TRPP2通道通过钙调节细胞凋亡²⁺内质网中的浓度

TRPP2定位于ER并减少Ca²⁺从细胞内储存释放

在人胚胎肾（HEK）293细胞中表达的TRPP2的间接免疫荧光显示，该蛋白的细胞内网状分布与BAP31.GFP共同定位，BAP31.GFP是ER的标志物(图2A). 为了确定TRPP2在ER中的功能，我们测量了细胞溶质Ca²⁺浓度[Ca²⁺]_c在HEK 293细胞中使用比例钙²⁺成像。基底[Ca²⁺]_c转染载体（对照）和表达TRPP2的细胞之间没有显著差异（分别为14.9±2.6 nM和14.3±2.4 nM，n个=9). 然而，ATP对嘌呤能GPCR的刺激显示Ca的振幅显著降低²⁺表达TRPP2或Bcl-2的细胞信号(图2B和C；对照组：183.31±17.75 nM，n个=9，TRPP2:92.39±8.79 nM，n个=9和Bcl-2:83.94±7.01 nM，n个=8). 由于这些实验是在细胞外Ca标称缺失的情况下进行的²⁺，胞浆Ca减少²⁺信号反映钙的减少²⁺从细胞内储存释放。我们证实了TRPP2在HEK 293细胞中的表达不会改变肌内质钙的水平²⁺ATP酶（SERCA）和Bcl-2，这两种蛋白质早先被证明影响ER-Ca²⁺内容(平通等, 2001;Pinton和Rizzuto，2006年;图2D).

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图2

TRPP2定位于ER并调节Ca²⁺发出信号。(A类)转染TRPP2和ER标记物BAP31.GFP的HEK 293细胞（中面板）用抗TRPP2抗体染色（左面板，比例尺：10μm；蓝色：用Hoechst 33342进行核染色）。(B类)呋喃-2钙²⁺测量：瞬时TRPP2或Bcl-2表达对Ca的影响²⁺从HEK 293细胞的细胞内储存释放。在缺乏细胞外钙的情况下，用10μM ATP刺激嘌呤能受体²⁺. (C类)峰值Ca时（B）的组数据²⁺增加（ATP诱导的峰值-基线）。(D类)western blotting分析转染TRPP2编码质粒或空载体的HEK 293细胞裂解液中SERCA2和Bcl-2的水平。

为了排除由于短暂过度表达的毒性而产生的细胞类型特异性效应和潜在人工制品，我们使用逆转录病毒基因转移（western blot，见图3A). 稳定表达TRPP2的HeLa细胞显示Ca显著减少²⁺G刺激后从细胞内储存释放_q个-耦合受体，确认来自爪蟾卵母细胞和HEK 293细胞(补充图1). 为了测试细胞溶质钙是否减少²⁺信号是由于GPCR信号通路中蛋白质的调节或钙的减少²⁺ER中的浓度（[Ca²⁺]_急诊室)，我们通过释放Ca绕过GPCR信号通路²⁺以受体依赖的方式从细胞内储存（在缺乏细胞外钙的情况下²⁺). thapsigargin抑制SERCA导致Ca释放²⁺由于被动泄漏，从急诊室排出。As[钙²⁺]_急诊室确定Ca的驱动力²⁺释放，细胞溶质钙的振幅²⁺增加间接反映了ER Ca²⁺内容。与对照细胞相比，稳定表达TRPP2的HeLa细胞应用thapsigargin后的峰值振幅显著降低(图3B和D；对照：184.23±22.81 nM和TRPP2型：112.64±17.08牛顿米，n个=11). 同样，Ca²⁺在表达TRPP2的HEK 293细胞中，离子载体离子霉素诱导的细胞内储存释放减少(图3C和E；控制：2.27±0.35μM，以及TRPP2型：1.01±0.10μM，n个=9). 因此，我们的数据表明TRPP2在降低ER-Ca中的作用²⁺负载。内质网钙的急性减少²⁺浓度导致电容性钙活化²⁺流入，流入(霍费尔等, 1998). 然而，以前的研究表明，ER-Ca的长期减少²⁺Bcl-2过表达水平下调电容性钙²⁺流入，流入(平通等, 2000). 我们研究了TRPP2表达对电容性钙的影响²⁺进入HEK 293细胞。在缺乏细胞外Ca的情况下，用thapsigargin耗尽储存物²⁺，在钙恢复后观察到电容性内流²⁺到镀液中。在表达TRPP2的细胞中，电容性钙²⁺入境管制明显下调(补充图2)，添加到Bcl-2和TRPP2之间的功能相似性列表中。

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图3

TRPP2降低GPCR依赖性钙释放²⁺来自ER(A类)用抗TRPP2抗体免疫印迹法检测TRPP2在HeLa稳定细胞系中的表达（对照：用空载体pLXSN产生的逆转录病毒转导的HeLa细胞；TRPP2型：用编码TRPP2的逆转录病毒转导的HeLa细胞）。分析14-3-3蛋白水平作为负荷控制。(B类)呋喃-2钙²⁺测量：HeLa细胞中TRPP2稳定表达对钙释放的影响²⁺使用thapsigargin（TG，10μM）从ER中提取。(C类)TRPP2在HEK 293细胞中瞬时表达对钙释放的影响²⁺使用离子霉素（Iono，5μM）从ER中提取。（B）和（C）中的实验是在没有细胞外钙的情况下进行的²⁺. (D类)峰值Ca时（B）的组数据²⁺增加（TG诱导的峰值−基线）(n个=11). (E类)峰值Ca时（C）的分组数据²⁺增加(n个=9).

TRPP2降低Ca²⁺ER中的浓度

细胞溶质钙的数据²⁺测量结果表明ER Ca降低²⁺浓度，但不提供实际[Ca²⁺]_急诊室为了证实表达TRPP2的细胞中ER钙浓度降低的证据，我们测量了[Ca²⁺]_急诊室直接使用基因编码的ER靶向Ca²⁺传感器（黄色Cameleon）(宫崎骏等, 1997). 钙网蛋白信号肽和KDEL序列靶向低亲和力钙²⁺传感器YC4_急诊室与TRPP2同处的ER(图4A). Cameleon染料由青色荧光蛋白（CFP）、钙调素、肌球蛋白轻链激酶（M13）的钙调素结合域和黄色荧光蛋白（YFP）组成。钙²⁺钙调素与M13的结合诱导其分子内相互作用，从而提高CFP与YFP之间的荧光共振能量传递效率。因此，可以通过在440 nm处激发CFP并记录发射比535/480 nm的变化来观察钙结合(图4B). 我们直接测量了Ca的稳态浓度²⁺通过校准比例荧光信号（单位：Ca²⁺-暴露于特定细胞外钙的渗透性'细胞（10μM离子霉素，0.5μg/ml洋地黄素）²⁺浓度(图4B). [加利福尼亚州²⁺]_急诊室在表达TRPP2的细胞中显著减少(图4B和C;对照：737.74±74.63μM，n个=16和TRPP2型：511.91±70.93μM，n个=18).

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图4

TRPP2降低[Ca²⁺]_急诊室和线粒体钙²⁺信号。(A类)针对ER的Cameleon（YC4_急诊室)与TRPP2（用抗TRPP2抗体免疫修饰）在HeLa细胞中共定位（比例尺：10μm）。(B类)YC4归一化荧光发射比（535/480nm）的校准_急诊室与空载体（对照）或TRPP2（10μM离子霉素，0.5μg/ml洋地黄素和20 mM钙²⁺或5 mM EGTA）。注意表达TRPP2（橙色虚线）的单元格中的稳态值降低。(C类)稳定态钙²⁺ER中的浓度（[Ca²⁺]_急诊室)根据（B）中描述的一系列实验计算出的对照细胞和表达TRPP2的细胞(n个分别为16和18）。(D类)以线粒体为靶点的骆驼（YC4.1_米托)在HeLa细胞中表达（比例尺：10μm）。(E类)YC4.1的荧光发射比（535/480nm）_米托在转染TRPP2或空载体（对照）（10μM组胺）的细胞中记录。(F类)峰值Ca时（E）的分组数据²⁺增加。

线粒体Ca减少²⁺信号

内质网和线粒体在物理和生理上是相互联系的(里祖托等, 1998). 钙²⁺从内质网释放的钙迅速被紧密并列的线粒体吸收。研究TRPP2对线粒体钙的影响²⁺活细胞中的动力学，一种针对线粒体的卡梅隆染料（YC4.1_有丝分裂)在HeLa细胞中表达(阿尔诺多等, 2001) (图4D). 表达TRPP2的细胞线粒体[Ca²⁺]用组胺（10μM，图4E和F)，反映了可释放Ca的减少量²⁺在ER中。

TRPP2敲除增加了可释放ER Ca的量²⁺

随后，我们研究了内源性TRPP2通道是否调节ER-Ca²⁺负荷，正如我们在TRPP2过度表达时观察到的。通过慢病毒基因转移，我们以四环素诱导的方式，生成了表达TRPP2定向（TRPP2敲除（kd））shRNA或非靶向shRNA（对照）盒的Madin–Darby犬肾上皮细胞（MDCK）多克隆系，每个细胞都结合了GFP标记。在含有5μg/ml四环素的培养基中培养TRPP2 kd细胞4天，导致TRPP2几乎完全失去表达(图5A和D). 相反，添加四环素后，对照细胞中的TRPP2水平未受影响。此外，GFP荧光信号的出现证明了shRNA盒在任一细胞系中的诱导表达(图5A). 分析在四环素存在下生长的细胞的胞浆钙²⁺使用Fura-2成像的响应。TRRP2 kd细胞的Ca振幅显著升高²⁺离子霉素刺激的瞬变(图5B)或ATP(图5C)表明TRPP2的耗竭增加了可释放Ca的量²⁺我们证实，在TRPP2缺失的细胞中，SERCA2和Bcl-2的稳态水平没有改变(图5D). 这些结果证实了我们之前通过TRPP2过度表达系统获得的结果。

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图5

MDCK细胞中TRPP2的消融降低ER-Ca²⁺泄漏并导致可释放Ca的量增加²⁺. (A类)条件表达MDCK细胞的分析TRPP2型-靶向（TRPP2 kd）或对照shRNA盒，以及GFP标记。通过western blotting分析在没有（−tet）和存在（+tet）四环素的情况下生长的细胞制备的裂解物。荧光显微镜（绿色）也观察到GFP的诱导表达。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。比例尺：10μm。(B类)Fura-2细胞溶质钙²⁺在缺乏细胞外钙的情况下，用2μM离子霉素（Iono）处理TRPP2缺失细胞（TRPP2 kd）和对照细胞后的成像²⁺显示了具有代表性的迹线和组数据（峰值−基线；n个=7). (C类)除使用10μM ATP外，实验按（B）进行(n个=6). (D类)western blotting分析对照组和TRPP2 kd细胞裂解液中SERCA2和Bcl-2的水平。(E类)用低亲和力钙负载MDCK细胞²⁺指示剂Mag-Fur-2AM和洋地黄素渗透分析钙的动力学²⁺泵入ER及其泄漏。图片显示了渗透（a）后定位于细胞内储存物中的Mag-Fura-2（340 nm波长激发）的荧光及其钙²⁺（b）和（c）重新填充之前和之后的加载状态（340/380nm比率以假彩色表示）。(F类)图表显示了Ca的变化²⁺细胞内储存物的负载状态（340/380nm比率R（右）除以最小比率R（右）₀)在对照组和TRPP2缺失（TRPP2 kd）细胞中。通过添加1.5 mM ATP和Ca开始重新加注²⁺30μM CPA抑制SERCA后观察到泄漏。最小比率R（右）₀在用离子霉素（Iono；2μM）耗尽库存后发现。(G公司)ER再填充和泄漏的统计分析n个=64个控制单元和n个=64个TRPP2-分别来自六个和七个独立测量的缺失细胞。每个细胞的钙渗漏率与R（右）/R（右）₀在CPA治疗开始时，用Excel软件将数据拟合成线性回归线(年=bx公司+一，其中b条为0.0054，一为−0.005，相关性第页=0.835（对于对照细胞）；b条为0.0038，一为−0.0032，以及第页=0.661（对于TRPP2缺失的细胞）。左边的条形图显示了两个回归斜率之间的差异及其标准误差(P（P）=0.025). 其余的条形图显示了泄漏和重新填充的平均速率及其标准误差。

接下来我们研究了TRPP2的耗竭是否影响钙²⁺通过SERCA或被动Ca泵入ER²⁺从这个细胞器泄漏。在有利于其在细胞内蓄积的条件下，用低亲和力钙指示剂Mag-Fura-2 AM负载细胞，并用洋地黄素使其质膜渗透(图5E，面板a）。在用含EGTA的缓冲液灌注细胞内储存物耗尽后，用钙重新填充储存物²⁺通过ATP和Mg激活的SERCA的作用²⁺ER-localized Mag-Fura-2的340/380荧光比率增加证明了这一点（图5E和F). 加利福尼亚州²⁺在应用ATP期间，储存物的负荷达到了稳定水平，但在用SERCA抑制剂环丙磺酸（CPA）取代ATP后，储存物负荷下降；图5F). Ca的计算速率²⁺对照组和TRPP2缺失细胞的被动渗漏与钙呈正相关²⁺CPA治疗开始时的水平(图5G)，而再充盈率和初始钙没有发现这种关系²⁺级别（未显示数据）。泄漏率对ER Ca的依赖性²⁺两个细胞群体的负荷可以拟合成具有显著不同斜率的线性回归线（对照细胞为0.0054，TRPP2kd细胞为0.0038；图5G). 此外，尽管TRPP2缺失细胞的平均泄漏率明显小于对照细胞，但它们的平均再填充率几乎相同。这些结果表明，TRPP2通道有助于钙的被动泄漏²⁺而ER又可能是可释放Ca量增加的原因²⁺在TRPP2缺失细胞中。

细胞培养、转染、病毒生产和转导

HeLa、HEK-293和MDCK细胞在37°C的DMEM中生长，DMEM补充10%的热灭活胎牛血清。用Fugene 6或磷酸钙转染细胞，转染后2-5天进行实验。逆转录病毒是通过用三种质粒（pMD-G、pMD-gp和逆转录病毒转移载体）共同转染HEK-293细胞产生的。细胞在8μg/ml聚合物存在下被感染，并用500μg/ml基因素进行筛选。如前所述，通过慢病毒基因转移产生表达四环素阻遏物tTR-KRAB和shRNA盒的MDCK细胞(Wiznerowicz和Trono，2003年).

钙²⁺成像

HeLa和HEK 293细胞被镀在30 mm玻璃盖玻片上，并安装在倒置显微镜（蔡司，Axiover 200 M，Fluar×40/1.3油浸物镜）台上的灌注室中。在室温下用Fura-2 AM（分子探针；2μM）培养细胞30分钟，然后用改良的林格溶液（mM:145 NaCl，0.4 KH₂人事军官₄，1.6 K₂高性能操作₄，1氯化镁₂，1.3钙²⁺-葡萄糖酸盐，5葡萄糖；pH 7.4）持续10-20分钟。在标称不存在Ca的情况下施用药物和激动剂²⁺.钙²⁺-游离溶液（Ca²⁺-葡萄糖酸盐被5 mM EGTA替代）在触发钙离子前30 s灌流²⁺从细胞内储存释放。Fura-2在340 nm和380 nm处交替激发，并使用基于CCD的成像系统（Cool-SNAP fx，Roper Scientific Inc.）收集并记录在510 nm处过滤的荧光，该成像系统运行Metafluor软件（分子器件）。对于每个实验，记录5-10个细胞的信号，这些信号的平均值被称为一个独立的实验。Fura-2比率（340/380nm）的校准如以下所述进行：格林基维茨等(1985). 用条件表达shRNA和GFP的MDCK细胞进行Fura-2成像的方法基本相同。然而，在这种情况下，分析中只包括具有预先确定的GFP信号中等和可比较强度的细胞（每次测量5-19个细胞）。

细胞内钙储备的再充盈²⁺并对其在渗透性MDCK细胞中的泄漏进行了分析。将10μM Mag-Fur-2 AM（Biotium）在37°C的改良林格溶液中加载细胞1小时。用细胞内缓冲液（ICB；125 mM KCl，19 mM NaCl，10 mM HEPES，1 mM EGTA，pH 7.3）短时间灌注负载细胞，并用15μg/ml洋地黄素在ICB中渗透2–3分钟。该程序去除了Mag-Fura-2的胞质部分和大部分GFP荧光。随后用ICB清洗细胞13分钟，并用含有200 nM游离Ca的ICB清洗²⁺在含有200 nM游离钙的ICB中加入1.5 mM ATP（钠盐）或30μM CPA，持续2分钟²⁺和1.4 mM MgSO₄在每个实验结束时，用2μM离子霉素在ICB中灌注细胞，以计算最小340/380比率(R（右）₀). ER Ca的最大速率²⁺荷载和泄漏是由R（右）/R（右）₀分别在6或10 s的时间跨度内计算。

[Ca的双发射比成像方法²⁺]骆驼的使用来源于宫崎骏等(1997). 使用激发过滤器和455DRLP二色镜（Chroma）在440±10 nm处激发细胞。使用滤轮（Ludl Electronic Products）交替更换两个发射滤光片（Chroma，480DF15和535DF25），在两个发射波长下对骆驼的荧光发射进行成像。荧光比的变化R（右）=（535 nm荧光强度−535 nm背景强度）/（475 nm荧光密度−475 nm背景密度），如前所述进行校准(阿尔诺多等, 2001)，使用公式

哪里R（右）_最小值和R（右）_最大值是在没有钙的情况下获得的比率²⁺饱和[Ca²⁺]分别是。K（K）_d日是表观离解常数n个是Ca的希尔系数²⁺已获得的校准曲线就地(阿尔诺多等, 2001).

细胞凋亡分析

C诱导血清饥饿MDCK细胞凋亡₂-神经酰胺或放线菌素D。药物溶剂，二甲基亚砜或乙醇（EtOH），用于对照治疗。在60μM荧光底物Ac-DEVD-AMC存在下测量细胞裂解液中的caspase 3样活性。在GeminiXS微孔板阅读器（分子器件）中，在380/460 nm的激发/发射波长下监测荧光增强45分钟。请注意，使用任一凋亡诱导剂处理的细胞中的活性不应相互比较，因为它们是在GeminiXS阅读器的不同单位上测量的。根据制造商的说明，使用Cell Death Detection ELISA Plus试剂盒（Roche）测量凋亡细胞胞质部分中的核小体数量，但不含BSA的裂解缓冲液用于测量裂解液中的总蛋白水平。

我们感谢N Demaurex、A Miyawaki、R Sandford和D Gill提供的材料。我们感谢B Wehrle和B Muller的技术援助，感谢A Köttgen、K Venkatachalam和C Borner的有益评论。这项工作得到了德意志联邦基金会（DFG）（GW）和PKD基金会奖学金（MK）的支持。