临床投资杂志。2003年2月1日；111(3): 371–379.
P2Y6受体通过差异激活cAMP介导的转运介导结肠NaCl分泌
，1 ，2 ，2 ，2 ，三 ，2 ，三 ，三和4
迈克尔·科特根
1德国弗莱堡美第奇大学2德国弗莱堡阿尔伯特·卢德维格斯大学生理研究所三解剖研究所4丹麦奥胡斯C奥胡斯大学水盐研究中心生理学研究所
托马斯·洛夫勒
1德国弗莱堡美第奇大学2德国弗莱堡阿尔伯特·卢德维格斯大学生理研究所三解剖研究所4丹麦奥胡斯市奥胡斯大学水盐研究中心生理学研究所
克里斯托夫·雅各比
1德国弗莱堡美第奇大学2德国弗莱堡阿尔伯特·卢德维格斯大学生理研究所三解剖研究所4丹麦奥胡斯C奥胡斯大学水盐研究中心生理学研究所
罗兰·尼奇克
1德国弗莱堡美第奇大学2德国弗莱堡阿尔伯特·卢德维格斯大学生理研究所三解剖研究所4丹麦奥胡斯C奥胡斯大学水盐研究中心生理学研究所
赫尔曼·帕文斯特
1德国弗莱堡美第奇大学2德国弗莱堡阿尔伯特·卢德维格斯大学生理研究所三解剖学研究所，以及4丹麦奥胡斯C奥胡斯大学水盐研究中心生理学研究所
Rainer Schreiber公司
1德国弗莱堡美第奇大学2德国弗莱堡阿尔伯特·卢德维格斯大学生理研究所三解剖研究所4丹麦奥胡斯C奥胡斯大学水盐研究中心生理学研究所
塞巴斯蒂安·弗里泽
1德国弗莱堡美第奇大学2德国弗赖堡阿尔伯特·路德维希大学物理研究所三解剖研究所4丹麦奥胡斯C奥胡斯大学水盐研究中心生理学研究所
瑟伦·尼尔森
1德国弗莱堡美第奇大学2德国弗莱堡阿尔伯特·卢德维格斯大学生理研究所三解剖研究所4丹麦奥胡斯C奥胡斯大学水盐研究中心生理学研究所
延斯·莱比锡
1德国弗莱堡美第奇大学2德国弗莱堡阿尔伯特·卢德维格斯大学生理研究所三解剖研究所4丹麦奥胡斯C奥胡斯大学水盐研究中心生理学研究所
1德国弗莱堡美第奇大学2德国弗莱堡阿尔伯特·卢德维格斯大学生理研究所三解剖研究所4丹麦奥胡斯C奥胡斯大学水盐研究中心生理学研究所
通信地址：Jens Leipziger，生理学研究所，奥胡斯大学水和盐研究中心，Ole Worms Allé160，8000奥胡斯C，丹麦。电话：0045-89422826；传真：0045-86129065；电子邮件：kd.ua.if@piel. 收稿日期：2002年8月20日；2002年12月4日接受。
摘要
细胞外核苷酸是上皮细胞离子转运的重要调节因子。在这里，我们研究了核苷酸对结肠NaCl分泌的介导作用以及相关的信号转导机制。基底侧UDP诱导持续激活Cl–分泌被293B完全抑制，293B是一种cAMP刺激的基底外侧KCNQ1/KCNE3 K的特异性抑制剂+频道。因此，我们推测基底外侧P2Y6受体可增加cAMP。事实上，UDP提高了孤立地穴中的cAMP。我们发现一种上皮性P2Y6隐窝受体2+]我测量、RT-PCR和免疫组织化学。调查大鼠P2Y6升高cAMP，我们同时表达P2Y1或P2Y6受体和cAMP调节的囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）Cl–通道输入爪蟾卵母细胞。使用双电极电压钳监测核苷酸诱导的氯离子–电流。在表达P2Y的卵母细胞中1受体，ATP瞬时激活内源性钙2+-活化Cl–当前，但不是CFTR。相反，在表达P2Y的卵母细胞中6受体，UDP瞬时激活Ca2+-活化Cl–当前和随后的CFTR。CFTR分类–电流由卤化物电导序列确定。总之，我们发现基底外侧P2Y6结肠上皮细胞中的受体通过协同增加[Ca刺激持续NaCl分泌2+]我和cAMP。支持这些数据P2Y6受体刺激不同程度地激活CFTR爪蟾卵母细胞。
介绍
核苷酸是普遍存在的细胞外信号分子，可诱导广泛的生物反应(1). 细胞外核苷酸的细胞效应由P2受体介导，P2受体又分为两个家族，P2X和P2Y受体(2). P2X受体是ATP门控离子通道，而P2Y受体属于G蛋白偶联受体超家族(2). 哺乳动物P2Y家族包括P2Y1，第2页2，第2页4，第2页6，第2页11，第2页12，和P2Y13受体(2–4). P2Y受体亚型对腺嘌呤和尿嘧啶核苷酸的选择性在药理学上不同(2).
P2Y受体存在于多种上皮组织中，并被证明是离子转运的重要调节器(5–8).
哺乳动物结肠的电解质运输包括吸收和分泌过程。运输的特点是吸收氯化钠、钾+，H2O、 和短链脂肪酸(9，10). NaCl被平行的顶端Cl以电中性方式吸收–/HCO公司三–和Na+/H（H）+反转运蛋白或通过位于远端结肠的心尖ENaC通道产生电(10). 此外，结肠能够分泌氯化钠、钾+、HCO三–和粘液(10). 在某些疾病中，如溃疡性结肠炎，分泌物的增加被认为与腹泻的发病机制有关(10). 吸收主要局限于表面肠细胞，而分泌在隐窝细胞中最为明显(9). 结肠NaCl分泌遵循胃肠道和其他器官系统中几乎所有分泌腺的总体方案（图a）(11). 氯–被跨细胞传输。氯–通过基底外侧Na吸收+/2毫升–/K（K）+共同运输人。发光Cl–通过囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）Cl退出–通道，由cAMP激活(12). NaCl分泌需要基底外侧K+为管腔Cl提供必要驱动力的通道–出口。cAMP激活的KCNQ1/KCNE3 K+通道和中间电导Ca2+-激活的SK4通道被证明可以驱动分泌(13–15). 典型的分泌激动剂，如PGE2升高cAMP，激活管腔CFTR和基底外侧KCNQ1/KCNE3通道(11). 相反，毒蕈碱受体的激活增加了[Ca2+]我激活SK4渠道，提升Cl驱动力–退出(13). 两种途径的并行激活显著增加分泌(16).
ATP和UDP对结肠离子转运的影响。(一)结肠肠细胞中NaCl分泌的模型。(b条)跨上皮电压的原始记录(V（V）时间)和跨上皮电压变化（ΔV（V）时间). 上面一行显示V（V）时间电压偏转的带宽反映了跨上皮电阻(R（右）时间，参见方法）。ATP应用于基底外侧导致V（V）时间、和减少R（右）时间(c（c）)基底外侧UDP增加管腔阴性V（V）时间并且减少了R（右）时间坚持。这一效应被293B完全阻断。(d日)基底侧UDP和ATP的加性效应。(e（电子）)UDP在吲哚美辛（50μM）存在（+）和不存在（填充圈）时的浓度响应曲线。等效短路电流(我供应链)根据欧姆定律计算（见方法）。(（f）)293B（10μM）对UDP诱导的我供应链在不在场的情况下(克)消炎痛（*和§指出重大变化）。Con，控制。
最近的工作强调了通过肠腔和基底外侧P2受体对结肠离子转运的重要调节。这些包括管腔P2Y受体介导的K激活+电动钠的分泌和抑制+吸收，吸收(17，18). 此外，基底外侧P2Y1受体刺激瞬时激活NaCl分泌(6).
本研究确定基底外侧上皮P2Y6调节持续NaCl分泌的受体。与P2Y相比1受体，刺激P2Y6受体导致[Ca增加2+]我和cAMP，协同激活NaCl分泌。
方法
使用室内实验。
如前所述进行了使用室实验(17). 简单地说，移除大鼠（70–120 g）远端结肠的肌层，并将粘膜安装在Ussing室中。测量是在“开路”模式下进行的。跨上皮电压(V（V）时间)指的是浆膜侧。跨上皮抵抗(R（右）时间)根据电压偏差（ΔV（V）时间)每3秒由短电流脉冲感应（25μA，0.6秒）(19). 等效短路电流(我供应链)-电动离子传输的测量值-根据欧姆定律从V（V）时间/R（右）时间.计算的我供应链变化源于峰值。
[Ca的数字视频成像2+]我.
结肠隐窝的准备和处理如前所述(6，20). 使用了一台带有×40物镜（Fluar×40，1.3 oil；Carl Zeiss Jena GmbH）、一台单色仪（Till Photonics GmbH，Martinsried，Germany）和一台数码相机（Micromax 5 MHz；Princeton Instruments Inc.，Trenton，New Jersey，USA）的倒置显微镜（Axiover 100 TV；德国耶拿卡尔蔡司公司）。使用软件包Metamorph/Metafluor（Universal Imaging Corp.，West Chester，Pennsylvania，USA）进行图像采集和数据分析。在室温下，将地穴在10μM fura-2/AM的Ringer溶液中培养10分钟，其中添加了1.6μM pluronic F127和5 mM丙磺舒。实验使用以下浴液进行（单位：毫升/升）：145 NaCl，1 MgCl2，1.3葡萄糖酸钙，5D类-葡萄糖，0.4 KH2人事军官4，1.6 K2高性能操作4所有溶液的pH值均为7.4。作为[Ca的测量2+]我计算了345nm/380nm激发下的荧光发射比。从地穴底部和中部记录荧光信号。
细胞内cAMP的测量。
在每次实验中，使用从两只大鼠远端结肠2 cm处收集的所有隐窝。按所述分离结肠隐窝并将其分为不同组。每组由六份隐窝悬浮液样品组成。所有实验均使用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX；100μM）进行。每组结肠隐窝暴露于所示添加的药剂中3分钟。为了终止检测，快速去除上清液，并用冰镇乙醇（70%）冲洗隐窝。乙醇提取后，用ELISA测定cAMP浓度（德国布伦瑞克Amersham-Buchler）。由于所分析的隐窝的绝对数量在实验之间可能是可变的，因此我们首先计算每个实验的对照组的平均cAMP浓度。将其他条件的测量值标准化为相应实验组的平均对照浓度，并以变化百分比表示。
P2Y的克隆1和P2Y6来自分离大鼠结肠隐窝的受体。
使用QuickPrep Micro mRNA纯化试剂盒（德国弗莱堡Pharmacia Diagnostics GmbH）从大约500个分离的结肠隐窝中提取总RNA。使用RT-PCR（德国柏林生命科学公司）和DNA-聚合酶（TurboPfu；荷兰阿姆斯特丹Stratagene Europe）将总RNA转录成cDNA。采用同源性策略，使用基于任一大鼠胰岛素瘤细胞已发表序列的引物(21)（义：5′GCCTGAGTTGGAAAGAGAG 3′；反义：5’GCTTGGATCCTCCTGCCTTC 3′）（P2Y1)和大鼠主动脉平滑肌细胞(22)（第2页6)（意义：5′CGCCAGCCATGGAGCGGGGG 3′；反义：5′GGTCTCACTCTGCCTC 3′）。使用热序列酶II染料终止剂循环序列试剂盒（试剂盒编号79765；Amersham-Buchler）和Applied Biosystems Inc.373A DNA测序器（美国加利福尼亚州福斯特市）对扩增的受体DNA进行测序。
大鼠P2Y抗体的产生6受体和免疫组织化学。
兔抗大鼠P2Y C末端多克隆肽抗体6产生了受体（德国雷根斯堡戴维斯生物技术公司）。作为表位，我们从氨基酸282-298中选择了C末端。大鼠结肠经主动脉逆行灌注4%多聚甲醛，置于pH 7.4的0.1 M二羧酸缓冲液中，并在类似的固定剂中固定2小时。结肠切片脱水并包埋在石蜡中。石蜡包埋组织在旋转切片机上以2μm切割（Leica Mikrosysteme，Bensheim，德国）。对切片进行脱蜡和复水。为了揭示抗原，将切片置于添加了0.5 mM EGTA的10 mM Tris缓冲液（pH 9.0）中，并使用微波炉加热10分钟。通过在50 mM NH中培养切片来防止免疫球蛋白的非特异性结合4氯化30分钟，然后在补充有1%牛血清白蛋白、0.05%皂苷和0.2%明胶的PBS中封闭。切片在4°C下用rP2Y孵育过夜6抗体在pH 7.4的10 mM PBS中以1:10000稀释，含有0.1%Triton X-100和0.1%BSA。随后，用辣根过氧化物酶连接的山羊抗兔次级抗体（P448；DAKO A/s，Glostrup，Denmark）孵育切片，并使用3,3-二氨基联苯胺技术可视化标记。最后用迈尔苏木精对切片进行复染。在标记切片之前，将抗体与基质结合免疫肽孵育4小时，使用与未处理抗体稀释度相似的上清液进行吸收控制。免疫前血清和另一只兔子的血清按1:10000稀释。
卵母细胞的制备和注射。
爪蟾如前所述，分离并注射卵母细胞（德国汉堡Bedarfür Entwicklungsbiologie的H.Kähler）(23). 简单地说，在分离后12–24小时，向看起来健康的V–VI期卵母细胞注射30 nl含有10 ng大鼠P2Y cRNA的水1，第2页6或人类野生型CFTR。在共挤压卵母细胞中，我们首先注射人类野生型CFTR，然后在24-48小时后注射相应的嘌呤受体cRNA。注射后2至5天进行电压钳实验。
双电极电压钳。
使用世界精密仪器卵母细胞钳放大器（OOC-1；德国柏林）记录卵母细胞的全细胞电流。将微电极从硼硅酸盐玻璃毛细管（英国雷丁克拉克仪器公司）的垂直拉拔器（德国弗莱堡弗莱堡大学生理研究所）上拔出，当填充2 M KCl溶液时，微电极的电阻为0.5–2 MΩ。实验在20–22°C下进行。所有的全细胞电压钳实验都是在ND96溶液（96mM NaCl、2mM KCl、1.8mM CaCl2，1 mM氯化镁2，5 mM HEPES，2.5 mM丙酮酸钠，pH 7.4）。电压灯协议为–30、–80、–40、+60 mV（每一步1秒）。根据欧姆定律计算全电池电导。当夹持膜电压±20 mV（接近-30 mV）时，注水或未注水卵母细胞的斜率电导小于4μS。
共焦显微镜。
电压灯系统适用于配备×10物镜（Plan-Neofluar×10/0.3；Carl Zeiss Jena GmbH）的倒置共焦显微镜（LSM510；Carl蔡司Jena GmbH）。[钙2+]我用俄勒冈州绿色Bapta-1测量变化。测量后24小时，向表达嘌呤受体的卵母细胞注射25 nl俄勒冈州绿Bapta-1（1 mM，溶于含有95 mM葡萄糖酸钾、30 mM KCl、1.2 mM NaH的细胞内Ringer型溶液中2人事军官4，4.8 mM钠2高性能操作4，5 mM葡萄糖，1 mM氯化镁2，0.5 M EGTA，pH 7.2），卵母细胞染料浓度约为20μM。在安装和刺穿卵母细胞后，同时测量全细胞电流和[Ca2+]我已启动。俄勒冈州绿Bapta-1用蓝增强氩激光在488 nm处激发，其发射在水平方向500 nm处收集xy公司扫描动物杆，面向浴缸底部和物镜。序列图像通过测量单个卵母细胞的平均像素强度与时间进行分析。
溶液和化学品。
Pluronic F127、LY和fura-2/AM来自Molecular Probes Inc.（美国俄勒冈州尤金）。胶原酶来源于沃辛顿生化公司（美国新泽西州莱克伍德）。IBMX和所有其他化学品的纯度最高，分别来自Sigma-Aldrich（德国Deisenhofen）和Merck KGaA（德国达姆施塔特）。293B（反式-6-氰基-4-(N个-乙基磺酰基-N个-甲胺基）-3-羟基-2,2-二甲基chromane）由Aventis Pharma AG（德国法兰克福）提供。商用核苷酸二磷酸经常受到核苷酸三磷酸的污染。为了避免这个问题，我们按照Nicholas等人的描述，在10 U/ml己糖激酶和22 mM葡萄糖中处理ADP和UDP储备溶液1小时，结果表明UTP完全转化为UDP，ATP完全转化为ADP(24).
统计。
数据显示为平均值±SEM(n个)，其中n个指实验次数。成对或未成对t吨测试用于比较一个或不同实验系列的平均值。A类对值小于0.05表示有统计学意义。
结果
基底侧UDP激活持续性Cl–大鼠远端结肠粘膜分泌物。
在之前的研究中，我们提出了基底外侧P2Y功能表达的证据1大鼠远端结肠粘膜中的受体，通过增加胞浆钙刺激NaCl分泌(6). 在此，我们将这些研究扩展到研究大鼠结肠上皮基底外侧膜中额外P2Y受体的功能表达。图中描述了Ussing小室实验的一个典型示例，该实验旨在研究核苷酸对结肠离子转运的影响b.在添加核苷酸之前，用10μM阿米洛利管腔处理粘膜，以抑制生钠+再吸收。此外，使用基底侧河豚毒素（TTX）（1μM）来减少因神经元激活离子转运而产生的影响。阿米洛利和TTX治疗显著减少V（V）时间并且增加了R（右）时间，反映出电动离子传输的显著减少。随后，将ATP（1mM）添加到基底外侧，导致V（V）时间在ATP刺激期间，R（右）时间减少(6).
我们现在研究了基底外侧UDP作为P2Y特异性激动剂的作用6受体。和ATP一样，UDP增加了流明阴性V（V）时间同时减少R（右）时间如果从基底外侧添加。发光UDP无效(n个= 7). 在比较图中，两个核苷酸的“分泌”反应之间的一个重要差异是显而易见的ATP的作用是暂时的，UDP的作用表现为持续的分泌激活。此外，UDP的作用被KCNQ1/KCNE3 K的特异性抑制剂293B完全抑制+通道(25)而ATP介导的反应对293B不敏感（数据未显示；n个= 5). 在大鼠结肠粘膜中，K+通道被cAMP激活，并为CFTR介导的Cl提供驱动力–顶膜挤压(14，19). 令人惊讶的是，UDP的作用类似于其他结肠分泌激动剂，如血管肠肽或腺苷，它们通过升高cAMP来调节其作用(10). 大量[Ca2+]我–已证明提升激动剂通过激活PGE间接调节肠道和其他分泌组织中的NaCl分泌2生产，随后增加cAMP(26，27). 因此，我们抑制了PGE2添加UDP前30分钟用吲哚美辛（50μM）生产。图e显示了基底外侧UDP在无（EC）情况下的浓度响应曲线50：90μM）和吲哚美辛（EC50：85μM）。UDP介导的分泌反应在吲哚美辛的存在下显著降低。图f和g，总结了一系列实验。没有消炎痛，UDP（100μM）增加我供应链从-43.2±12.7到-151.9±15.8μa/cm的静止值2293B（10μM）的添加完全抑制了UDP诱导的我供应链至–50.1±11.9μA/cm2(n个= 6). 在消炎痛存在下，休息我供应链达到-17.6±9.3，UDP（100μM）增加至-40.6±11.3μA/cm2293B（10μM）再次完全抑制UDP刺激的分泌至-25.5±6.4μA/cm2(n个= 6).
此外，我们证明了ADP-和UDP-刺激的（100μM）Cl的可加性–分泌物；我供应链仅增加UDP：32.8±9.54μA/cm2。随后添加的ADP增加我供应链再增加18.9±5.2μA/cm2(n个= 5). 当添加UDP（100μM）和ATP（500μM）时，获得了类似的结果(n个= 6). 原始实验如图所示d。
根据这些结果，我们得出以下假设：（a）除了先前描述的基底外侧P2Y的表达外1受体，大鼠结肠隐窝细胞也表达基底外侧UDP敏感性P2Y6受体。（b） 该受体的激活介导持续的NaCl分泌。（c） 此P2Y6受体激活的分泌通过协同增加[Ca介导2+]我和cAMP。
UDP增加胞浆钙2+在结肠隐窝里。
随后，我们研究了UDP对结肠离子转运的影响是否由结肠肠上皮细胞表达的受体介导。因此，我们测量了[Ca2+]我在完整的结肠隐窝中。在图中结果表明，UDP（100μM）和ATP（100μM）均显著增加[Ca2+]我UDP使fura-2的荧光比（345nm/380nm）从1.15±0.04可逆地增加到1.23±0.04(n个= 23). ATP可逆地将fura-2比率从1.16±0.04提高到1.82±0.12的峰值(n个= 23).
(一)孤立结肠隐窝中呋喃-2荧光比率测量的原始记录。镀液中的UDP（100μM）和ADP（100µM）都会导致[Ca的增加2+]我(b条)UDP诱导的（100μM）和ADP诱导的对胞浆钙的影响概述2+在孤立的结肠隐窝中*ATP或UDP引起的显著变化。(c（c）)不同激动剂对cAMP生成的影响。所有实验均在IBMX（0.1 mM）存在下进行*与控制的显著差异(对> 0.05).
大鼠结肠隐窝中cAMP的测定。
此外，我们测量了离体大鼠结肠隐窝中静息和刺激cAMP的浓度。数据汇总如图c.作为阳性对照，我们使用PGE2和forskolin，已知能增加结肠肠细胞cAMP的激动剂(28). UDP、PGE使cAMP浓度分别显著升高至140%±5%、151%±15%和2149%±13%2和forskolin。ATP介导的cAMP小幅度增加不显著。
P2Y的免疫组织化学定位6大鼠结肠粘膜中的受体。
图a显示了大鼠P2Y的免疫组织化学定位6大鼠结肠远端粘膜中的受体。很明显，rP2Y6抗体标记粘膜上皮和奇异的粘膜下层细胞。与兔血清孵育后，标记了单一的粘膜下细胞，表明这些细胞中IgG的非特异性结合（插入图a） ●●●●。rP2Y的特异性粘膜染色6大鼠近端小管（S1至S2）中的基底外侧染色通过相同的抗体进一步加强了受体，最近描述该组织表达P2Y6受体（我们未发表的观察结果）(29).
大鼠结肠的免疫组织化学。rP2Y6-抗体标记粘膜上皮（m）和单一粘膜下细胞(一). 与兔血清孵育后，单个粘膜下细胞被标记，表明这些细胞中IgG的非特异性结合（插入一). rP2Y孵化6抗体，已被免疫肽预吸收(b条). 免疫前血清孵育(c（c）).
P2Y的克隆1和P2Y6大鼠结肠隐窝受体。
基于上述药理数据，我们推测基底外侧P2Y的表达1和P2Y6大鼠结肠上皮细胞中的受体。用结肠隐窝细胞cDNA进行的RT-PCR实验表明这两种受体的表达（数据未显示）。随后，我们利用基于已发表序列的引物从结肠隐窝细胞的cDNA中克隆了这两个受体（参见方法）。P2Y的PCR产物1和P2Y6受体的预期长度分别为1160bp和999bp。克隆P2Y的测序1和P2Y6受体证实了上述和已发表序列的一致性（数据未显示）。
大鼠P2Y的异源表达1和P2Y6爪蟾卵母细胞中的受体。
UDP导致大鼠结肠粘膜cAMP刺激分泌明显激活的意外观察促使我们研究P2Y的信号转导机制1和P2Y6受体的详细信息。为此，我们在爪蟾卵母细胞，不表达内源性P2Y受体。P2Y的功能表达1和P2Y6细胞溶质钙的联合测量显示受体2+和全细胞电流。两种受体的激活导致[Ca升高2+]我.[Ca的上升2+]我由于钙的活化导致全细胞电流平行增加2+-活化Cl–P2Y中的通道1和P2Y6表达受体的卵母细胞（图;n个=5和n个= 3). 很明显，Ca2+-活化Cl–卵母细胞的电导密切反映了[Ca2+]我增加。核苷酸在水注入卵母细胞中的应用对胞浆钙无影响2+它也不影响整个细胞的电导(n个= 10).
[Ca的联合测量2+]我和全细胞电流爪蟾卵母细胞。上部痕迹：俄勒冈州绿色荧光强度作为[Ca的测量2+]我低迹线：使用双电极电压灯技术测量的全细胞电流（电压灯协议：分别为-30、-80、-40、+60 mV，持续1秒）。(一)ATP诱导[Ca平行增加2+]我表达P2Y的卵母细胞的全细胞电流1受体。(b条)在P2Y中6受体表达卵母细胞UDP升高2+]我和全细胞电流。
然后我们描述了ATP和UDP对P2Y受体表达卵母细胞全细胞电导的影响。在P2Y中1表达受体的卵母细胞ATP（10μM）导致整个电流快速短暂增加（图a） ●●●●。这些实验中计算的全细胞电导从3.0±0.52μS增加到63.08±6.79μS(n个=12）在电导增加的峰值。全细胞电导的生物物理特性揭示了一种向外整流的电流-电压关系，在氯的平衡电势附近有一个反转电势–（–30 mV；图c） 。卤化物电导序列为I–>英国–>氯离子–，这是内源性钙的特征2+-活化Cl–电导爪蟾卵母细胞（图、b和d）。同样，UDP增加了P2Y的整个细胞电导6受体表达卵母细胞从4.58±0.43μS到54.04±3.34μS(n个=17；图e） ●●●●。电流-电压关系和卤化物电导序列与P2Y非常相似1-表达卵母细胞（图，f–h）。
全电池导电性能爪蟾表达P2Y的卵母细胞1和P2Y6仅受体。第2页1: (一)ATP（10μM）诱导全细胞电流快速增加（钳制方案见图). (b条)卤化物电导序列从一(c（c）)ATP诱导的全细胞电导的电流-电压关系。(d日)卤化物电导序列实验总结。第2页6(e（电子）)UDP（10μM）诱导全细胞电流快速增加（箝位协议见图). (（f）)卤化物电导序列从e（电子）(克)UDP诱导的全细胞电导的电流-电压关系。(小时)卤化物电导序列实验总结。(我和j个)克隆P2Y受体的核苷酸选择性。(我)核苷酸诱导的P2Y电导增加1表达受体的卵母细胞。(j个)核苷酸诱导的P2Y电导增加6表达受体的卵母细胞。
为了测试嘌呤和嘧啶两种受体的选择性，我们在P2Y中应用了ATP和UDP（均为10μM）1-或P2Y6-表达卵母细胞。这些实验证实了公布的P2Y的ATP>>UDP选择性1P2Y受体和UDP>>ATP6接收器（图、i和j）。
P2Y的共表达1和P2Y6爪蟾卵母细胞CFTR受体。
为了监测细胞溶质cAMP浓度的动态变化，我们将CFTR与相应的P2Y受体共存。CFTR作为CI发挥作用–通道，已知被cAMP激活。CFTR Cl–电导和钙2+-活化Cl–电导可以通过不同的电流-电压关系和逆卤化物电导序列很容易区分。
图显示了一个卵母细胞表达P2Y的典型实验1受体和CFTR。在这些卵母细胞中，ATP还诱导内源性Cl快速增加–卤化物电导序列为I的电导–>英国–>氯离子–反映了[Ca的增加2+]我在ATP（10μM，n个= 17). 当用IBMX和forskolin（1 mM和2μM）处理这些共挤压卵母细胞时，它们显示出在未注射CFTR cRNA的卵母细胞中无法观察到的电导增加2+-活化Cl–电导CFTR Cl–电导具有线性电流-电压关系，卤化物电导顺序为Cl–>英国–>我–（图). IBMX/forskolin诱导的全细胞电导最大增加为55.2±8.2μS(n个= 17).
ATP和IBMX+forskolin对P2Y共存卵母细胞全细胞电导的影响1受体和CFTR（ATP 10μM，IBMX 1 mM，forskolin 2μM）。注意不同的卤化物电导顺序（ATP vs.IBMX+forskolin）。
P2Y的刺激6受体激活CFTR。
我们现在共存P2Y6卵母细胞中的受体和CFTR。假设P2Y的刺激6受体可能会增加cAMP，人们预计UDP会激活这些卵母细胞中的CFTR。事实上，UDP不仅增加了Ca2+-活化Cl–电导，但也导致了CFTR的激活。UDP（10μM）最初导致向外整流的卵母细胞Cl快速增加–电导随后随着电导的缓慢增加而呈线性电流-电压关系（图a） ●●●●。UDP诱导电导增加的较慢分量在6.1±0.2分钟后达到最大值(n个=18）。氯离子生物物理性质的比较–UDP和CFTR Cl诱导的电导–IBMX/forskolin诱导的电导表明卤化物电导序列和电流-电压关系是相同的（图，b–e）。这些数据表明P2Y的刺激6受体激活两种钙2+-活化Cl–电导和CFTR，一种cAMP调节的Cl–频道。
UDP和IBMX+forskolin对P2Y表达卵母细胞全细胞电导的影响6受体和CFTR（UDP 10μM，IBMX 1 mM，forskolin 2μM）。(一)典型实验的原始记录。UDP的应用导致电导快速瞬时增加，随后缓慢增加，类似于IBMX+forskolin诱导的效果。(b条)使用UDP和(c（c）)IBMX+forskolin。(d日)UDP感应和(e（电子）)IBMX+forskolin诱导电导。注意UDP处理的卵母细胞和IBMX+forskolin处理的卵卵母细胞的卤化物电导序列和电流-电压关系的相似性。
讨论
本研究证实结肠肠细胞表达基底外侧P2Y6与NaCl分泌持续激活相关的受体，其由cAMP和[Ca协同介导2+]我以前，基外侧P2Y1在大鼠结肠中发现了介导瞬时NaCl分泌的受体(6). 我们现在显示大鼠结肠中UDP刺激的NaCl分泌。因为UDP是众所周知的P2Y的特异性激动剂6受体(1)，我们假设大鼠结肠粘膜也表达该受体。这由许多独立参数证明：（a）UDP-induced small[Ca2+]我结肠隐窝隆起；（b） P2Y的识别6结肠隐窝受体mRNA；和（c）免疫组织化学显示P2Y的粘膜表达6结肠肠细胞中的受体。因此，与其他上皮组织一样，在同一组织中表达多种不同的P2受体(2，7).
除了这些新的结果，我们还注意到ATP刺激的NaCl分泌反应和UDP刺激的NaCl分泌反应之间存在着有趣的差异。如早期研究所述，P2Y1受体刺激导致短暂的NaCl分泌反应，具有典型的核苷酸效力等级顺序（2Me-S-ATP>ADP>ATP）(6). P2Y系列1-293B对介导分泌无影响。孤立结肠隐窝2+]我信号显示出与分泌反应密切的时间相关性，我们发现P2Y1受体刺激仅短暂激活基底外侧SK4通道以增加管腔Cl的驱动力–退出（我们未发表的观察）。
与之形成鲜明对比的是，UDP刺激的分泌总是持续的，这表明了不同的激活机制。有趣的是，293B可以完全抑制UDP刺激的分泌。该化合物特异性抑制基底外侧cAMP激活的KCNQ1/KCNE3 K+导致Cl完全阻塞的通道–结肠分泌物(14，19). 与结肠其他上皮细胞的KCNQ1通道相比，没有Ca的证据2+-KCNQ1/KCNE3的介导调节(19). 因此，这些结果表明结肠P2Y的激活6受体升高细胞溶质cAMP和[Ca2+]我激活分泌，而ATP诱导P2Y1受体激活刺激[钙2+]我-介导的分泌。结果表明，与PGE类似，这一假设得到了加强2，UDP也增加了结肠隐窝中的cAMP，而ATP则没有。核苷酸介导的气道上皮分泌刺激已被证明是通过钙间接发生的2+-前列腺素的依赖性自生和旁分泌生成(26). 因此，我们研究了UDP介导的NaCl分泌，也存在吲哚美辛。由于70%的UDP效应被超最大浓度的吲哚美辛抑制，我们的结果支持核苷酸受体介导的前列腺素释放的发现。前列腺素E2在结肠组织中被公认为有效的分泌激动剂(10). 因此，大部分UDP介导的Cl刺激–分泌显然是通过产生前列腺素和随后刺激上皮cAMP增加而发生的。与其他显示前列腺素释放来源于上皮细胞的上皮器官类似，我们认为结肠粘膜也存在类似现象(26，30). 然而，我们的结果并不排除除“直接”上皮效应外，其他上皮下细胞（例如免疫细胞）是否以“间接”方式参与观察到的UDP刺激的分泌。事实上，UDP介导的上皮下前列腺素生成可能是预期的，因为上皮下层已被证明是例如缓激肽刺激的PGE的主要位置2释放(31). 因此，P2Y6受体很可能在大鼠结肠粘膜下层表达。
然而，UDP介导的NaCl分泌反应中有很大一部分仍存在吲哚美辛。因此，我们推测UDP可能导致cAMP升高，这与前列腺素的作用无关。
我们选择了爪蟾卵母细胞表达系统进一步研究信号转导，因为这些细胞既不表达P2也不表达前列腺素受体。预期受体的异源表达爪蟾卵母细胞显示，这两种受体都与磷脂酶C结合，随后增加[Ca2+]我(32). 为了验证我们的假设，P2Y6受体可以升高cAMP，我们共同表达P2Y1或P2Y6受体和cAMP调节的CFTR Cl–频道。使用双电极电压钳监测核苷酸诱导的卵母细胞Cl–电流。我们在P2Y中发现1表达受体的卵母细胞ATP瞬时激活内源性钙2+-活化Cl–当前，但不是CFTR Cl–电流。与P2Y相比6表达受体的卵母细胞，UDP瞬时激活内源性钙2+-活化Cl–当前和随后的CFTR。CFTR分类–电流由其特征卤化物电导序列（Cl–>英国–>我–). UDP刺激6分钟后，它们可以明确区分，因为当时Ca2+-活化内源氯–电流已经恢复到接近静止值（见图b和e） ●●●●。因此，除了已知的P2Y耦合6钙受体2+]我，我们报告刺激该受体激活CFTR爪蟾卵母细胞。
综上所述，我们提供了来自两种实验制剂的证据，表明P2Y的刺激6受体导致cAMP调节的离子通道激活，即结肠粘膜中的KCNQ1/KCNE3和结肠黏膜中的CFTR爪蟾卵母细胞。
有趣的是，P2Y的激活1同一组织中的受体不会刺激这两个通道。因此，这些数据表明P2Y6受体刺激不同地引起两种制剂中cAMP的升高。此P2Y的机制6受体介导的cAMP升高尚不确定，需要进一步研究。G的直接双重耦合αq和Gαs最近报道了P2Y11CHO-K1细胞中表达的受体(33)，但在表达P2Y的细胞中未显示6受体(22). 除了直接耦合到G之外αs，其他信号事件可能导致cAMP增加。这些包括cAMP增加继发于[Ca2+]我-磷酸二酯酶或钙的介导抑制2+]我/PKC介导的腺苷酸环化酶激活(34，35). 在爪蟾P2Y激活卵母细胞CFTR6受体刺激表明cAMP升高。使用上述技术和基于染料的方法（FICRhR；Molecular Probes Inc.）直接测量卵母细胞cAMP的尝试失败。必须考虑是否通过P2Y激活CFTR6受体也可能通过激活PKC而发生，PKC被描述为cAMP介导CFTR激活的先决条件(36).
P2Y最近发现了一个有趣的病理生理学问题6受体。第2页6炎症肠道T细胞浸润区的受体显著上调，并参与单核细胞释放IL-8(36–38). 因此，它们在先天免疫防御反应中的作用是显而易见的，这可能也涉及肠壁的上皮层。众所周知，免疫细胞是核苷酸释放的来源(2). 因此推测P2Y6受体参与炎症性肠病的腹泻。
总之，我们描述了基底外侧P2Y的表达6大鼠结肠肠细胞中的受体。该受体的激活通过协同增加[Ca来刺激持续的NaCl分泌2+]我和cAMP。
致谢
我们感谢Helga Schauer、Anna Hopf和Gerlinde Kummer的专业技术援助。由Deutsche Forschungsgemeinschaft Le 942/4-1和丹麦医学研究委员会支持。
脚注
利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。
使用的非标准缩写：囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）；经皮电压（V时间); 经上皮阻力（R时间); 电压偏差（ΔV时间); 短路电流（I供应链); 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）；反-6-氰基-4-（N-乙基磺酰基-N-甲胺基）-3-羟基-2,2-二甲基-chromane（293B）；河豚毒素（TTX）。
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