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.2005年2月23日；24（4）：705-16。
doi:10.1038/sj.emboj.7600566。 Epub 2005年2月3日。

PACS蛋白对TRPP2的转运代表了一种新的离子通道调控机制

迈克尔·科特根 1, 托马斯·本兴, 托马斯·西蒙, 罗伯特·陶伯, 比约恩·巴赫霍尔茨, 西尔万·费利西亚格利, 托拜厄斯·胡贝尔, 伯恩哈德·谢默, 阿尔布雷赫特·克拉默·扎克, 卡贾·霍普克尔, 卡蒂娅·卡明·西蒙, 克里斯托夫·卡尔·查克, 理查德·桑德福德, 艾米丽·金, 加里·托马斯, 格德·沃尔兹
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PACS蛋白对TRPP2的转运代表了一种新的离子通道调控机制

迈克尔·科特根等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

离子通道向质膜的转运受到严格控制，以确保细胞内离子稳态和信号转导的适当调节。多囊蛋白-2是阳离子通道TRP家族的一个成员，其突变会导致常染色体显性多囊肾病，这是一种以肾囊肿和进行性肾衰竭为特征的疾病。多囊藻毒素-2作为钙渗透性非选择性阳离子通道发挥作用；然而，多囊蛋白-2是否存在于质膜或内质网（ER）并发挥作用仍有争议。我们发现，多囊蛋白-2的亚细胞定位和功能是由磷酸呋喃酸性簇排序蛋白（PACS）-1和PACS-2指导的，这两个衔接蛋白识别多囊蛋白2羧基末端结构域中的酸性簇。与这些衔接蛋白的结合由蛋白激酶酪蛋白激酶2对多囊蛋白-2的磷酸化调节，这是多囊蛋白2在内质网、高尔基体和质膜室之间路由所必需的。我们认为多囊蛋白-2在内质网和质膜上分类并激活，这一范式与之前对其定位和功能的不一致观点相一致。此外，PACS蛋白可能代表了一种新的离子通道运输分子机制，将酸性簇离子通道导向不同的亚细胞隔室。

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数字

图1
图1
多囊蛋白-2的羧基末端结构域与PACS-1/γ-适应蛋白复合物相互作用。(A类)PACS-1与免疫球蛋白标签（Ig.PACS-1）融合，沉淀WT多囊蛋白-2(PKD2系列WT）。(B类)相同的PACS-1融合蛋白与含有多囊蛋白（F。PKD2系列681–968)，证明PACS-1识别多囊蛋白-2羧基末端结构域中的基序。(C类)重组HIS标记的PACS-1（HIS.PACS-1）furin结合区115–255)结合含有氨基酸741-871（GST）的重组GST标记的多囊蛋白-2片段。PKD2系列741–871)在体外（上面板）。HIS的负载相等。PACS-1号机组115–255通过考马斯蓝染色显示在下面板中。(D类)含有麦芽糖结合蛋白（MBP）（MBP.PACS-1）的重组PACS-1蛋白（氨基酸85–280）85–280)固定小鼠肾裂解物中的多囊蛋白-2，证明天然多囊蛋白2识别并结合PACS-1。(E类)COS M6肾细胞内源性多囊蛋白-2的免疫沉淀可固定PACS-1。(F类)使用多囊蛋白-2特异性抗血清，可以从COS M6肾细胞中共同免疫沉淀内源性γ-适应素，表明多囊蛋白2与AP1适配器复合物相关。
图2
图2
PACS-1和polycystin-2之间的相互作用是直接的，并且需要polycystin-2的S812的磷酸化才能有效结合。(A类)PACS-1的HIS标记的呋喃结合区（氨基酸115–255）将多囊蛋白-2的羧基末端氨基酸741–871与MBP融合。重组MBP-多囊蛋白-2融合蛋白（MBP）的磷酸化。PKD2系列741–871)导致结合力显著增加在体外考马斯蓝染色（下面板）显示，等量的HIS-PACS-1用于固定多囊蛋白-2融合蛋白。(B类)丝氨酸812突变为丙氨酸(PKD2系列S812A）或酸性簇的破坏(PKD2系列D815-817A），但丝氨酸812对天冬氨酸的突变不能消除多囊蛋白-2和PACS-1之间的相互作用。如图所示，瞬时转染HEK 293T细胞，沉淀WT或与sIg7标签融合的突变多囊蛋白-2的羧基末端结构域，以监测标记的PACS-1（氨基酸85–280）的结合。(C类)一种蛋白激酶CK2的特异性抑制剂DRB消除了免疫球蛋白标记的PACS-1和多囊蛋白-2标记的羧基末端之间的相互作用。将浓度为30μM的DRB添加到瞬时转染的HEK 293T细胞中4小时。免疫球蛋白。使用蛋白G从裂解液中沉淀PACS-1；用标记特异性M2抗体检测固定化多囊蛋白-2。(D类)DRB对多囊蛋白-1和多囊蛋白-2之间的相互作用没有影响。多囊蛋白-2的标记羧基末端（F.PKD2）与与sIg7标记融合的多囊蛋白-1的羧基末端相互作用。添加DRB对这种相互作用没有影响。
图3
图3
多囊蛋白-2的亚细胞定位。(A类)将融合到CD16胞外结构域和CD7跨膜结构域的多囊蛋白2羧基末端结构域的亚细胞定位与对照蛋白（CD16.7）或多囊蛋白-2突变体CD16.7进行比较PKD2系列S812A，CD16.7PKD2系列S812D和CD16.7PKD2型用异硫氰酸荧光素（FITC）结合的抗CD16抗体标记的瞬时转染COS M6细胞中的D815-17A。(B类)用未渗透细胞进行FACS分析，以确定CD16.7融合蛋白的表面表达。除了控制蛋白CD16.7外，只有CD16.7PKD2系列S812A和CD16.7PKD2系列D815-17A在细胞表面可检测到（黑色曲线，对照；红色曲线，转染细胞）。(C类)在瞬时转染的COS M6细胞中，使用polycystin-2特异性兔抗血清和FITC标记的抗兔抗血清测定全长polycystin-2或polycystin-2的S812A和D815-17A突变体的亚细胞定位。多囊藻毒素-2表现出典型的核周堆积，而多囊藻素-2 S812A和D815-17A突变呈现更分散的点状分布和一些膜染色。(D类)非渗透性极化MDCK细胞的表面标记。多囊藻毒素-2702–968含有细胞外Tac标签的细胞在用CK2的特异性抑制剂治疗（TBB，20μM，4 h）后转移到侧膜。
图4
图4
多囊蛋白-2的酸性簇影响爪蟾卵母细胞。(A类)电流测量(我)在注入水的卵母细胞中，PKD2系列重量，PKD2系列S812A，PKD2系列D812-817A和PKD2系列E787X。电压钳制在−100和+60 mV之间（增量为20 mV，持续1s）。(B类)电流-电压(我–V（V）)的关系PKD2系列WT和突变体。(C类)我–V（V）卵母细胞表达的关系PKD2系列S812A更换细胞外Cl后−通过葡萄糖酸盐。(D类)全细胞电导(G公司; 从−100到0 mV）测定注射水的卵母细胞(n个=49),PKD2型重量(n个=21),PKD2系列S812A型(n个=25),PKD2系列D815-817A型(n个=36）或PKD2系列E787X型(n个=12). 与PKD2系列WT，表示PKD2系列PACS-1结合基序被破坏的突变体显著增加了整个细胞的电导和(E类)膜电位去极化(V（V）米)注射卵母细胞（水n个=46,PKD2系列重量n个=19,PKD2系列S812A型n个=22,PKD2系列D815-817A型n个=35,PKD2系列E787X型n个=12). (F类)全细胞电导仍显著增加PKD2系列缺乏细胞外氯化物（Cl）的突变体−)（ND96-葡萄糖酸盐）(PKD2系列重量n个=23,PKD2系列S812A型n个=25，PKD2系列D815-817A型n个=35,PKD2系列E787X型n个=10). (G公司)镧（500μM）部分抑制注射PKD2型S812A型(n个=10). (H（H）)差异的相等表达PKD2系列通过Western blot证实全长构建物（每种情况下共用五个卵母细胞）。(我)表达卵母细胞的预孵育PKD2系列WT与特异性CK2抑制剂TBB（20μM，3-6 h）显著增加电导（ΔG公司)与TBB处理的水注入卵母细胞相比。星号表示具有统计意义对<0.05.
图5
图5
多囊蛋白-2的贩运和表面表达由PACS-1和PACS-2控制。(A类)多囊蛋白-2的羧基末端结构域与sIg7标签融合，从瞬时转染的HEK 293T细胞中沉淀HA-PACS-2（全长）。(B类)COS M6中内源性多囊蛋白-2的免疫沉淀可固定天然PACS-2。(C类)丝氨酸812突变为丙氨酸(PKD2系列S812A）或酸性簇突变(PKD2系列D815-817A），但丝氨酸812对天冬氨酸的突变不能消除多囊蛋白-2和PACS-2之间的相互作用。在瞬时转染的HEK 293T细胞中，使用WT的羧基末端结构域或融合到sIg7标签的突变多囊蛋白-2和HA-标记的PACS-2来测试相互作用。(D类)适配器共同免疫沉淀。HA标记的PACS-1、PACS-2、PACS-1admut或PACS-2admut用抗HA免疫沉淀。Western blot检测共免疫沉淀AP-1、AP-3和COPI。(E类)PACS-2与COPI相互作用的域映射。使用PACS-2的GST标记片段（显示氨基酸残基）从细胞裂解液中提取COPI（对照=GST，输入=初始裂解液的1%）。(F类)重组COPI、PACS-2和多囊蛋白-2之间形成三元复合物。固定GST-PKD2系列741–871PACS-2存在下S812D固定化β-COP37–179(G公司)Tac-polycysin-2定位于内质网。通过表达dn PACS-1蛋白对PACS-1功能的干扰不会改变多囊蛋白-2的亚细胞分布，而dn PACS-2蛋白的表达允许多囊蛋白2退出内质网并转移到高尔基体。(H（H）)采用荧光偏振法比较多囊蛋白-2与PACS-1、PACS-2或GGA3之间的亲和力。荧光标记的多囊蛋白-2磷酸肽RSFPRSLDDpSEEDDDSGHSSRRR来自多囊蛋白2的PACS结合位点，与不同的GST融合蛋白孵育，如图所示。上面的面板描述了多囊蛋白-2肽和各自融合蛋白之间的时间依赖性相互作用。在下面板中。将荧光素标记的多囊蛋白-2肽（66nM终浓度）加入到连续稀释的GST融合蛋白中以测定解离常数（kD）。(我)表达Tac-tagged polycystin-2的非渗透性细胞的表面标记。与对照组相比，单独使用dn PACS-1或dn PACS-2均不会增加多囊蛋白-2的表面表达。在随机选取的6个区域中，只有1±1个细胞单独表达多囊蛋白-2(n个=4），共表达dn PACS-1的2±1细胞为阳性(n个=2）和4±2细胞共表达dn PACS-2阳性(n个=2). 两种dn-PACS蛋白的共表达显著增加了多囊蛋白-2在26±5阳性细胞表面的表达(n个=4). (J型)注射xPACS-1或xPACS-2 siRNA对注水卵母细胞（灰色条）或表达多囊蛋白-2的卵母细胞的全细胞电导没有影响（黑色条）(n个=10). (K（K）)联合注射xPACS-1和xPACS-2 siRNA显著增加了表达多囊蛋白-2的卵母细胞的全细胞电导，而对水注射卵母细胞没有影响（灰色条：对照siRNA；黑色条：xPACS-1-siRNA）(n个=10).
图6
图6
PACS与其他离子通道的酸性簇相互作用。(A类)数据库搜索酸性簇离子通道。(B类)标记的TRPV41–486和TRPV4 WT(C类)与HA-标记的PACS-1交互。(D类)CLC-7型1–123融合到免疫球蛋白标签（sIg7.CLC-7）共同沉淀HA-标记的PACS-1。
图7
图7
多囊蛋白-2贩运模型。由CK2在丝氨酸812上磷酸化的多囊藻毒素-2（PKD2）与PACS-2/COPI结合，并从中间隔室（IC）返回内质隔室（ER）。PP2A对polycystin-2的脱磷作用从这种相互作用中释放polycystin-2，并促进其转运到质膜。PACS-1/AP-1介导多囊蛋白-2向高尔基体/TGN室的回收。
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