内质网内环境的变化影响细胞对凋亡的敏感性

质粒

将编码全长兔钙网蛋白和犬钙连蛋白的cDNA亚克隆到pTRE质粒中，分别生成pTRE-CRT和pTRE-CNX表达载体。这些载体被用于产生Tet-On诱导型细胞系。所有cDNA的核苷酸序列均由生物化学系DNA测序实验室使用应用生物系统DNA测序仪（373A型）进行确认。用QIAGEN柱色谱法纯化质粒DNA。

质粒和Tet-On-Calreticulin和Calnexin细胞系的建立

加利福尼亚州²⁺-磷酸法转染HeLa Tet-On细胞，使用40μg质粒DNA（pTRE-CRT或pTRE-CNX）和2μg选择质粒（pTK-Hig）。选择转染细胞在200μg潮霉素B/ml培养基中生长。用抗钙网蛋白或抗钙连蛋白抗体进行Western blotting，检测潮霉素B耐药细胞单菌落的钙网蛋白和钙连蛋白的多西环素依赖性表达。本研究选择了两种高诱导表达钙网蛋白或钙连蛋白的细胞系。这些细胞系被指定为KN1，用于诱导钙网蛋白表达，KNX2用于诱导钙连蛋白表达。

细胞培养

A1.1细胞（来自小鼠T细胞的克隆细胞系）在添加5%胎牛血清、100μM 2-巯基乙醇、2 mM我-谷氨酰胺、10 mM Hepes、pH 7.5和50 U青霉素、50μg链霉素和5μg庆大霉素每毫升。A1.1电池（5×10⁶)在每孔1 ml RPMI培养基中存在5μM合成寡核苷酸的情况下培养。使用了以下寡核苷酸：反义寡核苷酸5′-CCG CCC CGG CCC GCC自动液位计CTC CTT TCG GTG-3′，包括一个ATG起始密码子（下划线）和加扰寡核苷酸5′-GAC ACG AAC CAG CGA GGA G-3′。合成的寡脱氧核苷酸和测序引物是在生物化学系DNA测序实验室使用应用生物系统394 DNA/RNA合成器制作的。为了启动糖皮质激素依赖性凋亡，细胞在含有5%焦炭处理胎牛血清的RPMI中培养12小时，然后在含有25–500 nM地塞米松（Dex）或单独RPMI的RPMI内培养24小时。

HeLa细胞和Tet-On细胞保存在补充有10%胎牛血清、100 U青霉素/ml、100μg DME链霉素/ml和2 mM的DME中我-谷氨酰胺。DME还补充了10%四环素阴性胎牛血清用于Tet系统。向培养基中添加2μg Dox/ml以诱导Tet-On细胞系中钙网蛋白或钙连蛋白的表达。

从钙网蛋白缺乏的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分离阴极射线管 ^−/−和野生型胚胎。阴极射线管 ^−/−将野生型胚胎分离、洗涤、胰蛋白酶化30min，并在6孔组织培养板中培养。为了产生永生MEF细胞系，用编码SV-40大T抗原的pSV-7载体转染细胞(Conzen和Cole 1995). 在培养2周后，挑选永生化MEF的单个菌落并用于实验。细胞保存在含有20%胎牛血清的DME中。为了诱导细胞凋亡，将细胞与2μM、100 nM或10 nM的staurosporine孵育90分钟。然后进行Annexin-V结合试验，该试验按照制造商的建议进行，并始终包括丙啶染色试验。

免疫印迹和免疫细胞化学

用冰镇PBS清洗细胞三次，然后按照(Mery等人，1996年). 通过SDS-PAGE分离蛋白质(莱姆利1970)并转移到硝化纤维素膜(Towbin等人，1979年). 如前所述制备山羊抗钙网蛋白和兔抗钙网毒素（亲和纯化CRT283）(米尔纳等人，1991年;Michalak等人，1996年). 兔子抗ERp57抗体是D.Thomas（加拿大蒙特利尔加拿大国家研究委员会生物技术研究所遗传学小组）的慷慨礼物，使用比例为1:1000(Zapun等人，1998年). 按照以下说明进行免疫印迹(Nakamura等人，1995年). 为了分析线粒体中细胞色素c的释放，制备提取物并进行免疫印迹，如下所述(Bossy-Watzel等人，1998年;Bossy-Wetzel和Green 1999). 对KN1和KNX2细胞进行间接免疫荧光，如下所述(Opas等人，1991年). 简而言之，将KN1和KNX2细胞贴在盖玻片上，在有或无2μg Dox/ml的条件下培养24小时。用PBS清洗细胞，并用4%多聚甲醛固定。盖玻片安装在Vinol 205S中，并使用配备氪/氩激光的Bio-Rad Laboratories共焦荧光显微镜（MRC-600型）进行检查。

细胞凋亡检测

对于Annexin-V结合试验，将细胞以5×10的比例放置在6厘米的培养皿上^三/厘米²并在2μg Dox/ml存在或不存在的情况下培养24小时。为了诱导凋亡，将KN1和KNX2细胞在2μM staurosporine存在下培养90分钟，或在200 nM thapsigargin存在下培养24 h。用2μM staurosporine孵育缺钙型和野生型MEF 4 h。用PBS洗涤细胞，收获细胞，并按照制造商的建议用FITC-标记的Annexin-V孵育，并用流式细胞仪进行分析。对于TUNEL分析，将细胞以5×10的比例放置在10厘米的培养皿上^三/厘米²加入或不加入2μg Dox/ml孵育24 h。添加Staurosporine（10 nM、100 nM或2μM）4 h或4 h 30 min以诱导凋亡。或者，用紫外线或10或100μM足叶乙甙处理一些细胞1分钟以诱导凋亡。按照制造商的建议，用PBS清洗细胞，收获细胞并用TUNEL反应混合物培养。随后进行流式细胞术或荧光显微镜检查。通过DEVD-AFC裂解试验测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性(Bossy-Wetzel和Green 1999). 在含有200μM Ac-DEVD-AFC、20 mM Pipes、pH 7.2、100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1%Chaps、10%蔗糖和10 mM DTT（半胱氨酸蛋白酶缓冲液）的缓冲液中稀释50μg蛋白质提取物。在37°C下，在λ_前=400 nm和λ_{相对长度单位}505 nm。用曙红和苏木精染色细胞也可以定量细胞凋亡(Bossy-Watzel等人，1998年). 使用光学显微镜对凋亡细胞进行计数。通过细胞收缩、染色质凝集和核碎裂检测细胞凋亡。

钙²⁺测量

在KN1细胞中，总Ca²⁺以ER Ca为单位²⁺门店估计使用⁴⁵钙²⁺（10μCi/ml）如前所述(Mery等人，1996年). 用于细胞质Ca的测量²⁺浓度（[Ca²⁺]_c（c）)，电池（1.5×10⁶/ml）负载荧光Ca²⁺指示剂fura-2/AM（2μM）采取预防措施以避免染料隔离，如下所述(Mery等人，1996年). Fura-2荧光在λ_前=340纳米。测量细胞质钙的变化²⁺浓度，用1μM thapsigargin或200 nM缓激肽刺激细胞(Mery等人，1996年;Waser等人，1997年).

钙网蛋白和钙连蛋白在Tet-On诱导的HeLa细胞中的表达

为了研究钙网蛋白和钙连蛋白在细胞对凋亡敏感性中的作用，我们生成了可诱导钙网蛋白（指定KN1）和钙连素（指定KNX2）的Tet-on-HeLa细胞系。在Tet-On细胞中，当向培养基中添加多西环素（Dox）时，基因表达启动。用Dox孵育KN1和KNX2细胞，结果为2.3±0.2倍（平均值±SD；n个=4）和2.2±0.2倍（平均值±SD；n个=4）诱导钙网蛋白的表达(图3A） 和calnexin(图3B） 分别是。作为内部对照，我们测试了ERp57（一种内质网管腔伴侣）在KN1和KNX2细胞中的表达。图3A和图B表明Dox对ERp57的表达没有影响。其他ER蛋白的表达，包括BiP、ERp72、蛋白二硫异构酶、Grp94、SERCA2和InsP_三受体也不受Dox的影响（未显示）。这些细胞系的加倍时间为～20小时，不受添加Dox的影响。用Dox诱导KN1和KNX2细胞的蛋白质合成后，钙网蛋白和钙连蛋白均定位于内质网(图3C） 。细胞质、细胞核或细胞表面没有抗钙网蛋白或抗钙连蛋白抗体的免疫反应。这表明，钙网蛋白和钙连蛋白的Dox依赖性诱导导致这些蛋白在内质网中的积累增加，而不是在其他细胞内。

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图3

钙网蛋白和钙连蛋白在Tet-On诱导的HeLa细胞系中的表达。通过在2μM Dox存在下培养细胞24小时，诱导钙网蛋白（A，KN1细胞）或钙连蛋白（B，KNX2细胞）过度表达。收集细胞，用RIPA缓冲液溶解。在转移到硝化纤维素膜上的SDS-PAGE中分离10μg蛋白质，并用抗钙网蛋白（A）或抗钙连蛋白（B）抗体进行探测。通过检测抗ERp57抗体使斑点标准化。将Dox添加到KN1或KNX2细胞中，结果为2.3±0.2倍（平均值±SE；n个=4）和2.2±0.2倍（平均值±SE；n个=4）分别诱导钙网蛋白（A）和钙连接蛋白（B）的表达，如密度测定法所估计。指出了分子标记的位置。（C） 钙网蛋白和钙连蛋白在KN1（钙网蛋白诱导型）和KNX2（钙连蛋白诱导型。（上图）钙网蛋白和钙连蛋白在钙连蛋白Tet-On KNX2（钙连蛋白诱导型）中的定位。（底部）钙网蛋白和钙连蛋白在钙网蛋白Tet-On KN1细胞中的定位（钙网蛋白可诱导）。为了诱导钙网蛋白和钙连蛋白的表达，分别用Dox处理KN1和KNX2细胞24小时（+Dox）。钙网蛋白和钙连蛋白主要定位于一种类ER细胞内网络；CNX和calnexin。

诱导KN1和KNX2细胞凋亡

Staurosporine公司(Raff等人，1993年;Bertrand等人，1994年;Jacobson等人，1994年)和萨普西加金(Lam等人，1994年)两者均诱导细胞凋亡。为了研究钙网蛋白和ER在细胞凋亡中的可能参与，我们分别用Dox处理KN1和KNX2细胞，诱导钙网蛋白与钙连蛋白的过度表达。然后，我们用thapsigargin或staurosporine培养细胞，并通过Annexin-V结合或TUNEL检测细胞凋亡。Dox本身并没有诱导HeLa细胞、模拟转染对照细胞或KN1和KNX2细胞的凋亡(图4和图5（HeLa-On）。当使用thapsigargin诱导细胞凋亡时，我们发现过表达钙网织蛋白的细胞更敏感。如所示图4在用thapsigargin治疗后，钙网蛋白过度表达的细胞中Annexin-V结合更强。图5A显示，与未处理的KN1细胞相比，用星形孢菌素处理后，Dox处理的KN1细胞中的膜联蛋白-V结合也增加。这表明过度表达钙网蛋白的细胞对staurosporine更敏感。2μM和10 nM staurosporine也获得了类似的结果（数据未显示）。相反，在过表达calnexin的KNX2细胞中，对两种thapsigargin的敏感性都有小幅且统计学上不显著的降低(图4)和staurosporine(图5A） 观察到。这些结果表明，calnexin的过度表达并不影响细胞凋亡。

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图4

Thapsigargin依赖性诱导过度表达钙网蛋白和钙连蛋白的细胞凋亡。KN1和KNX2细胞分别与2μg Dox/ml（填充棒）孵育24 h，以诱导钙网蛋白和钙连蛋白的表达。用thapsigargin处理细胞，然后进行Annexin-V结合试验。HeLa-On，模拟转染Tet-On-HeLa细胞。（开放栏）未与Dox孵育的细胞；填充棒，Dox处理的细胞。100%值对应10000个单元格。数据是三个独立实验的平均值±SD。** P（P）< 0.001.

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图5

诱导过度表达钙网蛋白和钙连蛋白的细胞凋亡。KN1和KNX2细胞分别与2μg Dox/ml（填充棒）孵育24 h，以诱导钙网蛋白和钙连蛋白的表达。用staurosporine（A–D）处理细胞，然后进行Annexin-V结合分析（A和C）或TUNEL分析（B和E）。在C和D细胞中，用staurosporine培养KN1细胞，培养时间如图所示，然后进行Annexin-V结合试验（C）或TUNEL分析（D）。开放栏，细胞未与Dox孵育；填充棒，Dox处理的细胞。100%值对应10000个单元格。数据是三个独立实验的平均值±SD。在E中，KN1细胞与2μg Dox/ml（+）孵育24小时，以诱导钙网蛋白的表达。为了诱导凋亡控制或Dox处理的细胞与100 nM staurosporine（STS）或100μM etoposide孵育。制备不含线粒体的细胞溶胶提取物，用SDS-PAGE分离并用抗细胞色素c抗体进行免疫印迹(Bossy-Wetzel和Green 1999). 箭头指示细胞色素c（Cyt.c）的位置。** P（P）<0.001和* P（P）< 0.005.

TUNEL分析还评估了KN1和KNX2细胞对staurosporine的敏感性(图5B） ●●●●。与上述Annexin-V结合结果一致，我们发现钙网蛋白的Dox依赖性过度表达增加了KN1细胞对凋亡的敏感性(图5B） ●●●●。用staurosporine培养后，>30%过度表达钙网蛋白的细胞（Dox-treated KN1）为TUNEL阳性，而对照细胞仅为18%。相反，依赖于Dox的calnexin过度表达并不影响KNX2细胞对凋亡的敏感性。用星形孢菌素处理后，Dox处理的细胞和对照细胞中TUNEL阳性的细胞比例相同。

我们还对过度表达钙网蛋白的KN1细胞中staurosporine诱导的凋亡进行了时间进程分析(图5C和图D). 在与该药物孵育0–4小时后，观察到过表达钙网蛋白的KN1细胞对星形孢菌素诱导的细胞凋亡的敏感性增加(图5C和图D). 附录-V结合的时间进程(图5C） TUNEL阳性细胞的出现(图5D） 具有可比性，表明钙网织蛋白的过度表达可能影响细胞凋亡率，而不是与细胞凋亡相关的事件序列。

我们的结果表明，当KN1细胞过度表达钙网蛋白时，它们对凋亡更敏感。为了确定是否通过类似的途径在对照细胞和试验细胞中发生凋亡，我们测量了线粒体中细胞色素c的释放。用Dox诱导钙网蛋白的过度表达，然后用staurosporine或etoposide诱导凋亡。我们制备了不含线粒体的细胞提取物，然后通过免疫印迹法评估细胞色素c水平。在用staurosporine或etoposide处理的KN1细胞中，可以检测到线粒体释放细胞色素c(图5E） 。在未经处理的KN1细胞中，线粒体没有释放细胞色素c(图5E） 。在KN1细胞中，首先用Dox（过表达钙网蛋白）孵育，然后用staurosporine或etoposide处理，线粒体中细胞色素c的释放始终较高(图5E、 +Dox）。为了证实我们在Annexin-V结合、TUNEL分析和线粒体细胞色素c释放方面发现的差异，我们测量了过度表达钙网蛋白的KN1细胞胞液提取物中DEVD裂解率（caspase活性）。Dox诱导钙网蛋白表达，然后与staurosporine孵育60分钟以诱导细胞凋亡。正如预期的那样，钙网蛋白过度表达（Dox-和staurosporine-处理）的KN1细胞中的DEVD裂解（caspase）活性是单独用staurosoprine培养的K/1细胞的1.75倍。

钙²⁺KN1细胞的稳态

钙网蛋白在细胞内钙的调节中起着重要作用²⁺体内平衡(Liu等人，1994年;Bastianutto等人，1995年;Camacho和Lechleiter 1995;Mery等人，1996年;Coppolino等人，1997年;Fasolato等人，1998年;John等人，1998年;Mesaeli等人，1999年). 因此，我们研究了对钙的影响²⁺KN1细胞中过度表达钙网蛋白的动态平衡。首先，我们使用平衡加载技术来确定Ca²⁺细胞内钙含量²⁺过度表达钙网蛋白的KN1细胞中的储存被修饰(Mery等人，1996年). 对照KN1细胞含有70±10 pmol Ca²⁺/10⁶细胞（平均值±SD；n个=3）而用Dox（过表达钙网蛋白）处理的KN1细胞含有148±12 pmol的Ca²⁺/10⁶细胞（平均值±SD；n个= 3). Ca的类似增加²⁺细胞内钙含量²⁺据报告，细胞暂时存在储存(Bastianutto等人，1995年)并且稳定(Mery等人，1996年)用钙网织蛋白表达载体转染。

其次，我们使用了Ca²⁺-敏感荧光染料fura-2研究过表达钙网蛋白对[Ca的影响²⁺]_c（c）在KN1细胞中。基础细胞质钙²⁺浓度（[Ca²⁺]_c（c）)对照组和Dox治疗组的KN1细胞相似（～130±10nM；平均值±SD；n个= 3). 测量Ca²⁺与快速交换的细胞内钙有关²⁺我们使用了一种SERCA抑制剂thapsigargin(Thastrup等人，1990年). 当细胞被thapsigargin处理时，[Ca的峰值和持续时间²⁺]_c（c）对照组和Dox处理的KN1细胞（未显示）的海拔高度相当。与此相反，我们发现对照组和Dox处理的KN1细胞对缓激肽的反应不同。缓激肽引起钙释放²⁺通过激活内源性、激动剂依赖性途径从内部储存。在对照组和Dox处理的KN1细胞中，缓激肽引起[Ca的快速短暂增加²⁺]_c（c）然而，这[Ca的振幅²⁺]_c（c）过度表达钙网蛋白的细胞升高约1.5倍（620±25 nM；平均值±SD；n个=3）比对照细胞（350±20 nM；平均值±SD；n个= 3). 目前尚不清楚为什么[Ca升高²⁺]_c（c）在KN1细胞中观察到缓激肽过度表达钙网蛋白，但在thapsigargin中没有。有可能，在thapsigargin的情况下，慢钙²⁺释放允许负反馈机制，如钙的挤压²⁺通过质膜钙²⁺-ATP酶掩盖钙的差异²⁺与[Ca水平相关的释放²⁺]_c（c）测量(Mery等人，1996年).

总之，我们表明KN1细胞中钙网蛋白的Dox依赖性过度表达导致钙储存增加²⁺ER和激动剂依赖性钙升高²⁺从内部仓库释放。相反，我们发现细胞内总钙没有显著变化²⁺或以Ca为单位²⁺在过表达calnexin的KNX2细胞中释放。

我们感谢J.Chen女士的卓越技术援助。我们感谢D.Williams提供的calnexin cDNA。

这项工作得到了加拿大卫生研究院（M.Michalak、M.Opas和R.C.Bleackley）、阿尔伯塔省心脏和中风基金会（M.Michaelak）和安大略省（M.Opas）以及国家卫生研究院的拨款（D.R.Green）的支持。K.Nakamura是阿尔伯塔省传统医学研究基金会的研究员。R.C.Bleakley是加拿大卫生研究院杰出科学家，也是阿尔伯塔省传统医学研究基金会的医学科学家。M.Michalak是加拿大卫生研究院高级科学家，也是阿尔伯塔省医学研究遗产基金会的医学科学家。