TRPP2通道通过钙调节细胞凋亡²⁺内质网中的浓度

TRPP2减少Cl⁻由ER-Ca激活的电流²⁺在中释放爪蟾卵母细胞

为了研究TRPP2的通道功能，我们在爪蟾在电压钳条件下监测卵母细胞的全细胞电流。TRPP2不影响全细胞稳态导电性能(图1A和B). 这与最近的研究报告一致，即在不同细胞类型中异源表达时，质膜上没有检测到TRPP2通道活性(陈等, 2001;科特根等, 2005).

测试TRPP2是否在细胞内发挥作用，从而调节Ca²⁺信号，我们测量了内源性钙²⁺-活化Cl⁻卵母细胞电流监测胞浆钙的动态变化²⁺浓度(科特根等, 2003). 用胰蛋白酶激活的外向整流钙刺激内源性G蛋白偶联受体²⁺-活化Cl⁻水注入对照卵母细胞中的电流(图1C和E). 然而，在表达TRPP2的卵母细胞中，这些Ca²⁺-活化Cl⁻电流大大减少(图1D和E). 在表达TRPP2的卵母细胞中，胰蛋白酶诱导的全细胞电导显著降低(图1F; 对照组：27.88±5.79μ，n个=9;TRPP2：6.47±1.42μS，n个=11). 胰蛋白酶受体爪蟾卵母细胞通过G传递信号_αq-磷脂酶C的蛋白介导活化导致IP_三-诱导钙释放²⁺从细胞内储存。因此，钙的振幅降低²⁺-活化Cl⁻TRPP2表达细胞中的电流可能是由于参与该信号级联的蛋白质的丰度或活性降低，或者是由于可释放游离钙的减少²⁺在ER Ca中²⁺商店。为了区分这些可能性，我们研究了TRPP2对钙的影响²⁺几种哺乳动物细胞系中的信号传递。

TRPP2定位于ER并减少Ca²⁺从细胞内储存释放

在人类胚胎肾（HEK）293细胞中表达的TRPP2的间接免疫荧光显示，该蛋白在细胞内呈网状分布，与BAP31.GFP共定位，是ER的标记物(图2A). 为了确定TRPP2在ER中的功能，我们测量了细胞溶质Ca²⁺浓度[Ca²⁺]_c（c）在HEK 293细胞中使用比率Ca²⁺成像。基底[Ca²⁺]_c（c）转染载体（对照）和表达TRPP2的细胞之间没有显著差异（分别为14.9±2.6 nM和14.3±2.4 nM，n个=9). 然而，用ATP刺激嘌呤能GPCR显示Ca的振幅显著降低²⁺表达TRPP2或Bcl-2的细胞信号(图2B和C; 对照组：183.31±17.75 nM，n个=9，TRPP2:92.39±8.79 nM，n个=9和Bcl-2:83.94±7.01 nM，n个=8). 由于这些实验是在细胞外Ca标称缺失的情况下进行的²⁺，胞浆Ca减少²⁺信号反映钙的减少²⁺从细胞内储存释放。我们证实，TRPP2在HEK 293细胞中的表达不会改变肌内质网钙的水平²⁺ATP酶（SERCA）和Bcl-2，这两种蛋白质早先被证明影响ER-Ca²⁺内容(平通等, 2001;Pinton和Rizzuto，2006年;图2D).

为了排除由于短暂过度表达的毒性而产生的细胞类型特异性效应和潜在人工制品，我们使用逆转录病毒基因转移（western blot，见图3A). 稳定表达TRPP2的HeLa细胞显示Ca显著减少²⁺G刺激后从细胞内储存释放_q个-耦合受体，确认来自爪蟾卵母细胞和HEK 293细胞(补充图1). 为了测试细胞溶质钙是否减少²⁺信号是由于GPCR信号通路中蛋白质的调节或钙的减少²⁺ER中的浓度（[Ca²⁺]_急诊室)，我们通过释放Ca绕过GPCR信号通路²⁺以受体依赖的方式从细胞内储存（在缺乏细胞外钙的情况下²⁺). thapsigargin对SERCA的抑制作用导致Ca的释放²⁺由于被动泄漏，从ER。As[钙²⁺]_急诊室确定Ca的驱动力²⁺释放，细胞溶质钙的振幅²⁺增加间接反映了ER Ca²⁺内容。与对照细胞相比，稳定表达TRPP2的HeLa细胞应用thapsigargin后的峰值振幅显著降低(图3B和D；对照：184.23±22.81 nM和TRPP2型：112.64±17.08牛顿米，n个=11). 同样，Ca²⁺在表达TRPP2的HEK 293细胞中，离子载体离子霉素诱导的细胞内储存释放减少(图3C和E；控制：2.27±0.35μM，以及TRPP2型：1.01±0.10μM，n个=9). 因此，我们的数据表明TRPP2在降低ER Ca方面的作用²⁺负载。内质网钙的急性减少²⁺浓度导致电容性钙活化²⁺流入，流入(霍弗等, 1998). 然而，以前的研究表明，ER-Ca的长期减少²⁺Bcl-2过表达水平下调电容性钙²⁺流入，流入(平通等, 2000). 我们研究了TRPP2表达对电容性钙的影响²⁺进入HEK 293细胞。在缺乏细胞外Ca的情况下，用thapsigargin耗尽储存物²⁺，在钙恢复后观察到电容性内流²⁺到镀液中。在表达TRPP2的细胞中，电容性钙²⁺进入被显著下调(补充图2)，添加到Bcl-2和TRPP2之间的功能相似性列表中。

TRPP2降低Ca²⁺ER中的浓度

细胞溶质钙的数据²⁺测量结果表明ER Ca降低²⁺浓度，但不提供实际[Ca²⁺]_急诊室为了证实表达TRPP2的细胞中ER钙浓度降低的证据，我们测量了[Ca²⁺]_急诊室直接使用基因编码的ER靶向Ca²⁺传感器（黄色Cameleon）(宫崎骏等, 1997). 钙网织蛋白信号肽和KDEL序列靶向低亲和力钙²⁺传感器YC4_急诊室与TRPP2同处的ER(图4A). Cameleon染料由青色荧光蛋白（CFP）、钙调素、肌球蛋白轻链激酶（M13）的钙调素结合域和黄色荧光蛋白（YFP）组成。钙²⁺钙调素与M13的结合诱导其分子内相互作用，从而提高CFP与YFP之间的荧光共振能量传递效率。因此，可以通过在440 nm处激发CFP并记录发射比535/480 nm的变化来观察钙结合(图4B). 我们直接测量了钙的稳态浓度²⁺通过校准比例荧光信号（单位：Ca²⁺-暴露于特定细胞外钙的渗透性'细胞（10μM离子霉素，0.5μg/ml洋地黄素）²⁺浓度(图4B). [加利福尼亚州²⁺]_急诊室在表达TRPP2的细胞中显著减少(图4B和C;对照：737.74±74.63μM，n个=16和TRPP2型：511.91±70.93μM，n个=18).

线粒体Ca减少²⁺信号

内质网和线粒体在物理和生理上是相互联系的(里祖托等, 1998). 钙²⁺从内质网释放的钙迅速被紧密并列的线粒体吸收。研究TRPP2对线粒体钙的影响²⁺活细胞中的动力学，一种针对线粒体的卡梅隆染料（YC4.1_米托)在HeLa细胞中表达(阿尔诺多等, 2001) (图4D). 表达TRPP2的细胞线粒体[Ca²⁺]用组胺（10μM，图4E和F)，反映了可释放Ca的减少量²⁺在ER中。

TRPP2敲除增加了可释放ER Ca的量²⁺

随后，我们研究了内源性TRPP2通道是否调节ER-Ca²⁺负荷，正如我们在TRPP2过度表达时观察到的。通过慢病毒基因转移，我们以四环素诱导的方式，生成了表达TRPP2定向（TRPP2敲除（kd））shRNA或非靶向shRNA（对照）盒的Madin–Darby犬肾上皮细胞（MDCK）多克隆系，每个细胞都结合了GFP标记。在含有5μg/ml四环素的培养基中培养TRPP2 kd细胞4天，导致TRPP2几乎完全失去表达(图5A和D). 相反，添加四环素后，对照细胞中的TRPP2水平未受影响。此外，GFP荧光信号的出现证明了shRNA盒在任一细胞系中的诱导表达(图5A). 分析在四环素存在下生长的细胞的胞浆钙²⁺使用Fura-2成像的响应。TRRP2-kd细胞具有显著较高的Ca振幅²⁺离子霉素刺激的瞬变(图5B)或ATP(图5C)表明TRPP2的耗竭增加了可释放Ca的量²⁺我们证实，在TRPP2缺失的细胞中，SERCA2和Bcl-2的稳态水平没有改变(图5D). 这些结果证实了我们之前通过TRPP2过度表达系统获得的结果。

接下来我们研究了TRPP2的耗竭是否影响钙²⁺通过SERCA或被动Ca泵入ER²⁺从这个细胞器泄漏。在有利于其在细胞内蓄积的条件下，用低亲和力钙指示剂Mag-Fura-2 AM负载细胞，并用洋地黄素使其质膜渗透(图5E，面板a）。在用含EGTA的缓冲液灌注细胞内储存物耗尽后，用钙重新填充储存物²⁺通过ATP和Mg激活的SERCA的作用²⁺ER-localized Mag-Fura-2的340/380荧光比率增加证明了这一点（图5E和F). Ca公司²⁺在应用ATP期间，储存物的负荷达到了稳定水平，但在用SERCA抑制剂环丙磺酸（CPA）取代ATP后，储存物负荷下降；图5F). 钙的计算速率²⁺对照组和TRPP2缺失细胞的被动渗漏与钙呈正相关²⁺CPA治疗开始时的水平(图5G)，而再充盈率和初始钙没有发现这种关系²⁺级别（未显示数据）。泄漏率对ER Ca的依赖性²⁺两个细胞群体的负荷可以拟合成具有显著不同斜率的线性回归线（对照细胞为0.0054，TRPP2kd细胞为0.0038；图5G). 此外，尽管TRPP2缺失细胞的平均泄漏率明显小于对照细胞，但它们的平均再填充率几乎相同。这些结果表明，TRPP2通道有助于钙的被动泄漏²⁺而ER又可能是可释放Ca量增加的原因²⁺在TRPP2缺失细胞中。

TRPP2敲除增强了对选择凋亡诱导物的敏感性

钙增加时²⁺内质网的负荷使细胞对某些刺激（如神经酰胺）产生凋亡反应(平通等, 2001)，我们分析了TRPP2-depleted（TRPP2-kd）细胞的凋亡进程，并通过测定caspase 3活性来控制MDCK细胞。用C处理细胞后，这种活性增加₂-神经酰胺具有时间和剂量依赖性，表明诱导细胞凋亡(图6A). 重要的是，使用20μM C₂-与对照细胞相比，神经酰胺9小时导致TRPP2kd细胞中caspase 3活性显著升高。神经酰胺处理的TRPP2 kd细胞的细胞质部分也因凋亡DNA断裂而含有较高水平的核小体(图6B). 相反，与对照细胞相比，TRPP2 kd细胞对转录抑制剂放线菌素D诱导的凋亡不敏感(图6C). 这些结果表明，TRPP2的缺失增强了细胞对凋亡刺激的敏感性，这些凋亡刺激参与ER-Ca²⁺网关，如神经酰胺(里祖托等, 2003)由于其ER Ca增加²⁺负载。我们的数据还表明，TRPP2 ER功能的缺乏可能是多囊肾细胞凋亡率增加的原因。

材料

TRPP公司前面描述了2个结构(科特根等, 2005). 质粒pLXSN由D Miller（华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心）善意提供。质粒pMD-G和pMD-gp是R Mulligan的恩赐。使用标准克隆技术生成用于cRNA合成的逆转录病毒转移载体pLXSN-TRPP2和psGEM-TRPP2。用于电生理和钙²⁺成像实验，无标签TRPP2型使用了构造。黄色骆驼由宫崎骏（YC4）提供_急诊室)和N Demaurex（YC4.1_米托) (宫崎骏等, 1997;阿尔诺多等, 2001). 对于击倒实验，犬只TRPP2型-靶向和对照shRNAs（序列可根据要求提供）被克隆到pLVTH载体（Addgene质粒12262）中。化学品来自Fluka、Sigma或Alexis生化公司。

细胞培养、转染、病毒生产和转导

HeLa、HEK-293和MDCK细胞在37°C下在补充有10%热灭活胎牛血清的DMEM中生长。用Fugene 6或磷酸钙转染细胞，转染后2-5天进行实验。用三种质粒（pMD-G、pMD-gp和逆转录病毒转移载体）共同转染HEK-293细胞，产生逆转录病毒。细胞在8μg/ml聚合物存在下被感染，并用500μg/ml基因素进行筛选。如前所述，通过慢病毒基因转移产生表达四环素阻遏物tTR-KRAB和shRNA盒的MDCK细胞(Wiznerowicz和Trono，2003年).

钙²⁺成像

HeLa和HEK 293细胞被镀在30 mm玻璃盖玻片上，并安装在倒置显微镜（蔡司，Axiover 200 M，Fluar×40/1.3油浸物镜）台上的灌注室中。在室温下用Fura-2 AM（分子探针；2μM）培养细胞30分钟，然后用改良的林格溶液（mM:145 NaCl，0.4 KH₂人事军官₄，1.6 K₂高性能操作₄，1氯化镁₂，1.3钙²⁺-葡萄糖酸盐，5葡萄糖；pH 7.4），持续10-20分钟。在标称钙缺乏的情况下使用药物和激动剂²⁺.钙²⁺-游离溶液（Ca²⁺-葡萄糖酸盐被5 mM EGTA替代）在触发钙离子前30 s灌流²⁺从细胞内储存释放。Fura-2在340 nm和380 nm处交替激发，并使用基于CCD的成像系统（Cool-SNAP fx，Roper Scientific Inc.）收集并记录在510 nm处过滤的荧光，该成像系统运行Metafluor软件（分子器件）。对于每个实验，记录5-10个细胞的信号，这些信号的平均值被称为一个独立的实验。Fura-2比率（340/380 nm）的校准按照以下所述进行格林基维茨等(1985). 用条件表达shRNA和GFP的MDCK细胞进行Fura-2成像的方法基本相同。然而，在这种情况下，分析中只包括具有预先确定的GFP信号中等和可比较强度的细胞（每次测量5-19个细胞）。

细胞内钙储备的再填充²⁺并对其在渗透性MDCK细胞中的泄漏进行了分析。将10μM Mag-Fur-2 AM（Biotium）在37°C的改良林格溶液中加载细胞1小时。用细胞内缓冲液（ICB；125 mM KCl，19 mM NaCl，10 mM HEPES，1 mM EGTA，pH 7.3）短时间灌注负载细胞，并用15μg/ml洋地黄素在ICB中渗透2–3分钟。该程序去除了Mag-Fura-2的胞质部分和大部分GFP荧光。随后用ICB清洗细胞13分钟，并用含有200 nM游离Ca的ICB清洗²⁺在含有200 nM游离钙的ICB中加入1.5 mM ATP（钠盐）或30μM CPA，持续2分钟²⁺和1.4 mM MgSO₄在每个实验结束时，用2μM离子霉素在ICB中灌注细胞，以计算最小340/380比率(R（右）₀). ER Ca的最大速率²⁺载荷和泄漏由R（右）/R（右）₀分别在6或10 s的时间跨度内计算。

[Ca的双发射比成像方法²⁺]骆驼的使用来源于宫崎骏等(1997). 使用激发过滤器和455DRLP二色镜（Chroma）在440±10 nm处激发细胞。使用滤轮（Ludl Electronic Products）交替更换两个发射滤光片（Chroma，480DF15和535DF25），在两个发射波长下对骆驼的荧光发射进行成像。荧光比率的变化R（右）=（535 nm处的荧光强度−535 nm处的背景强度）/（475 nm处的荧光强度−475 nm处的背景强度）如前所述进行校准(阿尔诺多等, 2001)，使用公式

哪里R（右）_最小值和R（右）_最大值是在没有钙的情况下获得的比率²⁺和饱和时[Ca²⁺]分别是。K（K）_d日是表观离解常数n个是Ca的希尔系数²⁺已获得的校准曲线就地(阿尔诺多等, 2001).

细胞凋亡分析

C诱导血清饥饿MDCK细胞凋亡₂-神经酰胺或放线菌素D。药物溶剂DMSO或乙醇（EtOH）用于对照治疗。在60μM荧光底物Ac-DEVD-AMC存在下测量细胞裂解液中的caspase 3样活性。在GeminiXS微孔板阅读器（分子器件）中，在380/460 nm的激发/发射波长下监测荧光增强45分钟。请注意，使用任一凋亡诱导剂处理的细胞中的活性不应相互比较，因为它们是在GeminiXS阅读器的不同单位上测量的。根据制造商的说明，使用Cell Death Detection ELISA Plus试剂盒（Roche）测量凋亡细胞胞质部分中的核小体数量，但不含BSA的裂解缓冲液用于测量裂解液中的总蛋白水平。

统计分析

数据以原始记录或平均值±标准误差表示(n个=实验次数，除非另有说明）。未配对学生t吨-使用适用的测试进行统计分析。一个P（P）-值<0.05表示具有统计学意义（用星号标记）。