定位的细胞型特异性影响，SREBP途径是一个值得研究的有吸引力的转录途径(和图S2B)让人想起SREBP靶基因表达(Duvel等人，2010年;Moule等人，1995年;Porstmann等人，2008年;夏普和布朗，2008年).
我们首先确定了雷帕霉素和Torin1在多大程度上调节了已知由SREBP-1和/或SREBP-2诱导的许多基因的mRNA表达，如脂肪酸合成酶（FASN）、乙酰辅酶A羧化酶α（ACACA）、硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）、HMG-CoA还原酶（HMGCR）和法尼基二磷酸合酶（FDPS）(Horton等人，2003年). 以时间依赖性的方式，Torin1强烈下调了我们检测的所有SREBP靶点，但雷帕霉素在最近一个时间点在降低这些相同靶点的表达方面基本无效(). Torin1和雷帕霉素均未降低SREBP-1 mRNA，而两种抑制剂均在相当程度上下调了SREBP-2 mRNA(图S4A).
mTORC1调节的脂蛋白1重定位对于抑制SREBP依赖性转录是必要的（A） 用100 nM雷帕霉素、250 nM Torin1或载体处理NIH3T3细胞指定时间。所有mRNA均通过qRT-PCR测定，并归一化为36B4 mRNA水平。误差条表示n=4的标准误差。*表示p<0.04；#表示p<0.02。
（B） NIH3T3细胞在完全培养基中生长，去除血清、血清和葡萄糖或血清和氨基酸12小时。所有mRNA的分析如（A）所示。误差条表示n=4的标准误差。*表示p<0.02；#表示p＜0.03。
（C） 用250 nM Torin1或载具处理野生型或fld MEF指定时间。通过qRT-PCR测量所有mRNA，并将其归一化为36B4 mRNA水平。*表明p＜0.02。
（D） 野生型或fld MEF被剥夺血清或血清和氨基酸8小时。如（C）所示对所有mRNA进行分析。*表示p<0.01。
（E） 指示的FLAG标记慢病毒表达载体稳定地导入fld细胞，并在感染后5天分离RNA。所有mRNA的分析如（A）所示。*表示p<0.007。
（F） 将HepG2细胞与含有转录活性、截短形式SREBP-1的表达构建物以及含有与荧光素酶cDNA相连的FASN或SCD1基因的SREBP-1-responsive启动子的构建物共同转染，并用20 nM雷帕霉素、250 nM Torin1或载体处理4小时。将每个启动子活性报告者的荧光素酶测量值标准化为SREBP-1转染的载体处理细胞的荧光素酶测量值。*表示p<0.001；#表示p<0.01。
（G） 如（F）中所述共同转染的HepG2细胞额外转染空载体、野生型脂蛋白1或17xS/T->A脂蛋白1。*表示p<0.0001；#表示p<0.02。
与Torin1的作用类似，与完全培养基中生长的细胞或仅去除血清的细胞相比，血清和葡萄糖或氨基酸剥夺强烈下调了SREBP靶基因的表达(). 与这些mTORC1调节输入在脂蛋白1定位上的差异强度相关，这些结果表明，细胞质脂蛋白1向细胞核的再分配可能在mTORC 1调节SREBP靶基因表达中起重要作用。为了验证这一点，我们监测了野生型和fld细胞中存在或不存在Torin1的SREBP靶mRNA水平。Torin1使脂蛋白1完全进入细胞核的时间点()，fld细胞对Torin1对SREBP靶表达的影响完全不敏感()无差异调节SREBP-1 mRNA水平(图S4B). 补充这些发现，脂蛋白1缺乏阻止了氨基酸剥夺引起的SREBP靶基因表达减少().
我们测量了fld细胞中SREBP靶基因的表达，在fld细胞内，我们稳定表达野生型或组成性去磷酸化、核定位的17xS/T->A突变体脂蛋白1。虽然野生型脂蛋白1对SREBP靶mRNA水平几乎没有影响，但17xS/T->A脂蛋白1突变体以依赖于其催化活性的方式抑制了SREBP的所有靶点(). 由于mTORC1和脂蛋白1可能独立于SREBP本身控制SREBP靶mRNA水平，因此我们测量了mTORC 1和脂素1对FASN和SCD1启动子活性的影响，这些启动子活性由一种截断的、核定位的、转录活性形式的SREBP-1驱动(Shimano等人，1996年). Torin1和雷帕霉素对内源性FASN和SCD1 mRNA表达的影响()，Torin1强烈削弱SREBP-1诱导的、FASN和SCD1启动子的活性，而雷帕霉素更温和地削弱了这些报告者的活性(和图S4C). 类似地，17xS/T->A脂蛋白1与野生型脂蛋白1不同，它能有效下调FASN和SCD1启动子的活性(). 这些结果表明，脂质1对于调节mTORC1抑制对SREBP转录活性的影响是必要的，也是充分的。
脂质1介导mTORC1对核SREBP蛋白丰度的依赖性调节
因为mTORC1促进成熟细胞核的表达(Duvel等人，2010年;Porstmann等人，2008年)以及SREBP-1蛋白的截短的组成活性形式(图S4C)，我们询问脂蛋白1是否可以调节mTORC1对核SREBP蛋白水平的影响。在Torin1处理的细胞的核提取物中，SREBP蛋白水平仅在处理4小时后就基本消失，并在12小时内保持在非常低的水平(). 相反，雷帕霉素仅在所有测试时间点轻微降低核SREBP蛋白水平，且两种抑制剂均未下调细胞质SREBP-1水平(). 在多种细胞类型中敲除SREBP-1强烈下调SREBP靶基因表达和SREBP-2 mRNA表达(Duvel等人，2010年) (图S5A和S5B)表明mTORC1抑制导致胞质SREBP-2蛋白水平降低()可能是由于SREBP-1对SREBP-2mRNA水平的mTORC1依赖性调节。与给予完全培养基或仅剥夺血清的细胞相比，联合血清和葡萄糖或氨基酸剥夺也会强烈下调核SREBP蛋白水平(). 证实了这些发现的普遍性，在HEK-293T细胞中，Torin1或氨基酸饥饿强烈降低核SREBP蛋白的表达(图S5C和S5D). 为了测试脂蛋白1在调节mTORC1对核SREBP蛋白的影响中的作用，我们评估了Torin1治疗后野生型和脂蛋白1缺陷细胞的核SREBP水平。在含有脂蛋白1的细胞中，fld细胞对Torin1对核SREBP蛋白水平的影响具有高度抵抗力(). 为了评估脂蛋白1的mTORC1控制定位是否对这些影响至关重要，我们测量了表达野生型或17xS/T->A突变型脂蛋白1细胞的核SREBP蛋白水平。17xS/T->A突变体，但不是野生型脂蛋白1或控制蛋白meta2，抑制了多种细胞类型中核SREBP蛋白的表达(，图S5E和S5F). 综上所述，这些结果确立了组成性去磷酸化的核形式的脂蛋白1，这对于调节mTORC1抑制对核SREBP蛋白表达的影响是必要的和充分的。
组成去磷酸化的核脂蛋白1降低核SREBP蛋白丰度（A） 用20 nM雷帕霉素、250 nM Torin1或载体处理NIH3T3细胞指定时间，分离细胞质和核部分，并通过免疫印迹分析指定蛋白的水平。
（B） NIH3T3细胞在完全培养基中培养，或去除血清、血清和葡萄糖，或血清和氨基酸4小时，并按（A）进行分析。
（C） 用250 nM Torin1或载具处理野生型或fld MEF指定时间，并按（A）进行分析。
（D） 将指示的FLAG标记慢病毒表达载体稳定地导入NIH3T3细胞，并如（A）所示进行分析。
（E） 用250 nM Torin1或载体处理过表达FLAG-SREBP-1的NIH3T3细胞8小时。然后在免疫荧光分析中对细胞进行处理，检测FLAG（红色）、层粘连蛋白A（绿色），并与DAPI共染DNA含量（蓝色），然后成像。
（F） 在免疫荧光分析中处理共表达HA-SREBP-1和野生型或17xS/T->A突变型脂蛋白1的Fld细胞，以检测HA（红色）、层粘连蛋白A（绿色），并与DAPI共染以检测DNA含量（蓝色），并成像。
越来越多的研究表明，A型层粘连蛋白与转录调节因子共定位(Johnson等人，2004年;Wilson和Foisner，2010年). 然而，关于这些转录因子的定位是如何调节的，我们知之甚少。因为mTORC1依赖于脂蛋白1定位的变化强烈改变了含有层粘连蛋白A的核基质的结构，并且层粘连分子A已知与SREBP结合(Lloyd等人，2002年)，我们考虑了SREBP的定位是否在mTORC1和脂蛋白1依赖性调节其核耗竭中重要。在未经处理的细胞中，全长SREBP-1和SREBP-2在整个细胞中呈弥散分布，与之前的报告一致(和S5F系列)(Wang等人，1994年). 引人注目的是，在Torin1存在的情况下，SREBP-1和SREBP-2的整体免疫染色强度降低，这与我们的分级研究一致(和S5C系列)但同时在核外围富集(和S5G系列)并与层粘连蛋白A部分共定位(). 组成核17xS/T->A脂蛋白1的表达(图S5H)与野生型脂蛋白1相反，还引起了核SREBP-1的显著转换，这与残余SREBP-1与层粘连蛋白A部分共定位有关(和S5H系列). 有趣的是，在SREBP免疫染色中，这些mTORC1-和脂蛋白1-调节的变化类似于在表达脂肪营养不良引起的层粘连蛋白A突变的细胞中看到的变化，或在接受脂肪营养不良诱导药物治疗后改变层粘连素A分布的细胞中发现的变化(Capanni等人，2005年;Caron等人，2003年). 因此，SREBP核丰度的mTORC1-和脂蛋白1-依赖性变化与其在核外周向层粘连蛋白A附近的再分配相关。
mTORC1对小鼠SREBP通路和脂质稳态的影响需要脂蛋白1
为了在生理学意义上测试mTORC1和脂蛋白1在调节SREBP通路中的作用，我们在白蛋白启动子的控制下，通过表达Cre重组酶，删除了漂浮猛禽小鼠出生后肝脏中的猛禽(Sengupta等人，2010年). 我们首先证实，S106和S472脂蛋白1磷酸化受肝细胞中mTORC1调节输入的调节，并且在白蛋白-CRE+的肝脏中，猛禽表达、mTORCl和PI3K/Akt信号被特异性改变；漂浮的猛禽小鼠（Li-Rap击倒对手) (图S6A、S6B和). 令人惊讶的是，尽管其肝脏中的mTORC1/PI3K信号传导受到强烈干扰，但Li-Rap击倒对手发育正常且在4个月大时体重与野生型对照（Ctrl）小鼠相当(图S6C). 因此，我们挑战了野生型和Li-Rap击倒对手高脂肪和高胆固醇“西方”饮食的老鼠。猛禽减少的影响现在已经很清楚了：与两组以相似速度增加体重的食物喂养不同，西方饮食喂养的Li-Rap击倒对手尽管食物摄入量相似，但小鼠的体重增加量明显低于野生型动物(图S6C和S6D). 西方饮食中的禁食肝脏，但不包括饮食中的Li-Rap击倒对手与对照组禁食小鼠的肝脏相比，小鼠的体积大大缩小，外观不太黄，细胞内液滴也不规则(). 接下来，我们测量了野生型和Li-Rap饮食中SREBP靶基因的表达击倒对手老鼠。正如预期的那样，尽管在西方饮食中，尤其是在FASN中，FASN和HMGCR的表达受到了猛禽损失的抑制(). 与饮食相比，西部野生型动物的肝脏甘油三酯和血浆胆固醇的升高也在很大程度上被猛禽的减少所阻止()结果，尤其是在SREBP-1c基因敲除小鼠中观察到的现象学(Kalaany等人，2005年).
肝脏特异性猛禽基因敲除反应（Li-Rap击倒对手)高脂肪高胆固醇（西方）饮食的小鼠对脂蛋白1具有依赖性（A） Control（漂浮猛禽；Albumin-CRE−，缩写为Ctrl）和Li-Rap击倒对手（漂浮猛禽；Albumin-CRE+）隔夜饥饿进食，再喂养45分钟。制备肝脏和肌肉组织裂解物，并通过免疫印迹分析特定蛋白质的磷酸化状态和水平。
（B） 控制和Li-Rap的代表性1x或20x图像击倒对手食物和西方饮食小鼠的肝脏。
（C） 分离肝脏组织，并从喂食其各自食物6-8周的指定小鼠中提取RNA。在收获肝脏之前，所有小鼠都被饥饿了4小时。所有mRNA均通过qRT-PCR测定，并归一化为36B4 mRNA水平。误差条表示n=4–6的标准误差。C、 周，W，西部。*表示p<0.02，#p<0.04^分别为p<0.05。
（D） 从喂食指定饮食6-8周并在采集样本前饥饿4小时的小鼠身上获得提取脂质的肝组织和用于胆固醇测量的血浆。误差条表示n=4（肝甘油三酯），n=6（血浆胆固醇）的标准误差。*表示p<0.004，#表示p<0.05。
（E） 西方饮食控制和Li-Rap击倒对手感染了表达靶向lacZ或lipin 1的shRNAs的腺病毒。感染后5天收获肝脏，制备裂解物，并对指示的蛋白质进行免疫印迹。
（F） mRNA的分离和分析如（C）所示。*表示p<0.01，#在比较LacZ shRNA和lipin 1 shRNA处理的Li-Rap时，表明p<0.05击倒对手老鼠。
（G） 肝甘油三酯和血浆胆固醇如（D）所示。*表示p<0.05，#表示p<0.05。
我们怀疑脂蛋白1在Li-Rap抵抗中起重要作用击倒对手由于fld成纤维细胞对Torin1对SREBP靶基因表达的影响具有抵抗力，动物受到了西医引起的一些表型后果(). 事实上，使用两种不同的腺病毒传递shRNAs来合成脂蛋白1，我们从西方饮食喂养的Li-Rap的肝脏中耗尽了脂蛋白1击倒对手老鼠()这在很大程度上将SREBP靶基因的表达恢复到了对照小鼠的水平(). 相应地，西方饮食Li-Rap中肝甘油三酯和血浆胆固醇的水平击倒对手与对照组小鼠相比，在脂蛋白1被击倒后，小鼠也再次升高(). 因此，肝脏中的SREBP途径由mTORC1以一种与脂蛋白1相反的方式进行正调控，这种调控对于长期高脂肪和高胆固醇喂养导致的肝脏脂肪变性和高胆固醇血症的发展至关重要。
讨论
我们的发现揭示了mTORC1如何调节SREBP转录活性，并与mTORC1-mediated lipin 1磷酸化缺失促进其核进入并促进核SREBP蛋白下调的模型一致(). 这个模型为未来的探索提供了几个有趣的途径。关于mTORC1在调节脂蛋白1磷酸化依赖性变化中的作用，确定每个脂蛋白1磷酸化酶位点的相对雷帕霉素敏感性将是有趣的。由于S472脂蛋白1磷酸化似乎部分对雷帕霉素敏感()，这可能和我们表征的其他位点并不代表在多位点脂蛋白1磷酸化过程中被mTORC1修饰的关键雷帕霉素耐药位点。然而，多个脂蛋白1位点至少部分对雷帕霉素耐药(，图S3B和S3C)六个脂蛋白1磷酸化位点的突变导致部分脂蛋白1核移位()对严格的分级磷酸化模型提出了另一个结论。也就是说，雷帕霉素与Torin1对脂蛋白1功能的差异作用可能反映了Torin1在mTORC1靶向的多个位点上更广泛地去磷酸化脂蛋白1的加性效应。目前还不清楚mTORC1/lipin 1如何调节SREBP核蛋白水平。有趣的是，随着mTORC1失活或核定位脂蛋白1的表达，我们经常观察到残留的SREBP作为聚集物靠近层粘连蛋白A(、和S6G系列)其形态和定位类似于溶酶体(Yu等人，2010年). 众所周知，mTORC1独立于蛋白酶体调节核SREBP水平(Duvel等人，2010年)未来，探索溶酶体再摄取自噬过程是否参与调节SREBP mTORC1-和脂蛋白1-的转换将是一个有趣的研究。
SREBP转录活性的mTORC1/lipin 1依赖性调节模型
有趣的是，mTORC1和脂蛋白1依赖性的核离心率变化与其对SREBP转录活性的影响相关，因为核基质的结构成分之一层粘连蛋白A与SREBP途径有几个已建立的联系：（1）层粘连蛋白A与SREBP-1和SREBP-2相互作用，其过度表达下调脂肪生成性SREBP靶点PPARγ2的mRNA表达(Boguslavsky等人，2006年;Lloyd等人，2002年); （2） 人类层粘连蛋白A突变通常会导致脂肪营养不良，这种疾病的特征是脂肪组织异常，在脂肪细胞特异性SREBP-1过度表达的小鼠中也可以看到这种情况(Capell和Collins，2006年;Shimomura等人，1999年). 由于我们未能检测到脂蛋白1和SREBP-1之间的物理相互作用（数据未显示），未来测试脂蛋白1是否可能通过更间接的机制调节核SREBP蛋白，例如通过其对核膜的影响，将是令人兴奋的。
因为mTORC1促进脂肪生成并抑制葡萄糖摄取(Duvel等人，2010年;Jiang等人，2008;Porstmann等人，2008年)令人好奇的是，雷帕霉素已知会引起代谢综合征的许多特征：高脂血症、高胆固醇血症和人类和小鼠的胰岛素抵抗(Blum，2002年;坎宁安等人，2007年). 考虑到我们发现雷帕霉素和Torin1在调节脂质1和SREBP方面的作用存在差异，显然需要进一步检查各种mTORC1抑制剂对细胞和器官脂质和葡萄糖稳态的差异强度。通过这些工作，应该可以确定有效的mTORC1抑制剂是否可以作为代谢综合征的潜在治疗药物。
实验程序
材料
试剂来自以下来源：圣克鲁斯生物技术公司的mTOR、层粘连蛋白A或层粘连蛋白质A/C抗体（sc-20680，sc-6215）、SREBP-1（sc-13551）；来自Cell Signaling Technology的兔抗磷酸-S106脂蛋白1、磷酸-S472脂蛋白1和磷酸-T389 S6K1（类别号9234）、磷酸-T37/T46 4E-BP1（类别号2855，T36/T45用于小家鼠）、磷酸-S65 4E-BPl（类别号9451）、T308 Akt（类别编号2965）的多克隆和单克隆抗体；来自Abcam的兔抗SREBP-2多克隆抗体（ab30682）；先前描述了脂蛋白1抗体(Huffman等人，2002年). GST-4E-BP1之前有描述(伯内特等人，1998年). 之前描述过Torin1(刘等人，2010;Thoreen等人，2009年)由Nathaniel Gray（哈佛医学院）提供。
核偏心率和脂蛋白1核质比测量
用CellProfiler测量核偏心率(网址：www.cellprofiler.org)使用10x图像对层粘连蛋白A免疫染色鉴定的细胞核进行偏心测量。用CellProfiler定量FLAG-lipin 1核比例如下：光照校正后，用DAPI染色自动识别细胞核；通过将细胞核边缘向各个方向扩展20像素来定义细胞质室；然后将核比例测量为核强度/（核+细胞质强度）。更多mTORC1/SREBP/lipin 1/laminA分析可在网址：www.onarbor.com.
免疫荧光检测
25000–100000个细胞被镀在涂有纤维连接蛋白的玻璃盖玻片上，用4%多聚甲醛固定，并用0.2%Triton X-100渗透。将可渗透细胞封闭在0.25%BSA PBS中，与第一抗体（FLAG、HA和/或层粘连蛋白A sc-20680）在封闭缓冲液中在4°C下孵育过夜（用于检测脂蛋白1和/或层粘连蛋白A）或在室温下孵育2小时（用于检测SREBP-1或SREBP-2和层粘连蛋白A或脂蛋白1），然后在室温下与二级抗体（在1:1000的封闭缓冲液中稀释）孵育1小时。在上述所有步骤之间使用2-4×PBS洗涤液。使用含有DAPI（Vector Laboratories）的Vectashield将盖玻片安装在载玻片上，并使用落射荧光显微镜用10倍或63倍物镜成像。
基因表达分析
从在指定条件下生长的细胞中分离总RNA并进行逆转录。将得到的cDNA在无DNA的水中（1:20）稀释，然后通过实时PCR进行定量。使用Applied Biosystems 7900HT Sequence Detection System v2.3软件测量mRNA转录水平。所有数据均表示为目标基因表达与看家基因36B4和/或GAPDH之间的比率。将每个处理过的样品归一化为相同细胞类型的载体对照水平。
细胞质核分馏
对于核SREBP分馏研究，将蛋白酶颗粒添加到NE-PER缓冲液（Thermo Fischer Scientific）中，并根据制造商的协议制备核提取物。通过混合匹配的细胞质组分和核组分制备全细胞裂解物。
肝甘油三酯的测定
肝脏切片（25–50mg）在900μl 2/1氯仿/甲醇混合物中均质。将匀浆与300μl甲醇混合，旋转并以3000 rpm离心15分钟。将412.5μl上清液转移到新的玻璃管中，添加200μl三氯甲烷和137.5μl 0.73%氯化钠，将所得混合物涡流30秒，并以5000 rpm离心3分钟。丢弃上相，并添加400ul 3/48/47氯仿/甲醇/氯化钠（0.58%）混合物以清洗下相，并以5000 rpm离心3分钟。清洗3次后，蒸发下相并将其重新悬浮在1ml异丙醇中。使用标准检测试剂盒（Infinity）测定甘油三酯水平™根据制造商的说明，热电科学公司生产的甘油三酯试剂TR22421）。肝甘油三酯根据肝段重量正常化。
血浆胆固醇含量的测定
从尾静脉血中获取小鼠血浆，用EDTA螯合，以5000 rpm离心10分钟，以去除红细胞。使用标准检测试剂盒（Infinity）测定血浆胆固醇水平™胆固醇试剂TR13421）。
