加利福尼亚州²⁺内质网的浓度是神经酰胺诱导细胞凋亡的关键决定因素：Bcl-2作用的分子机制的意义

摘要

介绍

细胞凋亡，即允许多细胞生物在不引起炎症或组织损伤的情况下消除不必要或受损细胞的过程(亨加特纳和霍维茨，1994年;Hetts，1998年)发生在多种生理和病理条件下(Ellis等人，1991年;长田，1997年). 事实上，它可以在组织的发育和功能活动过程中消除sovrannumerary细胞，而其不适当的激活被认为是常见神经退行性疾病的基础(Nicotera等人，1999年;马特森，2000). 此外，在病毒性疾病和肿瘤中，其清除有害细胞的功效被特定的分子途径所规避。因此，毫不奇怪，最著名的致癌基因之一，Bcl-2，首先在淋巴瘤中发现，然后发现与许多人类癌症相关，将凋亡作为其主要靶点(Chao和Korsmeyer，1998年). 最近在实验肿瘤学方面的工作进一步强调了它的重要性，证明它是细胞凋亡机制的一个基本组成部分的同源物秀丽隐杆线虫它属于一个相关基因产品家族，包括具有相反调节作用的成员(Boise等人，1995年).

尽管人们对这种致癌基因有着广泛的兴趣和广泛的研究，但其作用机制仍存在争议。Bcl-2家族的各种成员（包括凋亡阻遏物，如Bcl-x，或激活物，如Bax）二聚并与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的辅因子相互作用，这是影响凋亡分子机制的明显途径(李和袁，1999). 然而，越来越多的证据表明，基于细胞内离子信号的改变，可能存在另一种机制。Bcl-2已被证明在分离的脂质双层中充当离子通道(明尼苏达州等., 1997;申德尔等., 1997)及其在细胞内细胞器的复杂分布[线粒体、内质网（ER）](Lithgow公司等., 1994)因此会影响离子在膜上的平衡。我们和其他小组的观察结果支持了这种可能性，即Bcl-2的重组表达改变了细胞内钙的充盈状态²⁺细胞钙的储存、动力学和振幅²⁺回应(林等., 1994;他等., 1997;郭等., 1998;福尤兹-优素福等., 2000;平通等., 2000). 特别是，最近的研究表明，重组表达的Bcl-2通过增加内质网膜的被动泄漏，降低内质网钙²⁺浓度（[Ca²⁺]_呃)稳态(福尤兹-优素福等., 2000;平通等., 2000). 因此，刺激依赖性[Ca²⁺]细胞质和线粒体中的增加都减少了，这是Ca致凋亡作用的明显靶点²⁺在这些条件下，储存依赖钙²⁺入口也显著减少，从而进一步降低Ca²⁺细胞的反应。

虽然有提示性，但这些结果并不能提供钙变化之间的决定性联系²⁺Bcl-2的信号传导和抗凋亡活性。这是当前论文的目的，在该论文中，我们研究了Bcl-2引起的钙信号改变是否足以防止神经酰胺（一种内源性凋亡脂质介质）引发的细胞死亡。因此，我们模仿/对抗了[Ca²⁺]Bcl-2通过不同实验方法引起的变化，验证了[Ca水平²⁺]_呃与这种凋亡刺激的效果呈负相关。

然后我们讨论了使这种信号改变具有保护作用的机制。我们发现神经酰胺诱导胞浆钙升高²⁺浓度（[Ca²⁺]_c（c）)通过释放Ca²⁺从细胞内储存和激活电容性钙²⁺进入途径。这些现象导致线粒体钙延长²⁺细胞器形态的积累和改变（肿胀和断裂）(Duchen，1999年).

本文讨论了一个模型，其中神经酰胺引起的死亡是这种脂质介质（或其代谢物）对线粒体的直接打击和钙的协同损伤效应的综合作用的结果²⁺细胞器积累。总的来说，目前的数据表明钙的消耗²⁺Bcl-2对细胞凋亡的保护作用的一个关键组成部分是从贮藏物中提取的。

结果

神经酰胺诱导的细胞凋亡通过降低细胞外钙来抑制²⁺浓度

将HeLa细胞接种在96个培养板中，并使其生长至～80%的汇合处。在此阶段，培养基从Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）+10%胎牛血清（FCS）改为改良的Krebs-Ringer缓冲液（KRB）（见材料和方法），37°C，5%CO₂大气。在新培养基中放置约4小时后，用10µM神经酰胺处理细胞。通过计数活细胞和透明细胞死亡细胞，通过相差显微镜在不同时间点评估细胞活力。图1A显示了一个具有代表性的微观场，这是从10个以上类似实验的分析中得出的。活细胞百分比显示在右上角；在整个盖玻片中（以及图中的代表区域），添加神经酰胺后16h，约90%的细胞死亡。神经酰胺处理（+Cer）细胞和对照细胞（对照）的比较表明，细胞死亡必须完全归因于神经酰胺的作用，其中死亡细胞的数量可以忽略不计。caspase活性的直接测量显示，神经酰胺处理的细胞显著增加（图1B） 证实了凋亡细胞死亡的形态学表现。为了支持这一观点，用50µM z-VAD（一种广谱半胱天冬酶抑制剂）对细胞进行预处理(尼科尔森，1999年)，神经酰胺处理后细胞存活率增加至74%±10(n个=5）（未显示）。

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图1。C类₂神经酰胺诱导细胞凋亡。(一个)HeLa细胞在添加1 mM Ca的KRB中保存²⁺（1 mM钙²⁺/KRB），并用10µM神经酰胺（+Cer）进行激发。16小时后用相差显微镜测定活细胞数。活细胞的百分比显示在右上角。神经酰胺诱导HeLa细胞caspase活化(B类). 细胞与神经酰胺孵育16 h，细胞裂解物的caspase-3样活性按照材料和方法中的详细说明进行测量，并表示为荧光任意单位。caspase抑制剂Ac-DEVD-CHO（inh.）也被用于显示caspase-3样活性的特异性。Bcl-2过表达保护细胞免受C₂神经酰胺诱导的细胞死亡(C类). HeLa细胞与Bcl-2和mtGFP表达质粒共转染。转染后36小时，细胞受到神经酰胺浓度增加（从0µM到20µM）的挑战，并通过活GFP表达细胞的显微镜计数评估生存能力（详情见正文）。单用mtGFP不影响细胞存活率。为了消除在将盖玻片转移到荧光显微镜室期间因死亡细胞脱落而可能出现的错误，评估了Bcl-2表达对细胞存活的影响，并表示为显微镜视野中荧光细胞的百分比。数据是至少重复五次实验的三次测定的平均值±SD。

之所以选择这种凋亡方案，是因为Bcl-2被认为能够高效地保护细胞免受神经酰胺及其代谢物诱导的死亡(张等., 1996;里波等., 2000). 为了获得这一概念的直接实验证据，在我们的实验条件下，用Bcl-2瞬时转染HeLa细胞，并用增加的神经酰胺浓度进行处理。然而，通过使用该方案，无法直接验证存活细胞是否为表达癌基因的细胞。为了直接解决这个问题，细胞被Bcl-2和mtGFP/pcDNAI（其中GFP是绿色荧光蛋白）联合转染，后者是编码荧光标记mtGFP的表达质粒(里祖托等.，1995年b). 转染后36 h，通过荧光显微镜观察mtGFP，鉴定转染细胞。如图所示1C、 Bcl-2过表达细胞的存活率提高。事实上，由于未过度表达Bcl-2的细胞死亡率较高，表达活GFP（因此Bcl-2）的细胞百分比随着神经酰胺浓度的增加而逐渐增加。当HeLa细胞单独转染mtGFP时，未观察到活荧光细胞百分比的变化，因为所有细胞（表达mtGFP的细胞和未转染的细胞）对凋亡剂同样敏感。

在之前的报告中，我们显示Bcl-2过度表达降低了[Ca²⁺]_呃我们假设，这种效应至少可以部分解释这种癌蛋白的抗凋亡作用(Pinton等人，2000年). 实验如图所示​图22–5旨在直接检验这一假设。在图形实验中2A和B，HeLa细胞保存在补充有[Ca的KRB溶液中²⁺]范围为1 mM（1 mM Ca²⁺/KRB）至20µM（20µM-Ca²⁺/KRB）。该程序导致稳态[Ca下降²⁺]_呃310µM（±87µM，n个=5）对于1 mM Ca²⁺/KRB至54µM（±15µM，n个=5）对于20µM Ca²⁺/KRB，用靶向绿松石嵌合体测量（详见材料和方法）。在这些条件下，10µM神经酰胺的疗效如图所示进行评估1A.图2A显示了在不同细胞外[Ca²⁺]（[钙²⁺]_{e（电子）}). 在每个图像中，[Ca²⁺]_{e（电子）}就业和[Ca²⁺]_呃获得的分别显示在右下角和左上角。图2B显示了在五个独立实验中对>50个场进行分析得到的平均值。神经酰胺处理后存活的细胞百分比与[Ca²⁺]培养基的浓度。神经酰胺在[Ca²⁺]_{e（电子）}约20µM，然后在40–50µM[Ca²⁺]_{e（电子）}当[Ca²⁺]_{e（电子）}接近生理值。

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图2。C类₂神经酰胺诱导的细胞死亡依赖于[Ca²⁺]_{e（电子）}（A和B）。细胞在添加不同[Ca的KRB中培养²⁺]_{e（电子）}并用10µM C处理₂神经酰胺。(一个)具有代表性的微观领域。左上角和右下角的插图报告[Ca²⁺]_呃和[Ca²⁺]_{e（电子）}每种情况下。(B类)在五个独立实验中，通过分析>50个区域（包括>500个细胞）获得的细胞存活率平均值。(C类)tBuBHQ模拟了[Ca的作用²⁺]_{e（电子）}细胞活力降低。细胞在1 mM Ca中培养²⁺/KRB和不同的[tBuBHQ]处理。细胞存活率按（B）进行评估。

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图5。过表达钙网蛋白的HeLa细胞对神经酰胺诱导的细胞死亡更敏感。用钙网蛋白表达质粒转染细胞，详见材料和方法。如图所示，通过可视化共表达mtGFP来鉴定转基因细胞1C.神经酰胺浓度如图所示1数据表示如图所示1C.实验至少重复五次。

细胞存活率的增加与凋亡的典型形态学特征（如染色质凝集）的消失平行。图三显示细胞核用碘化丙啶染色。对照细胞的细胞核显示正常、分散的染色质（图三A） ●●●●。图三B显示用1 mM Ca中的神经酰胺处理的细胞²⁺/吉尔吉斯斯坦共和国。核收缩在大多数细胞中都很明显。相反，当细胞保持在50µM Ca²⁺/KRB，神经酰胺治疗未引起核形态的重大改变（图三C） ●●●●。

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图3。C类₂神经酰胺诱导1 mM Ca中细胞的染色质凝聚和核收缩²⁺/KRB，但不在50µM Ca中²⁺/吉尔吉斯斯坦共和国。(一个)控制；(B类)1 mM钙²⁺/KRB+Cer；(C类)50µM钙²⁺/KRB+证书。图中显示了添加10µM神经酰胺后16小时所取的典型微观场。按照材料和方法中的规定，用100µM洋地黄素对细胞进行透化，并用1µM碘化丙啶对细胞核进行染色。

Bcl-2的抗凋亡作用被多种降低[Ca²⁺]_呃

[Ca中的变化²⁺]_{e（电子）}是一种相当粗糙但有效的降低[Ca²⁺]_呃.在保持[Ca²⁺]_{e（电子）}在生理水平上，是为了干扰钙²⁺ER泵（SERCA）。因此，用不同浓度的特异性SERCA阻滞剂叔丁基苯并对苯二酚（tBuBHQ）处理HeLa细胞(Kass等人，1989年). 通过这种方法，[Ca²⁺]_呃可以与抑制剂浓度成比例地降低。在图中所示的实验中2C、 用0.1至30µM的tBuBHQ浓度处理细胞，这会导致稳态[Ca降低²⁺]_呃268µM（±22µM，n个=5），直至ER几乎完全排空（<20µM，n个= 5). 添加tBuBHQ 30分钟后，用10µM神经酰胺处理细胞，16小时后评估细胞凋亡。有趣的是，对于[Ca²⁺]_呃与图中保护条件相当的减少量2A和B（即80µM±29[Ca²⁺]_呃用10µM tBuBHQ获得），细胞存活率显著提高。

根据这些结果，可以预计，活性钙的分子库的改变²⁺转运还应该改变细胞对神经酰胺诱导的死亡的易感性。特别是，最近有研究表明，质膜Ca的过度表达²⁺泵（PMCA）导致[Ca降低约20%²⁺]_呃在CHO细胞中(布里尼等., 2000). 在图形实验中4A、 用PMCA表达质粒转染HeLa细胞，并通过mtGFP共表达进行鉴定，如图所示1C.在这一阶段，通过增加神经酰胺浓度（从0到20µM）来启动凋亡过程，并在添加神经酰胺后16 h进行评估，与之前的实验相同。因此，如果泵过表达改变了细胞存活率，那么与单独转染GFP的平行对照组相比，活荧光细胞（共表达GFP和PMCA）的百分比应该增加。PMCA过度表达（图4A） 确实导致表达GFP的活细胞显著增加，从而表明[Ca²⁺]_呃低于正常值的水平会降低神经酰胺的作用。

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图4。PMCA过度表达增加，而SERCA过度表达降低细胞生存能力。用驱动重组PMCA的表达质粒转染HeLa细胞(一个)或SERCA(B类). 如图所示，通过可视化共表达mtGFP来鉴定转基因细胞1C.增加神经酰胺浓度（从0到20µM），并在16小时后评估细胞死亡。数据表示如图所示1C.实验至少重复五次。

神经酰胺对细胞钙的影响²⁺平衡

支持凋亡是由钙释放触发或增强的观点²⁺来自细胞内钙²⁺我们研究了神经酰胺是否对细胞内钙有直接影响²⁺平衡。为此，HeLa细胞被加载Ca²⁺指示器Fura-2/AM(格林基维茨等., 1985)然后转移到荧光计试管中。[加利福尼亚州²⁺]_c（c）使用基于Ca的算法从340/380荧光比率计算²⁺Fura-2的亲和力和荧光特性。用10µM神经酰胺处理引起[Ca²⁺]_c（c）海拔，随着时间的推移逐渐增加（图6A） ●●●●。这种改变对致凋亡脂质是特异性的，因为其类似物二氢酰胺不会引发细胞凋亡，对[Ca²⁺]_c（c）（图6B） ●●●●。对这些结果最简单的解释是神经酰胺导致钙的逐步释放²⁺从细胞内储存，从而直接导致[Ca²⁺]_c（c）升高和激活电容性钙²⁺这反过来又负责维持长时间的[Ca²⁺]_c（c）高原。图6C和D证实情况确实如此。在这些实验中，添加到EGTA/KRB中培养的细胞中的神经酰胺导致[Ca缓慢而短暂的增加²⁺]_c（c）由于钙几乎完全释放²⁺细胞内储存物的含量。事实上，以下添加的离子霉素使[Ca略有增加²⁺]_c（c）（图6C） 。相反，二氢神经酰胺对[Ca没有直接影响²⁺]_c（c）而加入离子霉素后，细胞内钙显著快速增加，从而证实细胞内钙²⁺非凋亡性脂质并未耗尽储存（图6D） ●●●●。当[Ca²⁺]_c（c）在转染细胞溶质绿原蛋白（未显示）的细胞中测量。

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图6。C类₂神经酰胺引起[Ca的时间依赖性升高²⁺]_c（c）HeLa细胞被钙负载²⁺指示剂Fura-2/AM和[Ca²⁺]_c（c）按照材料和方法中的详细说明测量变化。带有细胞的盖玻片保持在1 mM Ca中²⁺/韩国卢比(一个和B类)或在Ca中²⁺-自由0.5 mM EGTA/KRB(C类和D类). 如有指示，用10µM神经酰胺（+Cer）（A和C）或10µM二氢神经酰胺（DH-Cer）（B和D）攻击细胞。轨迹显示校准的[Ca²⁺]_c（c）值{Δ[Ca²⁺]为212±35 nM（A），20±15 nM（B），40±12 nM（C），6±4 nM（D）}。所示实验至少代表了五个类似的试验。离子霉素（Ionomycin）。

内质网下游：对线粒体的影响

Ca的目标²⁺-介导的信号必须位于内质网外，要么位于细胞质中，要么位于另一个亚细胞隔室中。鉴于线粒体在细胞凋亡过程中的调节作用，线粒体显然是研究的候选对象。事实上，在一个可能涉及高电导通道（通透性转换孔，PTP）开放的过程中(贝尔纳迪等., 1998;克朗普顿等., 1999;雅科托等., 1999)反映了生理刺激的凋亡紊乱(萨莱等., 1999)（见讨论），它们可以释放促凋亡因子，作为下游半胱天冬酶的共同激活剂(杨等., 1997;克鲁克等., 1999).

首先，我们验证了神经酰胺是否诱导线粒体[Ca²⁺]（[钙²⁺]_米)上升，与胞浆上升平行。为此，用线粒体靶向的绿松蛋白嵌合体（mtAEQ）转染HeLa细胞(里祖托等., 1992)，并在转染36 h后分析绿原蛋白发光，如材料和方法中所述。图7显示校准的[Ca²⁺]_米跟踪。神经酰胺治疗导致[Ca的延长增加²⁺]_米，具有缓慢的动力学。有趣的是，记录道噪音很大，可能反映了[Ca的异步增加²⁺]_米在不同的细胞群中（绿原蛋白信号是几千个细胞的平均值）。事实上，当[Ca²⁺]_c（c）在单细胞水平上分析，神经酰胺诱导的增加有点不同步（未显示）。这些结果以及图6表明ER Ca的缓慢释放²⁺与激动剂依赖的IP3受体开放相反，神经酰胺诱导的细胞内钙相对适度²⁺通过低亲和力线粒体摄取系统进行积累，但这种积累要维持几十分钟，即比典型的生理挑战要长得多。

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图7。C类₂神经酰胺诱导[Ca升高²⁺]_米用mtAEQ表达质粒转染HeLa细胞，并在转染后36小时进行分析。绿宝石发光的检测和[Ca的校准²⁺]值按照材料和方法中的描述执行。轨迹显示校准的[Ca²⁺]_米值（Δ[Ca²⁺]为0.48±0.12µM）。如有指示，用100µM C挑战细胞₂神经酰胺（使用更高浓度的神经酰胺，因为我们观察到通过塑料管进行灌注的效率很低，并且需要更高的神经酰胺浓度来激发生物效应，这一点通过监测细胞溶质[Ca²⁺]灌注流出物的凋亡效应的变化）。所示实验至少代表了五个类似的试验。

然后我们调查了[Ca²⁺]_米线粒体形态的改变与PTP开放相一致(佩蒂特等., 1998). 因此，用mtGFP转染HeLa细胞，并使用高分辨率数字成像系统评估细胞器结构(里祖托等.，1998年a). 图8显示了在显微镜台上保存盖玻片时相隔1小时拍摄的图像。在对照细胞（A和A′）中，相互连接的线粒体网络(里祖托等.，1998年b)尽管发生了一些运动和结构重排，但在这两幅图像中都可以看到。相反，神经酰胺治疗导致线粒体形态（B和B′）发生剧烈变化。事实上，虽然在添加神经酰胺后几分钟就可以检测到变化（未显示），但在凋亡激发后1小时拍摄的图像中可以很容易地观察到线粒体网络的完全断裂（另见插图中所示的图像放大）。因此，我们验证了是否降低了细胞质钙²⁺增加（即模拟Bcl-2效应）也可以阻止线粒体形态的变化。为此，进行了两组实验。在第一个（图8将转染mtGFP的HeLa细胞转移至50µM Ca²⁺/KRB，与高细胞存活率相关的剂量（见图2A和B），然后添加神经酰胺。在第二个实验中（图8D和D′），细胞维持在1 mM Ca²⁺/KRB并加载Ca²⁺螯合剂（与5µM BAPTA孵育30分钟），然后添加神经酰胺。在这两种情况下，神经酰胺的添加没有引起线粒体形态的明显改变。

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图8。C类₂神经酰胺诱导线粒体网络的早期形态变化，而线粒体网络受到细胞外钙降低的抑制²⁺或螯合细胞溶质钙²⁺用mtGFP转染HeLa细胞，并用10µM神经酰胺处理1小时。按照材料和方法中的规定，通过高分辨率数字成像系统显示mtGFP来评估线粒体结构。插图中显示了更大的图像放大倍数，以便更好地了解线粒体结构。(一个和一个'）控制；(B类和B类′）1 mM钙²⁺/KRB+Cer；(C类和C类′）40µM钙²⁺/KRB+cer；(D类和D类'）BAPTA+证书。（A–D）时间0；C后1小时（A′–D′）₂神经酰胺添加。

讨论

理解细胞凋亡的细胞内途径是目前生物医学研究的一个主要兴趣话题。人们早就知道，[Ca的无节制增加²⁺]_c（c）可以触发各种细胞类型的凋亡(李和袁，1999). 细胞[Ca控制性小幅增加对程序性细胞死亡的保护作用²⁺]也是众所周知的，尤其是神经元(伊科诺米杜等., 1999).

虽然这些观察结果表明钙在控制细胞生死中起着直接作用（有关综述，请参阅贝里奇等., 2000)在大多数情况下，Ca²⁺目标及其行动机制尚未确定。因此，细胞钙²⁺过载，ER Ca²⁺耗尽或严重的细胞溶质缓冲可能影响细胞质中发生的许多过程（例如蛋白酶钙蛋白酶或磷酸酶钙调神经磷酸酶的激活）(斯奎尔等., 1999;王等., 1999)或在细胞器内，例如核层粘连降解(奥伯哈默等., 1994;饶等., 1996)，DNA片段(潘迪等., 1994;沃克等., 1994)，转录因子NFAT的激活(斯里瓦斯塔瓦等., 1999)线粒体释放caspase辅因子(范德海登等., 1997)和ER中常驻半胱天冬酶的激活(中川等., 2000). 在之前的研究中，我们利用细胞器靶向的绿宝石嵌合体来证明Bcl-2增加被动钙²⁺从内质网泄漏，从而导致激动剂敏感性钙的部分排空²⁺商店(平通等., 2000). 因此，Ca²⁺细胞刺激后的释放显著减少，因此[Ca²⁺]细胞质和线粒体中出现的升高明显较小。在这里，我们讨论了细胞钙中这些Bcl-2依赖性改变是否²⁺处理与该癌基因的抗凋亡作用有因果关系。

作为凋亡刺激物，我们使用神经酰胺，一种由鞘磷脂水解产生的脂质介质(马蒂亚斯等., 1998;Hannun和Luberto，2000年)，因为其凋亡作用被Bcl-2抑制(里波等., 2000). 其作用机制尚不完全清楚，尽管很明显它本身并不活跃，但需要进一步转化为GD3神经节苷脂。该方法的基本原理如下：如果[Ca的减少²⁺]_呃由Bcl-2过度表达引起的是该癌基因启动的抗凋亡程序的一部分，预测是通过完全不同的方法模拟这种效果也应该模拟其对神经酰胺诱导死亡的保护作用。该假设的推论是钙超载²⁺内质网应激会加剧神经酰胺效应。用于模拟Bcl-2对钙的影响²⁺体内平衡我们遵循三种不同的概念方法，即（i）暴露于亚生理性细胞外[Ca]诱导的钙信号的整体减少²⁺]; （ii）选择性抑制SERCA；和（iii）重组改造分子库以激活钙²⁺挤压。与方法无关，实验条件降低了[Ca²⁺]_呃通过完全独立的手段，保护细胞免受神经酰胺的影响。这种效应对Bcl-2敏感的凋亡途径具有高度控制性和特异性。在前一方面，应注意大量[Ca²⁺]_呃消耗会增强而不是降低神经酰胺的功效（见图2). 在后一方面，其他刺激似乎不敏感（例如CD95/Fas/APO-1刺激；数据未显示）或显著增强[Ca²⁺]_呃消耗（例如，见原代肝细胞的自发凋亡；沙米等., 2001).

但“明智的”加州在哪里²⁺目标驻留？对这个问题最简单的回答是ER流明，这是一个最近描述了潜在靶点的位置。事实上，在凋亡细胞死亡的执行者中，caspase-12最近被证明位于内质网并被破坏内质网钙的因子激活²⁺体内平衡，如钙²⁺离子载体A23187或SERCA抑制剂thapsigargin。此外，caspase-12的缺失被证明对淀粉样β蛋白诱导的凋亡具有选择性保护作用，淀粉样β蛋白质是一种可能靶向内质网的因子(中川等., 2000). 然而，caspase-12被[Ca的减少激活²⁺]_呃而在这里，我们不仅表明该参数的降低可以保护细胞凋亡，而且SERCA的过度表达可以增强神经酰胺的凋亡作用。此外，钙网蛋白的过度表达导致ER-Ca总量的显著增加²⁺钙含量增加²⁺ER管腔的缓冲能力(巴斯蒂亚努托等., 1995;梅里等., 1996). 钙网蛋白过度表达的净效应是减少了无ER的[Ca²⁺]以及总释放钙量的增加²⁺，而[Ca²⁺]_呃要么保持不变，要么略有减少(约翰等., 1998). 如果靶点是caspase-12，则被Ca激活²⁺钙网蛋白的过度表达可能会增加神经酰胺处理细胞的存活率。与这一预期相反，钙网蛋白转染剂在神经酰胺治疗后显著降低生存率。这些最新数据证实并扩展了Michalak及其同事之前的一份报告，该报告表明钙网蛋白的过度表达增强了对凋亡的敏感性，而来自钙网蛋白敲除的细胞系则更具耐药性(中村等., 2000). 存在未知的ER-located抗凋亡药物，由[Ca]激活²⁺]_呃目前不能排除减排，但尚未提供证据证明其存在。

总的来说，对数据的最简单解释是，相关参数不是无ER的[Ca²⁺]，而是总ER Ca²⁺含量，因此“敏感”Ca²⁺靶点可能位于内质网外，即细胞质或另一亚细胞隔室，即线粒体中。现在很清楚，促凋亡因子（如细胞色素）释放到细胞质中c（c）、AIF和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2和-9）位于线粒体的膜间空间或其基质中，是细胞凋亡过程中的关键一步(Li等人，1997年;Yang等人，1997年;Susin等人，1999a，b条). 这种释放的机制仍有争议，可能涉及PTP，这是一种分子身份未知的高电导通道，可能导致线粒体肿胀和随后的外膜破裂。在这个过程中，Ca²⁺鉴于线粒体钙²⁺过载是PTP开放的有力刺激因素(Bernardi等人，1998年)线粒体的战略定位是对ER-Ca作出迅速反应²⁺释放(Rizzuto等人，1998年b;Csordas等人，1999年). 在一系列优雅的实验中，Hajnoczky及其同事证明了生理线粒体对钙的摄取²⁺由IP3产生的激动剂引起的细胞凋亡信号在神经酰胺的存在下可能通过PTP的开放(Szalai等人，1999年).

因此，上述所有实验均与受控ER-Ca的保护作用相一致²⁺抑制神经酰胺诱导的细胞凋亡。然而，一个明显的逻辑矛盾来自神经酰胺本身导致钙的急剧流失的证明²⁺我们认为矛盾只是显而易见的。事实上，所有导致[Ca²⁺]_呃在加入凋亡刺激物之前，即其净效应是减少钙的数量²⁺由神经酰胺释放。钙的释放²⁺相反，神经酰胺诱导的凋亡与凋亡刺激的启动同时发生。因此，可以提出一个“两次命中”的模型，类似于Hajnoczky及其同事提出的模型(萨莱等., 1999). 神经酰胺或其更好的代谢物可直接或间接损伤线粒体，但如果线粒体不同时暴露于升高的[Ca²⁺]。如果单独应用，两种刺激都不会影响线粒体。换言之，就神经酰胺诱导的细胞死亡而言，线粒体似乎起到了“巧合检测器”的作用，只有同时应用这两种信号才能转化为有效的凋亡触发信号。与这一解释一致，在神经酰胺诱导的细胞死亡过程的早期，观察到线粒体结构的显著改变，并通过降低[Ca²⁺]_呃类似地，[Ca的缓冲²⁺]_c（c）BAPTA不仅降低细胞质[Ca²⁺]线粒体形态和钙含量增加²⁺积累。我们寻求PTP参与这一过程的直接证据，但在我们的实验条件下，已知的PTP开放抑制剂环孢霉素A本身具有相当大的毒性（可能是由于其他细胞内效应，如钙调神经磷酸酶的抑制），并且很难评估对神经酰胺诱导的细胞死亡的保护作用。

总的来说，我们的结果强烈表明ER-Ca²⁺Bcl-2过度表达导致的细胞耗竭是该癌蛋白启动的抗凋亡程序的组成部分。事实上，模拟其对钙的影响²⁺处理导致经典的凋亡刺激物神经酰胺的功效降低。我们当然不能排除其他Bcl-2激活的抗凋亡途径的存在，但值得一提的是，这种癌蛋白的突变不与ER膜结合（因此推测不会减少[Ca]²⁺]_呃)抗凋亡作用大大降低。在一个综合模型中总结这项工作和以前报告的数据，可以提出一个“两次命中”假设。一方面，神经酰胺（或代谢物）同时驱动钙²⁺另一方面，神经酰胺代谢产物（即GD3神经节苷脂）与线粒体直接相互作用并干扰线粒体，从而改变其对其他生理事件的反应，如Ca²⁺吸收。在这种情况下，钙的Bcl-2依赖性改变的功效²⁺体内平衡并不奇怪。事实上，它不仅减少了依赖于IP3的钙释放²⁺通过长期的适应性现象，它抑制电容性钙²⁺这在很大程度上导致了[Ca的长期升高²⁺]_c（c）虽然有关所涉及的分子机制还有很多需要了解，但我们认为，对关键内源性调节因子（如Bcl-2）所使用的信号通路的澄清可能会提供新的见解和潜在的药理方法，以调节这一主要病理生理事件。

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